Антинуклеарные антитела ( АНА , также известные как антинуклеарный фактор или АНФ ) [2] являются аутоантителами , которые связываются с содержимым клеточного ядра . У нормальных людей иммунная система вырабатывает антитела к чужеродным белкам ( антигенам ), но не к человеческим белкам ( аутоантигенам ). В некоторых случаях вырабатываются антитела к человеческим антигенам; они известны как аутоантитела. [3]
Существует много подтипов ANA, таких как антитела против Ro , антитела против La , антитела против Sm , антитела против nRNP , антитела против Scl-70 , антитела против dsDNA , антитела против гистонов , антитела к комплексам ядерных пор , антитела против центромеры и антитела против sp100 . Каждый из этих подтипов антител связывается с различными белками или белковыми комплексами в ядре. Они обнаруживаются при многих расстройствах, включая аутоиммунные заболевания , рак и инфекции , с различной распространенностью антител в зависимости от состояния. Это позволяет использовать ANA в диагностике некоторых аутоиммунных расстройств, включая системную красную волчанку , синдром Шегрена , [4] склеродермию , [5] смешанное заболевание соединительной ткани , [6] полимиозит , дерматомиозит , аутоиммунный гепатит [7] и лекарственную волчанку . [8]
Тест ANA обнаруживает аутоантитела, присутствующие в сыворотке крови человека . Обычными тестами, используемыми для обнаружения и количественной оценки ANA, являются непрямая иммунофлуоресценция и иммуноферментный анализ (ELISA). При иммунофлуоресценции уровень аутоантител сообщается как титр . Это самое высокое разведение сыворотки, при котором аутоантитела все еще обнаруживаются. Положительные титры аутоантител при разведении, равном или большем 1:160, обычно считаются клинически значимыми. Положительные титры менее 1:160 присутствуют у 20% здорового населения, особенно у пожилых людей. Хотя положительные титры 1:160 или выше тесно связаны с аутоиммунными расстройствами, они также встречаются у 5% здоровых людей. [9] [10] Скрининг аутоантител полезен при диагностике аутоиммунных расстройств, а мониторинг уровней помогает предсказать прогрессирование заболевания. [8] [11] [12] Положительный тест на АНА редко бывает полезным, если отсутствуют другие клинические или лабораторные данные, подтверждающие диагноз. [13]
У человеческого организма есть много защитных механизмов против патогенов , одним из которых является гуморальный иммунитет . Этот защитный механизм вырабатывает антитела (крупные гликопротеины ) в ответ на иммунный стимул. Для этого процесса требуются многие клетки иммунной системы, включая лимфоциты ( Т-клетки и В-клетки ) и антигенпрезентирующие клетки . Эти клетки координируют иммунный ответ при обнаружении чужеродных белков ( антигенов ), вырабатывая антитела, которые связываются с этими антигенами. В нормальной физиологии лимфоциты, распознающие человеческие белки ( аутоантигены ), либо подвергаются запрограммированной клеточной смерти ( апоптозу ), либо становятся нефункциональными. Эта аутотолерантность означает, что лимфоциты не должны вызывать иммунный ответ против человеческих клеточных антигенов. Однако иногда этот процесс дает сбой, и антитела вырабатываются против человеческих антигенов, что может привести к аутоиммунному заболеванию. [3]
ANAs обнаруживаются при многих расстройствах, а также у некоторых здоровых людей. К этим расстройствам относятся: системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит , синдром Шегрена , склеродермия , полимиозит , дерматомиозит , первичный билиарный цирроз , лекарственная волчанка , аутоиммунный гепатит , рассеянный склероз , дискоидная волчанка , заболевания щитовидной железы , антифосфолипидный синдром , ювенильный идиопатический артрит , псориатический артрит , ювенильный дерматомиозит , идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура , инфекция и рак . Эти антитела можно подразделить в соответствии с их специфичностью, и каждая подгруппа имеет различные склонности к определенным расстройствам. [8] [14]
