smURFP представляет собой гомодимер с максимумом поглощения и эмиссии 642 нм и 670 нм соответственно. Был создан тандемный димер smURFP (TDsmURFP), который имеет свойства, аналогичные smURFP. smURFP чрезвычайно стабилен: период полураспада при деградации белка составляет 17 часов и 33 часа без хромофора ( биливердина ) и с ним соответственно. Это сопоставимо с периодом полураспада белка усиленного зеленого флуоресцентного белка ( eGFP ) , полученного из медуз , составляющим 24 часа. [4] smURFP чрезвычайно фотостабилен и превосходит mCherry [5] и tdTomato [5] в живых клетках. Одномолекулярные smURFP излучают в два раза больше фотонов перед фотообесцвечиванием, чем низкомолекулярные красители AlexaFluor647 и Cyanine5. [6] Коэффициент экстинкции (180 000 М -1 см -1 ) smURFP чрезвычайно велик и имеет скромный квантовый выход (0,18), что делает его биофизическую яркость сравнимой с eGFP и примерно в 2 раза ярче, чем у большинства красных или далеко красные флуоресцентные белки, полученные из кораллов . smURFP имеет самое большое двухфотонное сечение среди флуоресцентных белков . Имеются два пиковых сечения 1060 и 60 GM при 820 и 1196 нм соответственно. [7] Несмотря на то, что они являются гомодимерами, все протестированные N- и C-концевые слияния демонстрируют правильную клеточную локализацию, включая сложное слияние с α-тубулином и ламином B1 ( рис .). [1] smURFP назван в честь Смурфиков из-за его светло-голубого цвета в белом свете. [1]
Таблицу Excel со спектрами поглощения, возбуждения и испускания smURFP можно скачать здесь. Кристаллическая структура smURFP (PDB: 7UQA) была определена и использована для понимания направленной эволюции . smURFP также сравнивали с родительским α-аллофикоцианином . [8] Кристаллическая структура мутанта smURFP ( PDB : 6FZN ) была опубликована в Fuenzalida-Werner et al. [9] У мутантов наблюдаются значительно большие карманы хромофора и объем белка, что приводит к уменьшению квантового выхода. [10] В обзоре 2020 года обсуждаются недавние применения smURFP в качестве генетически кодируемого или экзогенного зонда для визуализации in vivo , а также обсуждаются проблемы с доступностью биливердина . [11]
На изображении показаны E. coli , экспрессирующие smURFP, осаждение E. coli , удаление среды, лизис E. coli , связывание smURFP с NiNTA, элюирование smURFP и замена буфера.
smURFP используется в качестве наночастиц, экзогенных зондов и анализов in vitro.
Свободный smURFP, очищенный белок, не кодируемый генетически, может быть инкапсулирован в вирусы и использован для неинвазивной флуоресцентной визуализации биораспределения у живых мышей. [14] [15] [16]
smURFP ковалентно присоединяет биливердин , вызывая флуоресценцию , и по своей сути является сенсором биливердина . Исследователи показали, что очищенный smURFP имеет предел обнаружения биливердина в сыворотке человека 0,4 нМ . [17] smURFP позволяет создавать анализы in vitro для выявления активности ферментов . Разработан анализ на тромбин с диапазоном обнаружения 1,07–0,01 мМ и пределом обнаружения 0,2 мМ. [18]
Тандемный димер smURFP (TDsmURFP) использовался в качестве экзогенного флуоресцентного маркера для мечения семитрансмембранного рецептора Smoothened ( SMO ). TDsmURFP был очищен из E. coli и присоединен к SMO посредством конъюгации, опосредованной сортазой , для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS) . [19] Эта новая экзогенная флуоресцентная маркировка белков позволяет избежать скрининга нескольких мест вставки белка, органических растворителей и химических реакций, которые неправильно сворачивают, инактивируют или разрушают белки.
smURFP представляет собой самомаркирующийся белок.
Маленький ультракрасный флуоресцентный белок (smURFP) представляет собой самомаркирующийся белок. Субстрат флюорогенен, флуоресцирует при прикреплении и гасит флуоресцентный груз. Тег smURFP [20] обладает новыми свойствами для разработки инструментов.
