В биохимии семейство ферментов ДНК -метилтрансферазы ( ДНК-МТазы , DNMT ) катализирует перенос метильной группы в ДНК . Метилирование ДНК выполняет широкий спектр биологических функций. Все известные ДНК-метилтрансферазы используют S-аденозилметионин (SAM) в качестве донора метильной группы.
МТазы можно разделить на три различные группы на основе химических реакций, которые они катализируют:
Метилтрансферазы m6A и m4C обнаружены в основном у прокариот (хотя недавние данные свидетельствуют о том, что m6A широко распространен у эукариот [1] ). Метилтрансферазы m5C обнаружены у некоторых низших эукариот, у большинства высших растений и у животных, начиная с иглокожих .
Метилтрансферазы m6A (N-6 аденин-специфическая ДНК-метилаза) (A-Mtase) — это ферменты , которые специфически метилируют аминогруппу в положении C-6 аденинов в ДНК. Они встречаются в трех существующих типах бактериальных систем рестрикции-модификации (в системе типа I A-Mtase является продуктом гена hsdM, а в типе III — продуктом гена mod). Эти ферменты отвечают за метилирование определенных последовательностей ДНК , чтобы не допустить переваривания хозяином собственного генома с помощью его рестриктаз . Эти метилазы имеют ту же специфичность последовательности , что и соответствующие им рестриктазы. Эти ферменты содержат консервативный мотив Asp / Asn - Pro -Pro- Tyr / Phe в своем N-концевом участке, этот консервативный участок может быть вовлечен в связывание субстрата или в каталитическую активность. [2] [3] [ 4] [5] Структура N6-MTase TaqI ( M.TaqI ) была разрешена до 2,4 А. Молекула сворачивается в 2 домена, N-концевой каталитический домен, который содержит каталитические и кофакторные сайты связывания и включает центральный 9-цепочечный бета-лист, окруженный 5 спиралями; и C-концевой домен распознавания ДНК, который образован 4 небольшими бета-листами и 8 альфа-спиралями . N- и C-концевые домены образуют щель, вмещающую субстрат ДНК . [6] Была предложена классификация N-MTases, основанная на расположении консервативных мотивов (CM). [5] Согласно этой классификации, N6-MTases, которые имеют мотив DPPY (CM II), расположенный после мотива FxGxG (CM I), обозначаются как N6-адениновые MTases класса D12. Система рестрикции и модификации типа I состоит из трех полипептидов R, M и S. Субъединицы M (hsdM) и S вместе образуют метилтрансферазу , которая метилирует два остатка аденина в комплементарных цепях двудольной последовательности распознавания ДНК . В присутствии субъединицы R комплекс может также действовать как эндонуклеаза , связываясь с той же целевой последовательностью , но разрезая ДНК на некотором расстоянии от этого сайта. Разрезается ли ДНК или модифицируется, зависит от состояния метилирования целевой последовательности . Когда целевой сайт не модифицирован, ДНК разрезается. Когда целевой сайт полуметилирован, комплекс действует как поддерживающая метилтрансфераза, модифицируя ДНК так, что обе цепи становятся метилированными . hsdM содержит альфа-спиральный домен на N-конце , N-концевой домен HsdM. [7]
Среди метилтрансфераз m6A (N-6 аденин-специфическая ДНК-метилаза) есть группа сиротских МТаз, которые не участвуют в бактериальной системе рестрикции/метилирования. [8] Эти ферменты играют регуляторную роль в экспрессии генов и регуляции клеточного цикла. EcoDam из E. coli [9] и CcrM из Caulobacter crescentus [10] являются хорошо охарактеризованными членами этого семейства. Совсем недавно было показано, что CamA из Clostridioides difficile играет ключевые функциональные роли в споруляции , образовании биопленки и адаптации хозяина. [11]
Метилтрансферазы m4C (N-4 цитозин-специфические ДНК-метилазы) — это ферменты , которые специфически метилируют аминогруппу в положении C-4 цитозинов в ДНК. [5] Такие ферменты встречаются в качестве компонентов систем рестрикции-модификации типа II у прокариот . Такие ферменты распознают определенную последовательность в ДНК и метилируют цитозин в этой последовательности . Этим действием они защищают ДНК от расщепления ферментами рестрикции типа II, которые распознают ту же последовательность [ требуется ссылка ]
Метилтрансферазы m5C (специфическая для цитозина ДНК-метилаза C-5) (C5 Mtase) — это ферменты, которые специфически метилируют углерод C-5 цитозинов в ДНК для получения C5-метилцитозина . [12] [13] [14] В клетках млекопитающих специфичные для цитозина метилтрансферазы метилируют определенные последовательности CpG , которые, как полагают , модулируют экспрессию генов и дифференциацию клеток . У бактерий эти ферменты являются компонентом систем рестрикции-модификации и служат ценными инструментами для манипуляции ДНК. [13] [15] Структура метилтрансферазы HhaI (M.HhaI) была разрешена до 2,5 A : молекула сворачивается в 2 домена — более крупный каталитический домен, содержащий каталитические и кофакторные сайты связывания, и меньший домен распознавания ДНК. [16]
Сообщалось о высококонсервативных ДНК-метилтрансферазах типов m4C, m5C и m6A [17] , которые представляются перспективными целями для разработки новых эпигенетических ингибиторов для борьбы с бактериальной вирулентностью, устойчивостью к антибиотикам и другими биомедицинскими приложениями.