Извлекаемые ядерные антигены (ENA) представляют собой группу аутоантигенов , которые изначально были идентифицированы как мишени антител у людей с аутоиммунными расстройствами. Они называются ENA, потому что их можно извлечь из ядра клетки с помощью физиологического раствора. [8] [15] ENA состоят из рибонуклеопротеинов и негистоновых белков, названных либо по имени донора, который предоставил прототип сыворотки (Sm, Ro, La, Jo), либо по названию заболевания, в котором были обнаружены антитела (SS-A, SS-B, Scl-70). [16]
Антитела анти-Ro и анти-La , также известные как SS-A и SS-B, соответственно, обычно обнаруживаются при первичном синдроме Шегрена , аутоиммунном заболевании , которое поражает экзокринные железы . Присутствие обоих антител обнаруживается в 30–60% случаев синдрома Шегрена, только антитела анти-Ro обнаруживаются в 50–70% случаев синдрома Шегрена и в 30% случаев СКВ с поражением кожи, а антитела анти-La редко обнаруживаются изолированно. [11] [17] Антитела анти-La также обнаруживаются при СКВ; однако синдром Шегрена обычно также присутствует. [18] Антитела анти-Ro также реже обнаруживаются при других заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания печени, целиакию , аутоиммунные ревматические заболевания, сердечную неонатальную красную волчанку и полимиозит . [19] [20] Во время беременности антитела против Ro могут проникать через плаценту и вызывать блокаду сердца [21] [22] и неонатальную волчанку у младенцев. [23] При синдроме Шегрена антитела против Ro и против La коррелируют с ранним началом, увеличением продолжительности заболевания, увеличением околоушных желез , заболеванием за пределами желез и инфильтрацией желез лимфоцитами. [12] Антитела против Ro специфичны к компонентам комплекса Ro-RNP, включающего белки и РНК 45 кДа, 52 кДа, 54 кДа и 60 кДа. Связывающий белок ДНК /РНК 60 кДа и регуляторный белок Т-клеток 52 кДа являются наиболее охарактеризованными антигенами антител против Ro. В совокупности эти белки являются частью комплекса рибонуклеопротеина (RNP), который ассоциируется с человеческими Y-РНК , hY1-hY5. Антиген La представляет собой фактор терминации транскрипции РНК-полимеразы III массой 48 кДа , который ассоциируется с комплексом Ro-RNP. [16] [17] [24] [25]
Механизм продукции антител при синдроме Шегрена до конца не изучен, но апоптоз (запрограммированная гибель клеток) и молекулярная мимикрия могут играть определенную роль. [12] Антигены Ro и La экспрессируются на поверхности клеток, подвергающихся апоптозу, и могут вызывать воспаление в слюнной железе путем взаимодействия с клетками иммунной системы. Антитела также могут вырабатываться посредством молекулярной мимикрии, когда перекрестно-реактивные антитела связываются как с вирусными, так и с человеческими белками. Это может происходить с одним из антигенов, Ro или La, и впоследствии может вырабатывать антитела к другим белкам посредством процесса, известного как распространение эпитопа . Ретровирусный белок gag демонстрирует сходство с белком La и предлагается в качестве возможного примера молекулярной мимикрии при синдроме Шегрена. [12] [20]
Антитела к анти-Smith (Anti-Sm) являются весьма специфичным маркером СКВ. Примерно у 99% людей без СКВ отсутствуют антитела к анти-Sm, но только у 20% людей с СКВ есть антитела. Они связаны с поражением центральной нервной системы , заболеванием почек , фиброзом легких и перикардитом при СКВ, но они не связаны с активностью заболевания. Антигены антител к анти-Sm являются основными единицами малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP), называемых от A до G, и будут связываться с snRNP U1, U2, U4, U5 и U6. Чаще всего антитела специфичны для единиц B, B' и D. [26] [27] Молекулярные и эпидемиологические исследования показывают, что антитела к анти-Sm могут быть вызваны молекулярной мимикрией, поскольку белок демонстрирует некоторое сходство с белками вируса Эпштейна-Барр . [28] [29]