Маленький ультракрасный флуоресцентный белок (smURFP) представляет собой самомаркирующийся белок, подобный Halo- , SNAP- и CLIP -меткам. smURFP-метка принимает субстрат биливердина , модифицированный карбоксилатом с линкером полиэтиленгликоля (ПЭГ) к карго-молекуле. В отличие от меток Halo-, SNAP- и CLIP, в которых субстрат используется только для ковалентного прикрепления молекулы-груза, биливердин является флюорогенным , и флуоресценция включается при ковалентном присоединении к smURFP-метке, что позволяет отслеживать флуоресценцию в дальнем красном диапазоне. грузовой молекулы в живых клетках. Биливердин также гасит грузы флуоресцеина , что позволяет проводить визуализацию без удаления субстрата. Модификация биливердина по одному карбоксилату создает нейтральную молекулу, которая проходит через внешнюю и ядерную мембрану клеток млекопитающих . [21]
Доступность хромофора в клетках и мышах
smURFP был генетически слит с человеческим ламином B1, чтобы показать флуоресцентную ядерную оболочку. Локализация белка ламина B1 меняется на разных фазах клеточного цикла.
Свободный хромофор можно отличить от хромофора , прикрепленного к smURFP, с помощью флуоресцентной визуализации времени жизни ( FLIM ) в живых клетках. Свободный диметиловый эфир биливердина (BVMe2) имеет время жизни флуоресценции 0,586 нс, тогда как BVMe2, прикрепленный к smURFP, имеет время жизни флуоресценции 1,27 нс . [22]
smURFP, экспрессируемый в культуре нейронов, не демонстрирует агрегации в лизосомах, что наблюдалось в случае флуоресцентного белка mCherry .
Диметиловый эфир биливердина, биливердин и фикоцианобилин коммерчески доступны от Frontier Scientific. Диметиловый эфир биливердина, биливердин или фикоцианобилин растворяют в ДМСО в концентрации 5 мМ. Раствор очень темный, поэтому энергично пипетируйте его, чтобы убедиться, что все растворилось. Диметиловый эфир биливердина не растворяется в обычных буферах , включая фосфатно-солевой буфер (PBS) или сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS). Добавьте 1-5 мкм диметилового эфира биливердина в среду или буфер, содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Добавьте 25 мкм биливердина (не в качестве мембранопроницаемого) к клеткам . Биливердин не насыщает сайты smURFP и не достигает максимальной интенсивности флуоресценции. Диметиловый эфир биливердина следует использовать для получения максимальной интенсивности флуоресценции. Инкубируйте smURFP с хромофором как можно дольше, чтобы увеличить накопление белка, вызванное повышенной стабильностью белка с хромофором . Оставьте хромофор минимум на 3 часа, рекомендуется на 24 часа. Удалить хромофор , промыть средой, содержащей 10% FBS , и получить изображение в среде без фенолового красного или буфера для визуализации .
smURFP генетически закодированные биосенсоры
FUCCI в дальнем красном и ближнем инфракрасном диапазоне визуализирует рождение многоядерной клетки, что характерно для многих раковых клеток.
Киназный датчик FRET . smURFP является полезным акцептором для многих красных флуоресцентных белков из-за спектрального перекрытия. Рационально разработанный красный флуоресцентный белок stagRFP позволяет упростить создание датчиков FRET . stagRFP является полезным донором FRET для дальнего красного акцептора smURFP, и был создан репортер FRET киназы ERK со средним ответом ~ 15%. Новый сенсор позволил одновременно визуализировать три киназы, Src , Akt , ERK , в одной клетке . [24]
Флуоресцентная визуализация клеточного цикла . Новаторская работа Ацуши Мияваки и его коллег разработала флуоресцентный индикатор клеточного цикла на основе убиквитинирования (FUCCI), который позволяет флуоресцентно визуализировать клеточный цикл. Первоначально зеленый флуоресцентный белок mAG был слит с hGem (1/110), а оранжевый флуоресцентный белок (mKO 2 ) был слит с hCdt1 (30/120). Обратите внимание, что эти слияния представляют собой фрагменты, которые содержат сигнал ядерной локализации и сайты убиквитинирования для деградации , но не являются функциональными белками. Зеленый флуоресцентный белок образуется во время фаз S, G2 или M и разлагается во время фаз G0 или G1 , тогда как оранжевый флуоресцентный белок образуется во время фаз G0 или G1 и разрушается во время S, G2 . , или М-фаза. [25] FUCCI в дальнем красном и ближнем инфракрасном диапазоне был разработан с использованием флуоресцентного белка , полученного из цианобактерий (smURFP) и флуоресцентного белка, полученного из бактериофитохрома (фильм можно найти по этой ссылке). [1]
smURFP (голубой), экспрессируемый в E. coli .
Рекомендации
^ abcd Родригес, Эрик А.; Тран, Джеральдин Н.; Гросс, Ларри А.; Крисп, Джессика Л.; Шу, Сяокунь; Лин, Джон Ю.; Цянь, Роджер Ю. (01 августа 2016 г.). «Дальний красный флуоресцентный белок произошел из цианобактериального фикобилипротеина». Природные методы . 13 (9): 763–9. дои : 10.1038/nmeth.3935. ISSN 1548-7105. ПМК 5007177 . ПМИД 27479328.
^ Патент США 20180201655A1, Родригес, Эрик А.; Тран, Джеральдин Н. и Лин, Джон Ю. и др., «Развитые мечущие белки альфа-субъединицы аллофикоцианина (smURFP)», выпущено 10 декабря 2019 г.
^ Мэттсон, Сара; Тран, Джеральдин Н.; Родригес, Эрик А. (2023), Шарма, Маянк (ред.), «Направленная эволюция флуоресцентных белков в бактериях», Fluorescent Proteins , vol. 2564, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer US, стр. 75–97, номер документа : 10.1007/978-1-0716-2667-2_4, ISBN.978-1-0716-2666-5, PMID 36107338 , получено 16 сентября 2022 г.
^ Стек, Дж. Х.; Уитни, М.; Родемс, С.М.; Поллок, Б.А. (1 декабря 2000 г.). «Система маркировки на основе убиквитина для контролируемой модуляции стабильности белка». Природная биотехнология . 18 (12): 1298–1302. дои : 10.1038/82422. ISSN 1087-0156. PMID 11101811. S2CID 23741831.
^ abc Шанер, Натан С.; Кэмпбелл, Роберт Э.; Штайнбах, Пол А.; Гипманс, Бен Н.Г.; Палмер, Эми Э.; Цянь, Роджер Ю. (1 декабря 2004 г.). «Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.». Природная биотехнология . 22 (12): 1567–1572. дои : 10.1038/nbt1037. ISSN 1087-0156. PMID 15558047. S2CID 205272166.
^ Маити, Атану; Буффало, Космо З.; Саураб, Саумья; Монтесинос-Франхола, Фелипе; Хачи, Джастин С.; Конлон, Уильям Дж.; Тран, Джеральдин Н.; Хасан, Бакар; Уолтерс, Кайли Дж.; Дробижев Михаил; Мёрнер, МЫ; Гош, Парфо; Мацуо, Хироши; Цянь, Роджер Ю.; Лин, Джон Ю. (12 июля 2023 г.). «Структурная и фотофизическая характеристика небольшого ультракрасного флуоресцентного белка». Природные коммуникации . 14 (1): 4155. doi : 10.1038/s41467-023-39776-9. ISSN 2041-1723. ПМЦ 10338489 .
^ Маити, Атану; Буффало, Космо З.; Саураб, Саумья; Монтесинос-Франхола, Фелипе; Хачи, Джастин С.; Конлон, Уильям Дж.; Тран, Джеральдин Н.; Хасан, Бакар; Уолтерс, Кайли Дж.; Дробижев Михаил; Мёрнер, МЫ; Гош, Парфо; Мацуо, Хироши; Цянь, Роджер Ю.; Лин, Джон Ю. (12 июля 2023 г.). «Структурная и фотофизическая характеристика небольшого ультракрасного флуоресцентного белка». Природные коммуникации . 14 (1): 4155. doi : 10.1038/s41467-023-39776-9. ISSN 2041-1723. ПМЦ 10338489 .
^ Маити, Атану; Буффало, Космо З.; Саураб, Саумья; Монтесинос-Франхола, Фелипе; Хачи, Джастин С.; Конлон, Уильям Дж.; Тран, Джеральдин Н.; Хасан, Бакар; Уолтерс, Кайли Дж.; Дробижев Михаил; Мёрнер, МЫ; Гош, Парфо; Мацуо, Хироши; Цянь, Роджер Ю.; Лин, Джон Ю. (12 июля 2023 г.). «Структурная и фотофизическая характеристика небольшого ультракрасного флуоресцентного белка». Природные коммуникации . 14 (1): 4155. doi : 10.1038/s41467-023-39776-9. ISSN 2041-1723. ПМЦ 10338489 .
^ Фуэнсалида-Вернер, JP; Яновский, Р; Мишра, К; Вайденфельд, Я; Ниссинг, Д; Нциахристос, В; Стил, AC (декабрь 2018 г.). «Кристаллическая структура связанного с биливердином фикобилипротеина: взаимозависимость олигомеризации и хромофорилирования». Журнал структурной биологии . 204 (3): 519–522. дои : 10.1016/j.jsb.2018.09.013. PMID 30287387. S2CID 52919137.
^ Маити, Атану; Буффало, Космо З.; Саураб, Саумья; Монтесинос-Франхола, Фелипе; Хачи, Джастин С.; Конлон, Уильям Дж.; Тран, Джеральдин Н.; Хасан, Бакар; Уолтерс, Кайли Дж.; Дробижев Михаил; Мёрнер, МЫ; Гош, Парфо; Мацуо, Хироши; Цянь, Роджер Ю.; Лин, Джон Ю. (12 июля 2023 г.). «Структурная и фотофизическая характеристика небольшого ультракрасного флуоресцентного белка». Природные коммуникации . 14 (1): 4155. doi : 10.1038/s41467-023-39776-9. ISSN 2041-1723. ПМЦ 10338489 .
^ Монтесинос-Франхола, Фелипе; Лин, Джон Ю.; Родригес, Эрик А. (16 ноября 2020 г.). «Флуоресцентные белки для визуализации in vivo, где биливердин?». Труды Биохимического общества . 48 (6): 2657–2667. дои : 10.1042/BST20200444. ISSN 0300-5127. PMID 33196077. S2CID 226971864.
^ Ан, Фейфей; Чен, Нанди; Конлон, Уильям Дж.; Хачи, Джастин С.; Синь, Цзинци; Арас, Омер; Родригес, Эрик А.; Тинг, Ричард (февраль 2020 г.). «Маленькие ультракрасные наночастицы флуоресцентного белка как экзогенные зонды для неинвазивной визуализации опухолей in vivo». Международный журнал биологических макромолекул . 153 : 100–106. doi : 10.1016/j.ijbiomac.2020.02.253. ПМЦ 7493049 . ПМИД 32105698.
^ Альмогбил, Ханаа Х.; Монтесинос-Франхола, Фелипе; Дашинский, Камилла; Конлон, Уильям Дж.; Хачи, Джастин С.; Корацца, Джаванна; Родригес, Эрик А.; Здерич, Весна (01 августа 2022 г.). «Терапевтический ультразвук для местной доставки макромолекул в роговицу». Трансляционное видение, наука и технология . 11 (8): 23. дои : 10.1167/tvst.11.8.23 . ISSN 2164-2591. ПМЦ 9424970 . PMID 35998058. S2CID 251743679.
^ Герберт, Фабиан С.; Бролин, Оливия; Гэлбрейт, Тайлер; Бенджамин, Кэндис; Рейес, Сезар А.; Лузуриага, Майкл А.; Шахриваркевишахи, Арезу; Гассенсмит, Джеремия Дж. (03 апреля 2020 г.). «Супрамолекулярная инкапсуляция небольших ультракрасных флуоресцентных белков в вирусоподобные наночастицы для неинвазивных агентов визуализации in vivo». doi : 10.26434/chemrxiv.12067851.v1. S2CID 216595590.{{cite journal}}: Требуется цитировать журнал |journal=( помощь )
^ Герберт, Фабиан С.; Бролин, Оливия Р.; Гэлбрейт, Тайлер; Бенджамин, Кэндис; Рейес, Сезар А.; Лузуриага, Майкл А.; Шахриваркевишахи, Арезу; Гассенсмит, Джеремия Дж. (07 мая 2020 г.). «Супрамолекулярная инкапсуляция малых ультракрасных флуоресцентных белков в вирусоподобные наночастицы для неинвазивных агентов визуализации in vivo». Биоконъюгатная химия . 31 (5): 1529–1536. doi : 10.1021/acs.bioconjchem.0c00190. ISSN 1043-1802. ПМИД 32343135.
^ Траши, Икеда; Дурбач, Матеуш З.; Траши, Орикеда; Виджесундара, Ялини Х.; Эрман, Райан Н.; Чиев, Алисса С.; Дарвин, Кэри Б.; Герберт, Фабиан К.; Гадхви, Джашкаран; Ниско, Николь Дж. Де; Нильсен, Стивен О.; Гассенсмит, Джеремия Дж. (25 апреля 2023 г.). «Самосборка флуоресцентной вирусоподобной частицы для визуализации тканей с высокой автофлуоресценцией». Журнал химии материалов Б. дои : 10.1039/D3TB00469D. ISSN 2050-7518.