Спектрофотометрия — это раздел электромагнитной спектроскопии, занимающийся количественным измерением свойств отражения или пропускания материала в зависимости от длины волны. [2] Спектрофотометрия использует фотометры , известные как спектрофотометры, которые могут измерять интенсивность светового луча на разных длинах волн. Хотя спектрофотометрия чаще всего применяется к ультрафиолетовому, видимому и инфракрасному излучению, современные спектрофотометры могут исследовать широкие полосы электромагнитного спектра , включая рентгеновские , ультрафиолетовые , видимые , инфракрасные и/или микроволновые длины волн.
Спектрофотометрия — это инструмент, который зависит от количественного анализа молекул в зависимости от того, сколько света поглощается окрашенными соединениями. Важными характеристиками спектрофотометров являются спектральная полоса пропускания (диапазон цветов, которые он может пропускать через тестовый образец), процент пропускания образца, логарифмический диапазон поглощения образца и иногда процент измерения отражательной способности.
Спектрофотометр обычно используется для измерения пропускания или отражения растворов, прозрачных или непрозрачных твердых тел, таких как полированное стекло, или газов. Хотя многие биохимические вещества окрашены, например, они поглощают видимый свет и, следовательно, могут быть измерены с помощью колориметрических процедур, даже бесцветные биохимические вещества часто могут быть преобразованы в окрашенные соединения, подходящие для хромогенных цветообразующих реакций, чтобы получить соединения, подходящие для колориметрического анализа. [3] : 65 Однако они также могут быть разработаны для измерения диффузии в любом из перечисленных диапазонов света, которые обычно охватывают около 200–2500 нм, с использованием различных элементов управления и калибровок . [2] В пределах этих диапазонов света необходимы калибровки на машине с использованием стандартов, которые различаются по типу в зависимости от длины волны фотометрического определения . [4]
Примером эксперимента, в котором используется спектрофотометрия, является определение константы равновесия раствора. Определенная химическая реакция в растворе может происходить в прямом и обратном направлении, где реагенты образуют продукты, а продукты распадаются на реагенты. В какой-то момент эта химическая реакция достигнет точки равновесия, называемой точкой равновесия. Чтобы определить соответствующие концентрации реагентов и продуктов в этой точке, светопропускание раствора можно проверить с помощью спектрофотометрии. Количество света, проходящего через раствор, указывает на концентрацию определенных химических веществ, которые не пропускают свет.
Поглощение света происходит из-за взаимодействия света с электронными и колебательными модами молекул. Каждый тип молекулы имеет индивидуальный набор энергетических уровней, связанных с составом ее химических связей и ядер, и, таким образом, будет поглощать свет определенных длин волн или энергий, что приводит к уникальным спектральным свойствам. [5] Это основано на ее определенном и отличном составе.
Использование спектрофотометров охватывает различные научные области, такие как физика , материаловедение , химия , биохимия , химическая инженерия и молекулярная биология . [6] Они широко используются во многих отраслях промышленности, включая полупроводники, лазерное и оптическое производство, печать и судебную экспертизу, а также в лабораториях для изучения химических веществ. Спектрофотометрия часто используется для измерения активности ферментов, определения концентраций белков, определения ферментативных кинетических констант и измерения реакций связывания лигандов. [3] : 65 В конечном итоге спектрофотометр способен определить, в зависимости от контроля или калибровки, какие вещества присутствуют в мишени и в каком количестве, посредством расчетов наблюдаемых длин волн.
В астрономии термин спектрофотометрия относится к измерению спектра небесного объекта , при котором шкала потока спектра калибруется как функция длины волны , обычно путем сравнения с наблюдением спектрофотометрической стандартной звезды, и корректируется с учетом поглощения света атмосферой Земли. [7]
Изобретенный Арнольдом О. Бекманом в 1940 году [ оспаривается – обсудить ] , спектрофотометр был создан с помощью его коллег из его компании National Technical Laboratories, основанной в 1935 году, которая впоследствии стала Beckman Instrument Company и в конечном итоге Beckman Coulter . Это стало решением проблемы ранее созданных спектрофотометров, которые не могли правильно поглощать ультрафиолет. Он начал с изобретения модели A, в которой для поглощения ультрафиолетового света использовалась стеклянная призма. Было обнаружено, что это не давало удовлетворительных результатов, поэтому в модели B произошел переход от стеклянной к кварцевой призме, что позволило добиться лучших результатов поглощения. Оттуда родилась модель C с корректировкой разрешения по длине волны, в результате чего было произведено три ее единицы. Последней и самой популярной моделью стала модель D, которая сейчас более известна как спектрофотометр DU , включавшая корпус прибора, водородную лампу с ультрафиолетовым континуумом и улучшенный монохроматор. [8] Он выпускался с 1941 по 1976 год, а его цена в 1941 году составляла 723 доллара США (аксессуары для дальнего УФ-излучения были опцией за дополнительную плату). По словам лауреата Нобелевской премии по химии Брюса Меррифилда , это был «вероятно, самый важный инструмент, когда-либо разработанный для продвижения биологической науки». [9]
После того, как его сняли с производства в 1976 году, [10] Hewlett-Packard создала первый коммерчески доступный диодный спектрофотометр в 1979 году, известный как HP 8450A. [11] Диодные спектрофотометры отличались от оригинального спектрофотометра, созданного Бекманом, тем, что это был первый однолучевой микропроцессорный спектрофотометр, который сканировал несколько длин волн одновременно за считанные секунды. Он облучает образец полихроматическим светом, который образец поглощает в зависимости от своих свойств. Затем он передается обратно с помощью решетки фотодиодной матрицы, которая обнаруживает область длин волн спектра. [12] С тех пор создание и внедрение спектрофотометрических устройств значительно возросло и стало одним из самых инновационных инструментов нашего времени.
Существует два основных класса устройств: однолучевые и двухлучевые. Двухлучевой спектрофотометр [13] сравнивает интенсивность света между двумя световыми путями, один из которых содержит эталонный образец, а другой — тестовый образец. Однолучевой спектрофотометр измеряет относительную интенсивность света луча до и после введения тестового образца. Хотя сравнительные измерения с помощью двухлучевых приборов проще и стабильнее, однолучевые приборы могут иметь больший динамический диапазон и оптически проще и компактнее. Кроме того, некоторые специализированные приборы, такие как спектрофотометры, встроенные в микроскопы или телескопы, являются однолучевыми приборами из-за практичности.
Исторически сложилось так, что спектрофотометры используют монохроматор , содержащий дифракционную решетку для получения аналитического спектра. Решетка может быть подвижной или фиксированной. Если используется один детектор, такой как фотоумножительная трубка или фотодиод , решетку можно сканировать пошагово (сканирующий спектрофотометр), так что детектор может измерять интенсивность света на каждой длине волны (которая будет соответствовать каждому «шагу»). Также могут использоваться матрицы детекторов (матрица спектрофотометра), такие как приборы с зарядовой связью (ПЗС) или фотодиодные матрицы (ФМА). В таких системах решетка фиксирована, а интенсивность каждой длины волны света измеряется другим детектором в матрице. Кроме того, большинство современных спектрофотометров среднего инфракрасного диапазона используют метод преобразования Фурье для получения спектральной информации. Этот метод называется инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье .
При проведении измерений пропускания спектрофотометр количественно сравнивает долю света, которая проходит через эталонный раствор и тестовый раствор, затем электронным способом сравнивает интенсивности двух сигналов и вычисляет процент пропускания образца по сравнению с эталонным стандартом. Для измерений отражения спектрофотометр количественно сравнивает долю света, которая отражается от эталонного и тестового образцов. Свет от исходной лампы пропускается через монохроматор, который дифрагирует свет в «радугу» длин волн через вращающуюся призму и выводит узкие полосы пропускания этого дифрагированного спектра через механическую щель на выходной стороне монохроматора. Эти полосы пропускания пропускаются через тестовый образец. Затем плотность потока фотонов (обычно в ваттах на квадратный метр) проходящего или отраженного света измеряется с помощью фотодиода, ПЗС или другого датчика света . Затем значение пропускания или отражения для каждой длины волны тестового образца сравнивается со значениями пропускания или отражения от эталонного образца. Большинство приборов применяют логарифмическую функцию к линейному коэффициенту пропускания для расчета «поглощающей способности» образца — значения, пропорционального «концентрации» измеряемого химического вещества.
Короче говоря, последовательность событий в сканирующем спектрофотометре выглядит следующим образом:
В матричном спектрофотометре последовательность следующая: [14]
Многие старые спектрофотометры должны быть откалиброваны с помощью процедуры, известной как «обнуление», чтобы сбалансировать нулевой выходной ток двух лучей на детекторе. Пропускание эталонного вещества устанавливается как базовое (базовое) значение, поэтому пропускание всех других веществ регистрируется относительно исходного «обнуленного» вещества. Затем спектрофотометр преобразует коэффициент пропускания в «поглощающую способность», концентрацию определенных компонентов тестового образца относительно исходного вещества. [6]
Вот некоторые распространенные типы спектрофотометров: УФ-видимый спектрофотометр: измеряет поглощение света в УФ и видимом диапазонах (200-800 нм). Используется для количественной оценки многих неорганических и органических соединений. 1. Инфракрасный спектрофотометр: измеряет поглощение инфракрасного света, позволяя идентифицировать химические связи и функциональные группы. 2. Атомно-абсорбционный спектрофотометр (ААС): использует поглощение света испаренными атомами аналита для определения концентраций металлов и металлоидов. 3. Флуоресцентный спектрофотометр: измеряет интенсивность флуоресцентного света, испускаемого образцами после возбуждения. Позволяет проводить высокочувствительный анализ образцов с собственной или индуцированной флуоресценцией. 4. Колориметр: простые спектрофотометры, используемые для измерения поглощения света для колориметрических анализов и тестов. [15]
Спектрофотометрия является важным методом, используемым во многих биохимических экспериментах, включающих выделение ДНК, РНК и белков, кинетику ферментов и биохимические анализы. [16] Поскольку образцы в этих приложениях не всегда доступны в больших количествах, они особенно подходят для анализа с помощью этого неразрушающего метода. Кроме того, ценный образец можно сохранить, используя платформу микрообъема, где для полного анализа требуется всего 1 мкл образца. [17] Краткое объяснение процедуры спектрофотометрии включает сравнение поглощательной способности пустого образца, который не содержит окрашенного соединения, с образцом, который содержит окрашенное соединение. Это окрашивание может быть достигнуто либо с помощью красителя, такого как краситель Coomassie Brilliant Blue G-250, измеренного при 595 нм, либо с помощью ферментативной реакции, как показано между β-галактозидазой и ONPG (делает образец желтым), измеренной при 420 нм. [3] : 21–119 Спектрофотометр используется для измерения окрашенных соединений в видимой области света (между 350 нм и 800 нм), [3] : 65 таким образом, его можно использовать для получения дополнительной информации об изучаемом веществе. В биохимических экспериментах выбирается химическое и/или физическое свойство, и используемая процедура является специфичной для этого свойства, чтобы получить больше информации об образце, такой как количество, чистота, активность фермента и т. д. Спектрофотометрию можно использовать для ряда методов, таких как определение оптимальной длины волны поглощения образцов, определение оптимального pH для поглощения образцов, определение концентраций неизвестных образцов и определение pKa различных образцов. [3] : 21–119 Спектрофотометрия также является полезным процессом для очистки белка [18] и может также использоваться в качестве метода для создания оптических анализов соединения. Спектрофотометрические данные также можно использовать в сочетании с уравнением Бера-Ламберта, для определения различных соотношений между пропусканием и концентрацией, а также поглощением и концентрацией. [3] : 21–119 Поскольку спектрофотометр измеряет длину волны соединения через его цвет, можно добавить связывающее краситель вещество, чтобы оно могло претерпеть изменение цвета и быть измерено. [19] Можно узнать концентрацию двухкомпонентной смеси, используя спектры поглощения стандартных растворов каждого компонента. Для этого необходимо знать коэффициент экстинкции этой смеси на двух длинах волн и коэффициенты экстинкции растворов, которые содержат известные веса двух компонентов. [20]В дополнение к традиционной модели закона Бера-Ламбертса может использоваться спектроскопия без меток на основе кювет, которая добавляет оптический фильтр на пути света, позволяя спектрофотометру количественно определять концентрацию, размер и показатель преломления образцов в соответствии с законом рук. [21] Спектрофотометры разрабатывались и совершенствовались на протяжении десятилетий и широко использовались химиками. Кроме того, спектрофотометры специализируются на измерении значений поглощения длины волны УФ- или видимого света. [3] : 21–119 Он считается высокоточным прибором, который также очень чувствителен и, следовательно, чрезвычайно точен, особенно при определении изменения цвета. [22] Этот метод также удобен для использования в лабораторных экспериментах, поскольку это недорогой и относительно простой процесс.
Большинство спектрофотометров используются в УФ- и видимой областях спектра, а некоторые из этих приборов также работают в ближней инфракрасной области. Концентрацию белка можно оценить, измерив OD при 280 нм из-за присутствия триптофана, тирозина и фенилаланина. Этот метод не очень точный, поскольку состав белков сильно различается, и белки, не содержащие ни одной из этих аминокислот, не имеют максимального поглощения при 280 нм. Загрязнение нуклеиновыми кислотами также может мешать. Для этого метода требуется спектрофотометр, способный проводить измерения в УФ-области с кварцевыми кюветами. [3] : 135
Ультрафиолетово-видимая (УФ-вид) спектроскопия включает энергетические уровни, которые возбуждают электронные переходы. Поглощение УФ-видимого света возбуждает молекулы, которые находятся в основных состояниях, в их возбужденные состояния. [5]
Видимая область 400–700 нм спектрофотометрия широко используется в колориметрической науке. Известно, что она работает лучше всего в диапазоне 0,2–0,8 OD. Производители чернил, типографии, поставщики текстиля и многие другие нуждаются в данных, предоставляемых посредством колориметрии. Они снимают показания в области каждых 5–20 нанометров вдоль видимой области и создают спектральную кривую отражения или поток данных для альтернативных презентаций. Эти кривые можно использовать для тестирования новой партии красителя, чтобы проверить, соответствует ли она спецификациям, например, стандартам печати ISO.
Традиционные спектрофотометры видимой области не могут определить, флуоресцирует ли краситель или базовый материал. Это может затруднить управление проблемами цвета, если, например, одна или несколько печатных красок являются флуоресцентными. Если краситель содержит флуоресценцию, используется биспектральный флуоресцентный спектрофотометр. Существуют две основные настройки для спектрофотометров визуального спектра: d/8 (сферическая) и 0/45. Названия обусловлены геометрией источника света, наблюдателя и внутренней части измерительной камеры. Ученые используют этот прибор для измерения количества соединений в образце. Если соединение более концентрировано, образец будет поглощать больше света; в небольших диапазонах выполняется закон Бера-Ламберта , и поглощение между образцами линейно изменяется в зависимости от концентрации. В случае измерений при печати обычно используются две альтернативные настройки — без/с УФ-фильтром для лучшего контроля эффекта УФ-осветлителей в бумажной массе.
Образцы обычно готовятся в кюветах ; в зависимости от интересующей области они могут быть изготовлены из стекла , пластика (видимая область спектра интереса) или кварца (дальняя УФ-область спектра интереса). Некоторые приложения требуют измерений малых объемов, которые могут быть выполнены с помощью микрообъемных платформ.
Как описано в разделе приложений, спектрофотометрию можно использовать как для качественного, так и для количественного анализа ДНК, РНК и белков. Можно использовать качественный анализ, а спектрофотометры используются для записи спектров соединений путем сканирования широких областей длин волн для определения свойств поглощения (интенсивности цвета) соединения на каждой длине волны. [5] Одним из экспериментов, который может продемонстрировать различные применения видимой спектрофотометрии, является отделение β-галактозидазы от смеси различных белков. В основном спектрофотометрию лучше всего использовать для количественной оценки степени очистки, которой подвергся ваш образец, относительно общей концентрации белка. С помощью аффинной хроматографии можно выделить и протестировать B-галактозидазу путем реакции собранных образцов с орто-нитрофенил-β-галактозидом (ONPG) и определения того, пожелтеет ли образец. [3] : 21–119 После этого тестирования образца при 420 нм на специфическое взаимодействие с ONPG и при 595 нм для анализа Брэдфорда можно количественно оценить степень очистки. [3] : 21–119 В дополнение к этому спектрофотометрию можно использовать в тандеме с другими методами, такими как электрофорез в SDS-Page, для очистки и выделения различных образцов белков.
Спектрофотометры, разработанные для инфракрасного диапазона, сильно отличаются из-за технических требований к измерениям в этом диапазоне. Одним из основных факторов является тип фотодатчиков, доступных для различных спектральных диапазонов, но инфракрасное измерение также является сложной задачей, поскольку практически все испускает ИК в виде теплового излучения, особенно на длинах волн свыше примерно 5 мкм.
Еще одна сложность заключается в том, что довольно много материалов, таких как стекло и пластик, поглощают инфракрасное излучение, что делает его несовместимым в качестве оптической среды. Идеальными оптическими материалами являются соли , которые не поглощают сильно. Образцы для ИК-спектрофотометрии можно размазать между двумя дисками бромида калия или измельчить с бромидом калия и спрессовать в таблетку. Если необходимо измерить водные растворы, для построения ячейки используется нерастворимый хлорид серебра .
Спектрорадиометры , которые работают почти как спектрофотометры видимого диапазона, предназначены для измерения спектральной плотности источников света. Приложения могут включать оценку и категоризацию освещения для продажи производителем или для подтверждения того, что лампа, которую они решили купить, соответствует их спецификациям. Компоненты:
