Дезоксирибонуклеаза ( сокращенно ДНКаза ) относится к группе гликопротеиновых эндонуклеаз , которые являются ферментами , катализирующими гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в остове ДНК , тем самым разрушая ДНК. Роль фермента ДНКазы в клетках включает разрушение внеклеточной ДНК (вкДНК), выделяемой при апоптозе , некрозе и нейтрофильных внеклеточных ловушках (НЭТ) клеток, чтобы помочь уменьшить воспалительные реакции, которые в противном случае были бы вызваны. Известно большое разнообразие дезоксирибонуклеаз, которые относятся к одному из двух семейств ( ДНКаза I или ДНКаза II ), которые различаются по своей субстратной специфичности, химическим механизмам и биологическим функциям. Лабораторные применения ДНКазы включают очистку белков при извлечении из прокариотических организмов. Кроме того, ДНКаза применялась в качестве лечения заболеваний, которые вызываются вкДНК в плазме крови. Анализы ДНКазы также появляются в области исследований.
Два основных типа ДНКазы, обнаруженных у животных , известны как дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) и дезоксирибонуклеаза II (ДНКаза II). Эти два семейства имеют подкатегории внутри себя.
Первый набор ДНКаз — ДНКаза I. Это семейство состояло из ДНКазы I, ДНКазы1L1 , ДНКазы 1L2 и ДНКазы1L3 . ДНКаза I расщепляет ДНК с образованием двух олигонуклеотидных конечных продуктов с 5'-фосфо- и 3'-гидроксиконцами и вырабатывается в основном органами пищеварительной системы . Семейство ДНКаз I требует катионов Ca2+ и Mg2+ в качестве активаторов и селективно экспрессируется. [1] Что касается pH, то семейство ДНКаз I активно при нормальном pH около 6,5–8.
Второй набор ДНКаз — ДНКаза II. Это семейство состоит из ДНКазы II α и ДНКазы II β. Как и ДНКаза I, ДНКаза II расщепляет ДНК с образованием двух олигонуклеотидных конечных продуктов с 5'-гидрокси и 3'-фосфо концами. Этот тип ДНКазы более широко экспрессируется в тканях из-за высокой экспрессии в макрофагах, но ограниченной экспрессии в типах клеток. В отличие от ДНКазы I, им не нужны катионы Ca2+ и Mg2+ в качестве активаторов. [2] Что касается pH , семейство ДНКазы II экспрессируется при кислом pH. Характер расщепления ДНКазы II изменяется в присутствии диметилсульфоксида ( ДМСО ), который существенно влияет на структуру ДНК.
Хотя ДНКаза I и ДНКаза II являются гликопротеиновыми эндонуклеазами, ДНКаза I имеет мономерную сэндвичевую структуру с углеводной боковой цепью, тогда как ДНКаза II имеет димерную четвертичную структуру .
Структура ДНКазы I: ДНКаза I представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 30 000 Да и углеводной цепью из 8-10 остатков, прикрепленной к Asn18 (оранжевый). [3] Это 𝛼,𝛽-белок с двумя 6-цепочечными 𝛽-складчатыми слоями, которые образуют ядро структуры. [4] Эти два основных слоя идут параллельно, а все остальные идут антипараллельно. 𝛽-складчатые слои лежат в центре структуры, в то время как 𝛼-спирали обозначены катушками на периферии. ДНКаза I содержит четыре ион-связывающих кармана и требует Ca 2+ и Mg 2+ для гидролиза двухцепочечной ДНК. [5] