stringtranslate.com

Комагатэлла

Komagataella — это метилотрофные дрожжи в порядке Saccharomycetales . Они были обнаружены в 1960-х годах как Pichia pastoris , с их особенностью использования метанола в качестве источника углерода и энергии. [2] В 1995 году P. pastoris был переназначен в единственного представителя рода Komagataella , став Komagataella phaffii . [3] Более поздние исследования дополнительно выделили новые виды в этом роде, в результате чего в общей сложности было признано 7 видов. [4] Нередко можно увидеть старое название, все еще используемое в контексте производства белка, по состоянию на 2023 год; [5] в менее формальном использовании дрожжи могут ошибочно называться pichia .

После многих лет изучения Komagataella широко используется в биохимических исследованиях и биотехнологических отраслях . Имея большой потенциал для использования в качестве системы экспрессии для производства белка , а также в качестве модельного организма для генетических исследований, Komagataella phaffii стала важной для биологических исследований и биотехнологических приложений. [1] [5]

Таксономия

По данным ГБИФ : [4]

Комагатэллав природе

Естественная среда обитания

В природе Komagataella встречается на деревьях, таких как каштаны . [7] Они являются гетеротрофами и могут использовать несколько источников углерода для жизни, таких как глюкоза , глицерин и метанол . [8] Однако они не могут использовать лактозу .

Репродукция

Komagataella может подвергаться как бесполому, так и половому размножению, почкованием и аскоспорами . [9] В этом случае существуют два типа клеток Komagataella : гаплоидные и диплоидные клетки. В бесполом жизненном цикле гаплоидные клетки подвергаются митозу для размножения. В половом жизненном цикле диплоидные клетки подвергаются споруляции и мейозу . [10] Скорость роста ее колоний может варьироваться в большом диапазоне, от почти 0 до времени удвоения в один час, что подходит для промышленных процессов. [11]

Комагатэллакак модельный организм

За последние несколько лет Komagataella была исследована и идентифицирована как хороший модельный организм с несколькими преимуществами. Прежде всего, Komagataella можно легко выращивать и использовать в лабораторных условиях. Как и другие широко используемые модели дрожжей, она имеет относительно короткую продолжительность жизни и быстрое время регенерации. Более того, были разработаны некоторые недорогие питательные среды, так что Komagataella может быстро расти на них с высокой плотностью клеток. [12] Было проведено полное секвенирование генома Komagataella . Геном K. phaffii GS115 был секвенирован Фландрийским институтом биотехнологии и Гентским университетом и опубликован в Nature Biotechnology . [13] Последовательность генома и аннотацию гена можно просматривать через систему ORCAE. Полные геномные данные позволяют ученым идентифицировать гомологичные белки и эволюционные связи между другими видами дрожжей и Komagataella . Кроме того, все семь видов были секвенированы к 2022 году. [7] Кроме того, Komagataella — это отдельные эукариотические клетки, что означает, что исследователи могут исследовать белки внутри Komagataella . Затем можно будет провести гомологичное сравнение с другими более сложными эукариотическими видами, чтобы получить их функции и происхождение. [14]

Еще одним преимуществом Komagataella является его сходство с хорошо изученной моделью дрожжей — Saccharomyces cerevisiae . Как модельный организм для биологии, S. cerevisiae хорошо изучались в течение десятилетий и использовались исследователями для различных целей на протяжении всей истории. Два рода дрожжей; Pichia ( sensu lato ) и Saccharomyces , имеют схожие условия роста и толерантности; таким образом, культура Komagataella может быть принята лабораториями без многих модификаций. [15] Более того, в отличие от S. cerevisiae , Komagataella обладает способностью функционально обрабатывать белки с большой молекулярной массой, что полезно в трансляционном хозяине. [16] Учитывая все преимущества, Komagataella может быть полезно использована как в качестве генетического, так и экспериментального модельного организма.