Метилтрансферазы de novo распознают что-то в ДНК, что позволяет им заново метилировать цитозины. Они экспрессируются в основном на ранних стадиях развития эмбриона и устанавливают схему метилирования. Метилтрансферазы de novo также активны, когда клетка, реагирующая на сигнал, такая как нейрон , должна изменить экспрессию белка. [18] Например, когда условно-рефлекторное состояние страха создает новую память у крысы, 9,17% генов в геноме нейрона гиппокампа крысы дифференциально метилированы. [19]
Поддерживающие метилтрансферазы добавляют метилирование к ДНК, когда одна из цепей уже метилирована. Они работают на протяжении всей жизни организма, поддерживая схему метилирования, которая была установлена de novo метилтрансферазами. [ необходима цитата ]
По крайней мере четыре ДНК-метилтрансферазы с разной активностью были идентифицированы у млекопитающих. Они называются DNMT1 , [20] две изоформы, транскрибированные с гена DNMT3a : DNMT3a1 и DNMT3a2, [21] и DNMT3b . [22] Недавно был обнаружен еще один фермент DNMT3c, специфически экспрессируемый в мужской зародышевой линии у мышей. [23]
Манзо и др. [24] наблюдали различия в геномном связывании DNMT3a1, DNMT3a2 и DNMT3b. Они обнаружили 3970 областей, исключительно обогащенных для DNMT3a1, 3838 исключительно обогащенных для DNMT3a2 и 3432 исключительно обогащенных для DNMT3b.
Ферменты DNMT регулируются не только в своих метилирующих местах на геноме тем, где они связываются с ДНК, [24] , но они также регулируются посттрансляционными модификациями гистоновых белков нуклеосом, вокруг которых обернута геномная ДНК (см. рисунки). Роуз и Клозе [25] рассмотрели связь между метилированием ДНК и метилированием лизина гистонов . Например, они указали, что H3K4me3, по-видимому , блокирует метилирование ДНК, в то время как H3K9me3 играет роль в содействии метилированию ДНК.
DNMT3L [26] — это белок, тесно связанный по структуре с DNMT3a и DNMT3b и имеющий решающее значение для метилирования ДНК, но, по-видимому, сам по себе неактивен.
DNMT1 является наиболее распространенной ДНК-метилтрансферазой в клетках млекопитающих и считается ключевой поддерживающей метилтрансферазой у млекопитающих . Она преимущественно метилирует полуметилированные динуклеотиды CpG в геноме млекопитающих. Мотив распознавания для человеческого фермента включает только три основания в паре динуклеотидов CpG: C на одной нити и CpG на другой. Это смягченное требование к субстратной специфичности позволяет ему метилировать необычные структуры, такие как промежуточные продукты проскальзывания ДНК, со скоростями de novo, которые равны его скорости поддержания. [27] Как и другие ДНК-цитозин-5-метилтрансферазы, человеческий фермент распознает вывернутые цитозины в двухцепочечной ДНК и действует по механизму нуклеофильной атаки. [28] В раковых клетках человека DNMT1 отвечает как за de novo , так и за поддерживающее метилирование генов-супрессоров опухолей. [29] [30] Длина фермента составляет около 1620 аминокислот . Первые 1100 аминокислот составляют регуляторный домен фермента, а остальные остатки составляют каталитический домен. Они соединены повторами Gly - Lys . Оба домена необходимы для каталитической функции DNMT1. [ необходима цитата ]
DNMT1 имеет несколько изоформ : соматическую DNMT1, вариант сплайсинга (DNMT1b) и ооцит -специфическую изоформу (DNMT1o). DNMT1o синтезируется и хранится в цитоплазме ооцита и транслоцируется в ядро клетки во время раннего эмбрионального развития, в то время как соматическая DNMT1 всегда находится в ядре соматической ткани. [ необходима цитата ]
Эмбриональные стволовые клетки с нулевым мутантом DNMT1 были жизнеспособны и содержали небольшой процент метилированной ДНК и метилтрансферазной активности. Эмбрионы мышей, гомозиготные по делеции в Dnmt1, умирают на 10–11 день беременности. [31]
Хотя этот фермент имеет сильное сходство последовательностей с 5-метилцитозинметилтрансферазами как прокариот, так и эукариот, в 2006 году было показано, что фермент метилирует положение 38 в РНК-переносчике аспарагиновой кислоты и не метилирует ДНК. [32] Название этой метилтрансферазы было изменено с DNMT2 на TRDMT1 (тРНК аспарагиновая кислота метилтрансфераза 1), чтобы лучше отразить ее биологическую функцию. [33] TRDMT1 является первой РНК цитозинметилтрансферазой, идентифицированной в клетках человека.
DNMT3 — это семейство ДНК -метилтрансфераз, которые могут метилировать полуметилированные и неметилированные CpG с одинаковой скоростью. Архитектура ферментов DNMT3 похожа на архитектуру DNMT1, с регуляторной областью, прикрепленной к каталитическому домену. Существует по крайней мере пять членов семейства DNMT3: DNMT3a1, DNMT3a2, 3b, 3c и 3L. [ необходима цитата ]
DNMT3a1, DNMT3a2 и DNMT3b могут опосредовать метилирование участков CpG в промоторах генов, что приводит к репрессии генов . Эти ДНК-метилтрансферазы также могут метилировать участки CpG в кодирующих областях генов, где такое метилирование может усиливать транскрипцию генов. [34] Работа с DNMT3a1 показала, что он преимущественно локализуется на островах CpG, бивалентно маркированных H3K4me3 (маркер, способствующий транскрипции) и H3K27me3 (маркер, подавляющий транскрипцию), совпадающих с промоторами многих факторов транскрипции . Работа с DNMT3a2 в нейронах показала, что изменения метилирования ДНК, вызванные DNMT3a2, преимущественно происходят в межгенных и интронных областях. Считалось, что эти межгенные и интронные метилирования ДНК, вероятно, регулируют активность энхансера , альтернативный сплайсинг или экспрессию некодирующих РНК . [35]
DNMT3a1 может совместно локализоваться с гетерохроматиновым белком (HP1) и метил-CpG-связывающим белком (MeCBP), среди ряда других факторов. [36] Они также могут взаимодействовать с DNMT1, что может быть кооперативным событием во время метилирования ДНК. DNMT3a предпочитает метилирование CpG метилированию CpA, CpT и CpC, хотя, по-видимому, существует некоторая предпочтительность последовательности метилирования для DNMT3a и DNMT3b. DNMT3a метилирует сайты CpG со скоростью, намного меньшей, чем DNMT1, но большей, чем DNMT3b.
Экспрессия DNMT3a2 отличается от DNMT3a1 и DNMT3b, поскольку экспрессия DNMT3a2 происходит по схеме немедленного раннего гена . DNMT3a2 индуцируется для экспрессии в нейронах, например, новой нейронной активностью. [37] [35] Это может иметь значение для установления долговременной памяти . [38] У крысы высокие уровни новых метилирований ДНК в нейронах гиппокампа происходят после того, как крысе навязывается памятное событие, такое как контекстное условно-рефлекторное страх . [19] Байрактар и Крейц [39] обнаружили , что ингибиторы DNMT, примененные в мозге, предотвращают формирование долговременных воспоминаний.
DNMT3L содержит мотивы ДНК-метилтрансферазы и необходим для установления материнских геномных импринтов , несмотря на то, что он каталитически неактивен. DNMT3L экспрессируется во время гаметогенеза , когда происходит геномный импринтинг . Потеря DNMT3L приводит к биаллельной экспрессии генов, которые обычно не экспрессируются материнским аллелем. DNMT3L взаимодействует с DNMT3a и DNMT3b и локализуется в ядре. Хотя DNMT3L, по-видимому, не способен к метилированию , он может участвовать в репрессии транскрипции .
Из-за эпигенетических эффектов семейства DNMT некоторые ингибиторы DNMT исследуются для лечения некоторых видов рака: [40]