Антитела к ядерному рибонуклеопротеину (анти-nRNP) , также известные как антитела к U1-RNP, обнаруживаются у 30–40% больных СКВ. Они часто обнаруживаются вместе с антителами к Sm, но могут быть связаны с различными клиническими ассоциациями. Помимо СКВ, эти антитела тесно связаны со смешанным заболеванием соединительной ткани . Антитела к nRNP распознают основные блоки A и C snRNP и поэтому в первую очередь связываются с U1-snRNP. [26] [30] Иммунный ответ на RNP может быть вызван представлением ядерных компонентов на клеточной мембране в апоптотических пузырьках. Молекулярная мимикрия также была предложена в качестве возможного механизма выработки антител к этим белкам из-за сходства между полипептидами U1-RNP и полипептидами вируса Эпштейна-Барр. [31]
Антитела к Scl-70 связаны со склеродермией . [32] Чувствительность антител к склеродермии составляет приблизительно 34%, но она выше в случаях с диффузным поражением кожи (40%) и ниже при ограниченном поражении кожи (10%). Специфичность антител составляет 98% и 99,6% при других ревматических заболеваниях и у здоровых людей соответственно. [8] [33] Помимо склеродермии, эти антитела обнаруживаются приблизительно у 5% людей с СКВ. [34] Антигенной мишенью антител к Scl-70 является топоизомераза I. [ 35]
Хотя антитела против Jo-1 часто включаются в ANA, на самом деле они являются антителами к цитоплазматическому белку, гистидил-тРНК-синтетазе – аминоацил-тРНК-синтетазе, необходимой для синтеза гистидин-нагруженной тРНК. [15] Они тесно связаны с полимиозитом и дерматомиозитом и редко встречаются при других заболеваниях соединительной ткани. Около 20–40% случаев полимиозита положительны по антителам Jo-1, и у большинства будет интерстициальное заболевание легких, маркеры человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) HLA-DR3 и HLA-DRw52; вместе известные как синдром Jo-1. [26] [36]
Антитела к двухцепочечной ДНК (анти-dsDNA) тесно связаны с СКВ. Они являются весьма специфичным маркером заболевания, некоторые исследования указывают на почти 100%. [8] Данные о чувствительности варьируются от 25 до 85%. Уровни антител к dsDNA, известные как титры, коррелируют с активностью заболевания при СКВ; высокие уровни указывают на более активную волчанку. Наличие антител к dsDNA также связано с волчаночным нефритом , и есть доказательства, что они являются его причиной. Некоторые антитела к dsDNA перекрестно реагируют с другими антигенами, обнаруженными на базальной мембране клубочков (GBM) почек, такими как гепарансульфат , коллаген IV, фибронектин и ламинин . Связывание с этими антигенами в почке может вызвать воспаление и фиксацию комплемента , что приводит к повреждению почек. Было показано, что наличие высокого связывания ДНК и низкого уровня C3 имеет чрезвычайно высокую прогностическую ценность (94%) для диагностики СКВ. [37] Также возможно, что антитела анти-dsDNA интернализуются клетками, когда они связывают мембранные антигены, а затем отображаются на поверхности клетки. Это может способствовать воспалительным реакциям Т-клеток в почках. Важно отметить, что не все антитела анти-dsDNA связаны с волчаночным нефритом и что другие факторы могут вызывать этот симптом в их отсутствие. Антигеном антител анти-dsDNA является двухцепочечная ДНК . [38] [39]