Комагатэллакак генетический модельный организм

Как генетический модельный организм, Komagataella может быть использована для генетического анализа и крупномасштабного генетического скрещивания с полными данными генома и его способностью выполнять сложную эукариотическую генетическую обработку в относительно небольшом геноме. Функциональные гены для сборки пероксисом были исследованы путем сравнения дикого типа и мутантных штаммов Komagataella . [17]

Комагатэллакак экспериментальный модельный организм

В качестве экспериментального модельного организма Komagataella в основном использовалась в качестве системы-хозяина для трансформации. Благодаря ее способности к рекомбинации с чужеродной ДНК и обработке больших белков, было проведено много исследований для изучения возможности производства новых белков и функции искусственно созданных белков с использованием Komagataella в качестве хозяина трансформации. [18] В последнее десятилетие Komagataella была спроектирована для создания платформ систем экспрессии , что является типичным применением для стандартного экспериментального модельного организма, как описано ниже.

Комагатэллакак платформа системы выражения

Komagataella часто используется в качестве системы экспрессии для производства гетерологичных белков. Несколько свойств делают Komagataella подходящей для этой задачи. В настоящее время несколько штаммов Komagataella используются в биотехнических целях, со значительными различиями между ними в росте и производстве белка. [19] Некоторые распространенные варианты обладают мутацией в гене HIS4 , что приводит к отбору клеток, которые успешно трансформируются с помощью векторов экспрессии . Технология интеграции вектора в геном Komagataella похожа на технологию в Saccharomyces cerevisiae . [20]

Преимущество

  1. Komagataella может расти на простой, недорогой среде с высокой скоростью роста. Komagataella может расти как в колбах для встряхивания , так и в ферментере , что делает ее пригодной как для мелкого, так и для крупного производства. [21]
  2. Komagataella имеет два гена алкогольоксидазы , Aox1 и Aox2 , которые включают сильно индуцируемые промоторы . [22] Эти два гена позволяют Komagataella использовать метанол в качестве источника углерода и энергии. Промоторы AOX индуцируются метанолом и репрессируются глюкозой . Обычно ген для желаемого белка вводится под контролем промотора Aox1 , что означает, что производство белка может быть вызвано добавлением метанола в среду. После нескольких исследований ученые обнаружили, что промотор, полученный из гена AOX1 в Komagataella, чрезвычайно подходит для контроля экспрессии чужеродных генов, которые были трансформированы в геном Komagataella , производя гетерологичные белки. [23]
  3. С ключевой чертой Komagataella может расти с чрезвычайно высокой плотностью клеток в культуре. Эта особенность совместима с гетерологичной экспрессией белка , что дает более высокие выходы продукции. [24]
  4. Технология, необходимая для генетической манипуляции Komagataella , похожа на технологию Saccharomyces cerevisiae , которая является одним из наиболее хорошо изученных модельных организмов дрожжей. В результате, протокол эксперимента и материалы легко построить для Komagataella . [25]

Недостаток

Поскольку некоторые белки требуют шаперонина для правильного сворачивания, Komagataella не может производить ряд белков, так как не содержит соответствующих шаперонов. Технологии введения генов шаперонинов млекопитающих в геном дрожжей и сверхэкспрессии существующих шаперонинов все еще требуют совершенствования. [26] [27]

Сравнение с другими системами экспрессии

В стандартных исследованиях молекулярной биологии бактерия Escherichia coli является наиболее часто используемым организмом для системы экспрессии, для производства гетерологичных белков , из-за ее особенностей быстрого роста, высокой скорости производства белка, а также нетребовательных условий роста. Производство белка в E. coli обычно быстрее, чем в Komagataella , по следующим причинам: компетентные клетки E. coli можно хранить замороженными и размораживать перед использованием, тогда как клетки Komagataella необходимо производить непосредственно перед использованием. Выходы экспрессии в Komagataella различаются между различными клонами , поэтому необходимо скринировать большое количество клонов на производство белка, чтобы найти лучшего производителя. Самым большим преимуществом Komagataella перед E. coli является то, что Komagataella способна образовывать дисульфидные связи и гликозилирования в белках, а E. coli не может. [28] E. coli может производить неправильно свернутый белок, когда дисульфиды включены в конечный продукт, что приводит к неактивным или нерастворимым формам белков. [29]