Антигистоновые антитела обнаруживаются в сыворотке до 75–95% людей с лекарственной волчанкой и 75% с идиопатической СКВ. В отличие от антител к двухцепочечной ДНК при СКВ, эти антитела не фиксируют комплемент. [ требуется ссылка ] Хотя они чаще всего обнаруживаются при лекарственной волчанке, они также обнаруживаются в некоторых случаях СКВ, склеродермии , ревматоидного артрита и недифференцированного заболевания соединительной ткани . Известно, что многие препараты вызывают лекарственную волчанку, и они производят различные антигенные мишени в нуклеосоме, которые часто перекрестно реагируют с несколькими гистоновыми белками и ДНК. Прокаинамид вызывает форму лекарственной волчанки, которая производит антитела к комплексу гистонов H2A и H2B. [40] [41]
Оба антитела , анти-гликопротеин-210 (анти-gp210) и анти-нуклеопорина 62 (анти-p62), являются антителами к компонентам ядерной мембраны и обнаруживаются при первичном билиарном циррозе (ПБЦ). Каждое антитело присутствует примерно в 25–30% ПБЦ. Антигены обоих антител являются составными частями ядерной мембраны . gp210 — это белок массой 200 кДа, участвующий в закреплении компонентов ядерной поры на ядерной мембране. Антиген p62 — это комплекс ядерной поры массой 60 кДа. [42] [43]
Антитела к центромере связаны с ограниченным кожным системным склерозом, также известным как синдром CREST , первичным билиарным циррозом и проксимальной склеродермией. [44] Существует шесть известных антигенов, все из которых связаны с центромерой ; от CENP-A до CENP-F. CENP-A — это гистон H3 -подобный белок массой 17 кДа. CENP-B — это связывающий ДНК белок массой 80 кДа, участвующий в сворачивании гетерохроматина . CENP-C — это протеин массой 140 кДа, участвующий в сборке кинетохора . CENP-D — это протеин массой 50 кДа с неизвестной функцией, но может быть гомологичен другому протеину, участвующему в конденсации хроматина , RCC1 . CENP-E — это протеин массой 312 кДа из семейства моторных белков кинезина . CENP-F — это белок 367 кДа из ядерного матрикса, который связывается с кинетохором в поздней фазе G2 во время митоза. Антитела CENP-A, B и C встречаются чаще всего (16–42% системного склероза) и связаны с феноменом Рейно, телеангиэктазиями , поражением легких и ранним началом системного склероза. [33] [45] [46]
Антитела к sp100 обнаруживаются примерно у 20–30% пациентов с первичным билиарным циррозом (ПБЦ). Они обнаруживаются у немногих людей без ПБЦ и, следовательно, являются весьма специфичным маркером заболевания. Антиген sp100 обнаруживается в ядерных тельцах; крупных белковых комплексах в ядре, которые могут играть роль в росте и дифференциации клеток. [47]
Антитела против PM-Scl обнаруживаются у 50% пациентов с синдромом перекрытия полимиозита/системного склероза (PM/SSc) . Примерно у 80% людей с антителами, присутствующими в сыворотке крови, будет наблюдаться это расстройство. Наличие антител связано с ограниченным кожным поражением синдрома перекрытия PM/SSc. Антигенными мишенями антител являются компоненты комплекса экзосомы , обрабатывающей РНК, в ядрышке . [33] В этом комплексе есть десять белков, и антитела к восьми из них обнаруживаются с разной частотой: PM/Scl-100 (70–80%), PM/Scl-75 (46–80%), hRrp4 (50%), hRrp42 (21%), hRrp46 (18%), hCs14 (14%), hRrp41 (10%) и hRrp40 (7%). [48]
Антитела к DFS70 создают плотный мелкопятнистый рисунок при непрямой иммунофлуоресценции и обнаруживаются у нормальных людей и при различных состояниях, но не связаны с системной аутоиммунной патологией. Поэтому их можно использовать для исключения таких состояний у лиц с положительным результатом на АНА. Значительному числу пациентов ставят диагноз системной красной волчанки или недифференцированного заболевания соединительной ткани, в основном на основании положительного результата на АНА. В случае, если не удается обнаружить определенные аутоантитела (например, антитела к ENA), рекомендуется провести тестирование на антитела к DFS70 для подтверждения диагноза. Тесты на антитела к DFS70 доступны как тесты с маркировкой CE. До сих пор не существует анализа, одобренного FDA. [49]