Хорошо изученный Saccharomyces cerevisiae также используется в качестве системы экспрессии с аналогичными преимуществами по сравнению с E. coli , как и Komagataella . Однако Komagataella имеет два основных преимущества по сравнению с S. cerevisiae в лабораторных и промышленных условиях:

  1. Komagataella , как упоминалось выше, является метилотрофом , что означает, что она может расти с простым метанолом, как единственным источником энергии — Komagataella может быстро расти в клеточной суспензии с достаточно крепким раствором метанола, который убьет большинство других микроорганизмов. В этом случае система экспрессии дешева в настройке и обслуживании.
  2. Komagataella может расти до очень высокой плотности клеток. В идеальных условиях она может размножаться до точки, где клеточная суспензия практически представляет собой пасту. Поскольку выход белка из системы экспрессии в микробе примерно равен продукту белков, произведенных на клетку, это делает Komagataella очень полезной при попытке производства больших количеств белка без дорогостоящего оборудования. [28]

По сравнению с другими системами экспрессии, такими как S2-клетки Drosophila melanogaster и клетки яичников китайского хомячка , Komagataella обычно дает гораздо лучшие урожаи. Как правило, клеточные линии многоклеточных организмов требуют сложных и дорогих типов сред, включая аминокислоты , витамины , а также другие факторы роста . Эти типы сред значительно увеличивают стоимость производства гетерологичных белков. Кроме того, Komagataella может расти в средах, содержащих только один источник углерода и один источник азота , что подходит для приложений изотопной маркировки, таких как ЯМР белков . [28]

Промышленное применение

Komagataella использовались в нескольких видах биотехнологической промышленности, например, в фармацевтической . Все приложения основаны на ее способности экспрессировать белки.

Биотерапевтическое производство

За последние несколько лет Komagataella использовалась для производства более 500 видов биотерапевтических препаратов , таких как IFNγ . Вначале одним из недостатков этой системы экспрессии белка было чрезмерное гликозилирование с высокой плотностью структуры маннозы , что является потенциальной причиной иммуногенности . [ 30] [31] В 2006 году исследовательской группе удалось создать новый штамм под названием YSH597. [a] Этот штамм может экспрессировать эритропоэтин в его нормальной форме гликозилирования, заменяя ферменты, ответственные за гликозилирование грибкового типа, гомологами млекопитающих. Таким образом, измененная схема гликозилирования позволила белку быть полностью функциональным. [32]

Производство ферментов

В пищевой промышленности, например, в пивоварении и пекарне, Komagataella используется для производства различных видов ферментов, как технологических добавок и пищевых добавок , со многими функциями. Например, некоторые ферменты, производимые генетически модифицированной Komagataella, могут сохранять хлеб мягким. Между тем, в пиве ферменты могут использоваться для снижения концентрации алкоголя. [33] Рекомбинантная фосфолипаза C может дегумировать масла с высоким содержанием фосфора, расщепляя фосфолипиды. [34]

В кормах для животных фитаза , вырабатываемая K. phaffi, используется для расщепления фитиновой кислоты , антипитательного вещества. [34]