Наличие ANA в крови может быть подтверждено с помощью скринингового теста. Хотя существует множество тестов для обнаружения ANA, наиболее распространенными тестами, используемыми для скрининга, являются непрямая иммунофлуоресценция и иммуноферментный анализ (ELISA). [50] После обнаружения ANA определяются различные подтипы. [8]
Непрямая иммунофлуоресценция является одним из наиболее часто используемых тестов для ANA. Обычно клетки HEp-2 используются в качестве субстрата для обнаружения антител в сыворотке человека. Предметные стекла микроскопа покрываются клетками HEp-2, и сыворотка инкубируется с клетками. Если указанные и целевые антитела присутствуют, то они связываются с антигенами на клетках; в случае ANA антитела связываются с ядром. Их можно визуализировать, добавив флуоресцентно помеченное (обычно FITC или родопсин B) античеловеческое антитело, которое связывается с антителами. Молекула будет флуоресцировать, когда на нее падает свет определенной длины волны, что можно увидеть под микроскопом. В зависимости от антитела, присутствующего в сыворотке человека, и локализации антигена в клетке, на клетках HEp-2 будут видны различные паттерны флуоресценции. [51] [52] Уровни антител анализируются путем проведения разведений в сыворотке крови. Тест ANA считается положительным, если флуоресценция наблюдается при титре 1:40/1:80. Более высокие титры более клинически значимы, поскольку низкие положительные результаты (≤1:160) обнаруживаются у 20% здоровых людей, особенно пожилых. Только около 5% здорового населения имеют титры ANA 1:160 или выше. [8] [53]
Примерно до 1975 года, когда были введены клетки HEp-2, в качестве стандартного субстрата для иммунофлуоресценции использовалась животная ткань. [11] В настоящее время клетки HEp-2 являются одним из наиболее распространенных субстратов для обнаружения ANA методом иммунофлуоресценции. [54]
Первоначально возник штамм карциномы гортани, клеточная линия была загрязнена и вытеснена клетками HeLa , и теперь ее фактически идентифицируют как клетки HeLa. [55]
Они превосходят ранее используемые ткани животных из-за их большого размера и высокой скорости митоза (деления клеток) в клеточной линии . Это позволяет обнаруживать антитела к антигенам, специфичным для митоза, например, антитела центромеры. Они также позволяют идентифицировать антитела против Ro, поскольку для фиксации клеток используется ацетон (другие фиксаторы могут смыть антиген). [56]
На клетках HEp-2 наблюдается множество рисунков ядерного окрашивания: гомогенный, пятнистый, ядрышковый, ядерно-мембранозный, центромерный, ядерно-точечный и плеоморфный. Гомогенный рисунок виден при окрашивании конденсированных хромосом и интерфазного хроматина . Этот рисунок связан с антителами к двухцепочечной ДНК , антителами к нуклеосомным компонентам и антителами к гистонам. Существует два рисунка с пятнами: мелкий и крупный. Мелкопятнистый рисунок имеет мелкое ядерное окрашивание с неокрашенным метафазным хроматином, которое связано с антителами к Ro и La. Крупнозернистый рисунок имеет крупнозернистое ядерное окрашивание, вызванное антителами к U1-RNP и Sm. Ядрышковый рисунок окрашивания связан со многими антителами, включая антитела к Scl-70, к PM-Scl, к фибрилларину и к Th/To. Окрашивание ядерной мембраны выглядит как флуоресцентное кольцо вокруг ядра клетки и производится антителами против gp210 и против p62. Рисунок центромеры показывает несколько ядерных точек в интерфазных и митотических клетках, что соответствует числу хромосом в клетке. Ядерные точечные узоры показывают от 13 до 25 ядерных точек в интерфазных клетках и производятся антителами против sp100 . Плеоморфный узор вызывается антителами к ядерному антигену пролиферирующей клетки . [26] [53] [57] [58] Было показано, что непрямая иммунофлуоресценция немного превосходит ИФА в обнаружении ANA из клеток HEp-2. [54]
Crithidia luciliae — это гемофлагелятные одноклеточные протисты . Они используются в качестве субстрата в иммунофлуоресценции для обнаружения антител к dsDNA. Они обладают органеллой, известной как кинетопласт , которая представляет собой большую митохондрию с сетью взаимосвязанных кольцевых молекул dsDNA. После инкубации с сывороткой, содержащей антитела к dsDNA и флуоресцентно меченые антитела к человеку, кинетопласт будет флуоресцировать. Отсутствие других ядерных антигенов в этой органелле означает, что использование C. luciliae в качестве субстрата позволяет проводить специфическое обнаружение антител к dsDNA. [8] [59] [60]
Иммуноферментный анализ (ИФА) использует покрытые антигеном микротитровальные планшеты для обнаружения ANA. [61] Каждая лунка микротитровального планшета покрыта либо одним антигеном, либо несколькими антигенами для обнаружения специфических антител или для скрининга ANA, соответственно. Антигены либо из клеточных экстрактов, либо рекомбинантные. Сыворотка крови инкубируется в лунках планшета и вымывается. Если присутствуют антитела, связывающиеся с антигеном, то они останутся после промывки. Добавляется вторичное античеловеческое антитело, конъюгированное с ферментом, таким как пероксидаза хрена . Ферментативная реакция вызовет изменение цвета раствора, пропорциональное количеству антител, связанных с антигеном. [11] [52] [62] Существуют значительные различия в обнаружении ANA с помощью иммунофлуоресценции и различных наборов ИФА, и между ними существует лишь незначительное согласие. Клиницист должен быть знаком с различиями, чтобы оценить результаты различных анализов. [61]
В следующей таблице приведена чувствительность различных типов АНА при различных заболеваниях.
Некоторые ANA появляются при нескольких типах заболеваний, что приводит к снижению специфичности теста. Например, было показано , что IgM- ревматоидный фактор (IgM-RF) перекрестно реагирует с ANA, давая ложноположительную иммунофлуоресценцию . [64] Положительные ANA, а также антитела к ДНК были зарегистрированы у пациентов с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы . [65] [66] ANA может иметь положительный результат теста у 45% людей с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы или ревматоидным артритом и у 15% людей с ВИЧ или гепатитом С. [66] [67] [68] [69] Согласно данным Американского фонда волчанки , «около 5% общей популяции будут иметь положительный ANA. Однако по крайней мере 95% людей с положительным ANA не имеют волчанки. Положительный тест на ANA иногда может быть в семьях, даже если у членов семьи нет признаков волчанки». [10] С другой стороны, они говорят, что хотя 95% пациентов, у которых действительно есть волчанка, дают положительный результат на АНА, «только небольшой процент имеет отрицательный АНА, и у многих из них есть другие антитела (такие как антифосфолипидные антитела , анти-Ro, анти-SSA) или их АНА превратились из положительных в отрицательные из- за стероидов , цитотоксических препаратов или уремии (почечной недостаточности)». [10]
Клетка LE была обнаружена в костном мозге в 1948 году Харгрейвсом и соавторами [70] . В 1957 году Холбороу и соавторы впервые продемонстрировали ANA с помощью непрямой иммунофлуоресценции. [71] Это было первым указанием на то, что процессы, влияющие на ядро клетки, были ответственны за СКВ. В 1959 году было обнаружено, что сыворотка от людей с СКВ содержала антитела, которые осаждались с солевыми экстрактами ядер, известные как извлекаемые ядерные антигены (ENA). Это привело к характеристике антигенов ENA и соответствующих им антител. Так, в 1966 и 1971 годах были обнаружены антитела анти-Sm и анти-RNP соответственно. В 1970-х годах были обнаружены антитела анти-Ro/анти-SS-A и анти-La/анти-SS-B. Антитело Scl-70 было известно как специфическое антитело к склеродермии в 1979 году, однако антиген (топоизомераза-I) не был охарактеризован до 1986 года. Антиген и антитело Jo-1 были охарактеризованы в 1980 году. [8] [20]