Ссылки

  1. ^ YSH597 основан на штамме NRRL-Y11430, который теперь считается частью K. phaffi .
  1. ^ ab De Schutter, K., Lin, Y., Tiels, P. (2009). "Геномная последовательность хозяина производства рекомбинантного белка Pichia pastoris". Nature Biotechnology . 27 (6): 561–566. doi : 10.1038/nbt.1544 . PMID  19465926.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  2. ^ Коити Огата, Хидео Нисикава и Масахиро Осуги (1969). «Дрожжи, способные использовать метанол». Сельскохозяйственная и биологическая химия . 33 (10): 1519–1520. doi :10.1080/00021369.1969.10859497.
  3. ^ Ямада, Юдзо; Мацуда, Минако; Маэда, Кодзиро; Миката, Козабуро (январь 1995 г.). «Филогенетические связи ассимилирующих метанол дрожжей на основе частичных последовательностей рибосомальных РНК 18S и 26S: предложение Komagataella Gen. Nov. (Saccharomycetaceae)». Бионаука, биотехнология и биохимия . 59 (3): 439–444. doi :10.1271/bbb.59.439. PMID  7766181.
  4. ^ ab "Комагатаелла Ю.Ямада, М.Мацуда, К.Маэда и Миката, 1995" . www.gbif.org .
  5. ^ ab Heistinger, Lina; Gasser, Brigitte; Mattanovich, Diethard (2020-07-01). "Профиль микроба: Komagataella phaffii: биотехнологические дрожжи, пожирающие метанол, ранее известные как Pichia pastoris". Microbiology . 166 (7): 614–616. doi : 10.1099/mic.0.000958 . ISSN  1350-0872. PMID  32720891.
  6. ^ Курцман, Клетус Пол (ноябрь 2009 г.). «Биотехнологические штаммы Komagataella (Pichia) pastoris являются Komagataella phaffii, как определено в результате анализа мультигенной последовательности». Журнал промышленной микробиологии и биотехнологии . 36 (11): 1435–1438. doi : 10.1007/s10295-009-0638-4 . PMID  19760441.
  7. ^ ab Heistinger, L; Dohm, JC; Paes, BG; Koizar, D; Troyer, C; Ata, Ö; Steininger-Mairinger, T; Mattanovich, D (25 апреля 2022 г.). «Генотипическое и фенотипическое разнообразие видов Komagataella выявляет скрытый путь использования ксилозы». Microbial Cell Factories . 21 (1): 70. doi : 10.1186/s12934-022-01796-3 . PMC 9036795 . PMID  35468837. 
  8. ^ Rebnegger, C., Vos, T., Graf, AB, Valli, M., Pronk, JT, Daran-Lapujade, P., & Mattanovich, D. (2016). «Pichia pastoris демонстрирует высокую жизнеспособность и низкие энергетические затраты на поддержание при удельных скоростях роста, близких к нулю». Applied and Environmental Microbiology . 82 (15): 4570–4583. Bibcode :2016ApEnM..82.4570R. doi : 10.1128/AEM.00638-16 . PMC 4984280 . PMID  27208115. {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  9. ^ Курцман (1998). "42 - Pichia EC Hansen emend. Курцман". Дрожжи: Таксономическое исследование . 1 : 273–352. doi :10.1016/B978-044481312-1/50046-0. ISBN 9780444813121.
  10. ^ Zörgö E, Chwialkowska K, Gjuvsland AB, Garré E, Sunnerhagen P, Liti G, Blomberg A, Omholt SW, Warringer J (2013). "Древние эволюционные компромиссы между состояниями плоидности дрожжей". PLOS Genetics . 9 (3): e1003388. doi : 10.1371/journal.pgen.1003388 . PMC 3605057. PMID  23555297 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  11. ^ Кастилан Р., Боес А., Шпигель Х. (2017). «Улучшение процесса ферментации для производства двух кандидатов на вакцину против малярии на основе PfAMA1-DiCo в Pichia Pastoris». Природа . 1 (1): 7. Бибкод : 2017НатСР...711991К. дои : 10.1038/s41598-017-11819-4 . ПМК 5607246 . ПМИД  28931852. {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  12. ^ MM Guarna GJ Lesnicki BM Tam J. Robinson CZ Radziminski D. Hasenwinkle A. Boraston E. Jervis RTA MacGillivray RFB Turner DG Kilburn (1997). "Онлайн-мониторинг и управление концентрацией метанола в культурах Pichia pastoris во встряхиваемых колбах". Биотехнология и биоинженерия . 56 (3): 279–286. doi :10.1002/(SICI)1097-0290(19971105)56:3<279::AID-BIT5>3.0.CO;2-G. PMID  18636643.
  13. ^ Де Шуттер К., Лин Ю.К., Тилс П., Ван Хекке А., Глинка С., Вебер-Леманн Дж., Рузе П., Ван де Пер Ю., Каллеварт Н. (июнь 2009 г.). «Последовательность генома хозяина-продуцента рекомбинантного белка Pichia Pastoris». Природная биотехнология . 27 (6): 561–6. дои : 10.1038/nbt.1544 . ПМИД  19465926.
  14. ^ Бригитта Гассер, Роланд Прильхофер, Ганс Маркс, Михаэль Маурер, Юстина Нокон, Маттиас Штайгер, Верена Пуксбаум, Михаэль Зауэр и Дитхард Маттанович (2013). «Pichia pastoris: хозяин для производства белка и модельный организм для биомедицинских исследований». Future Microbiology . 8 (2): 191–208. doi :10.2217/fmb.12.133. PMID  23374125.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  15. ^ Тран, А., Нгуен, Т., Нгуен, К. (2017). «Pichia pastoris против Saccharomyces cerevisiae: исследование случая рекомбинантного производства человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора». BMC Res Notes . 10 (1): 148. doi : 10.1186/s13104-017-2471-6 . PMC 5379694. PMID  28376863 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  16. ^ Хайдебрехт, Аниела и Томас Шайбель (2013). «Рекомбинантное производство белков паучьего шелка». Достижения в прикладной микробиологии . 82 : 115–153. doi :10.1016/B978-0-12-407679-2.00004-1. ISBN 9780124076792. PMID  23415154.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  17. ^ Gould, SJ, McCollum, D., Spong, AP, Heyman, JA, & Subramani, S. (1992). «Развитие дрожжей Pichia pastoris как модельного организма для генетического и молекулярного анализа сборки пероксисом». Дрожжи: таксономическое исследование . 8 (8): 613–628. doi :10.1002/yea.320080805. PMID  1441741. S2CID  8840145.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  18. ^ Cregg, JM, Barringer, KJ, Hessler, AY, & Madden, KR (1985). "Pichia pastoris как система-хозяин для трансформаций". Молекулярная и клеточная биология . 5 (12): 3376–3385. doi :10.1128/MCB.5.12.3376. PMC 369166. PMID  3915774 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  19. ^ Брэди, Дж. Р. (2020). «Сравнительный анализ генома вариантов Pichia pastoris дает информацию о выборе оптимального базового штамма». Биотехнология и биоинженерия . 117 (2): 543–555. doi :10.1002/bit.27209. PMC 7003935. PMID 31654411  . 
  20. ^ Хиггинс, Д.Р., и Крегг, Дж.М. (1998). «Знакомство с Pichia Pastoris». Протоколы Пичиа . Методы молекулярной биологии. Том. 103. стр. 1–15. дои : 10.1385/0-89603-421-6:1. ISBN 0-89603-421-6. PMID  9680629.{{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  21. ^ Вэньхуэй Чжан Марк А. Бевинс Брэдли А. Планц Леонард А. Смит Майкл М. Мигер. (2000). «Моделирование роста Pichia pastoris на метаноле и оптимизация производства рекомбинантного белка, фрагмента тяжелой цепи C нейротоксина ботулизма, серотипа А». Биотехнология и биоинженерия . 70 (1): 1–8. doi :10.1002/1097-0290(20001005)70:1<1::AID-BIT1>3.0.CO;2-Y. PMID  10940857.
  22. ^ Daly R, Hearn MT (2005). «Экспрессия гетерологичных белков в Pichia pastoris: полезный экспериментальный инструмент в белковой инженерии и производстве». Журнал молекулярного распознавания . 18 (2): 119–38. doi :10.1002/jmr.687. PMID  15565717. S2CID  7476149.
  23. ^ Романос, Майк. (1995). «Достижения в использовании Pichia pastoris для высокоуровневой экспрессии генов». Current Opinion in Biotechnology . 6 (5): 527–533. doi :10.1016/0958-1669(95)80087-5.
  24. ^ Zhou, X., Yu, Y., Tao, J., & Yu, L. (2014). «Производство LYZL6, нового человеческого лизоцима c-типа, в рекомбинантной Pichia pastoris с использованием ферментации с высокой плотностью клеток». Журнал бионауки и биоинженерии . 118 (4): 420–425. doi :10.1016/j.jbiosc.2014.03.009. PMID  24745549.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  25. ^ Мортон, CL, и Поттер, PM (2000). «Сравнение клеток Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Spodoptera frugiperda и COS7 для экспрессии рекомбинантных генов». Молекулярная биотехнология . 16 (3): 193–202. doi :10.1385/MB:16:3:193. PMID  11252804. S2CID  22792748.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  26. ^ Bankefa, OE; Wang, M; Zhu, T; Li, Y (июль 2018 г.). «Hac1p гомологи из высших эукариот могут улучшить секрецию гетерологичных белков в дрожжах Pichia pastoris». Biotechnology Letters . 40 (7): 1149–1156. doi : 10.1007/s10529-018-2571-y . PMID  29785668. S2CID  29155989.
  27. ^ Юй, Сяо-Вэй; Сан, Вэй-Хун; Ван, Ин-Чжэн; Сюй, Янь (24 ноября 2017 г.). «Идентификация новых факторов, усиливающих продукцию рекомбинантного белка в многокопийной Komagataella phaffii на основе транскриптомного анализа эффектов сверхэкспрессии». Scientific Reports . 7 (1): 16249. Bibcode :2017NatSR...716249Y. doi : 10.1038/s41598-017-16577-x . PMC 5701153 . PMID  29176680. 
  28. ^ abc Крегг Дж. М., Толсторуков И., Кусари А., Сунга Дж., Мэдден К., Чаппелл Т. (2009). «Глава 13 Экспрессия дрожжей Pichia Pastoris». Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы энзимологии. Том. 463. стр. 169–89. дои : 10.1016/S0076-6879(09)63013-5. ISBN 978-0-12-374536-1. PMID  19892173.
  29. ^ Brondyk WH (2009). "Глава 11 Выбор подходящего метода для экспрессии рекомбинантного белка". Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы в энзимологии. Том 463. стр. 131–47. doi :10.1016/S0076-6879(09)63011-1. ISBN 978-0-12-374536-1. PMID  19892171.
  30. ^ Разаги А., Тан Э., Луа Л.Х., Оуэнс Л., Картикеян О.П., Хейманн К. (январь 2017 г.). «Является ли Pichia Pastoris реальной платформой для промышленного производства рекомбинантного человеческого гамма-интерферона?». Биологические препараты . 45 : 52–60. doi :10.1016/j.biologicals.2016.09.015. PMID  27810255. S2CID  28204059.
  31. ^ Али Разаги; Роджер Хюрлиманн; Ли Оуэнс; Кирстен Хайманн (2015). «Повышенная экспрессия и секреция рекомбинантного hIFNγ посредством селективного давления, вызванного голоданием аминокислот, на соседний ген HIS4 в Pichia pastoris» (PDF) . Европейский фармацевтический журнал . 62 (2): 43–50. doi : 10.1515/afpuc-2015-0031 .
  32. ^ Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y, Rios S, Bobrowicz P, Stadheim TA, Li H, Choi BK, Hopkins D, Wischnewski H, Roser J, Mitchell T, Strawbridge RR, Hoopes J, Wildt S, Gerngross TU (сентябрь 2006 г.). «Гуманизация дрожжей для получения сложных терминально сиалилированных гликопротеинов». Science . 313 (5792): 1441–3. Bibcode :2006Sci...313.1441H. doi :10.1126/science.1130256. PMID  16960007. S2CID  43334198.
  33. ^ Spohner, SC, Müller, H., Quitmann, H., & Czermak, P. (2015). «Экспрессия ферментов для использования в пищевой и кормовой промышленности с Pichia pastoris». Журнал биотехнологии . 202 : 420–425. doi :10.1016/j.jbiotec.2015.01.027. PMID  25687104.{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  34. ^ аб Бароне, Греция; Эммерсторфер-Августин, А; Бюндо, А; Пизано, я; Кокчетти, П; Мапелли, В.; Каматтари, А. (26 февраля 2023 г.). «Промышленное производство белков с использованием Pichia Pastoris-Komagataella phaffii». Биомолекулы . 13 (3): 441. doi : 10.3390/biom13030441 . ПМЦ 10046876 . ПМИД  36979376.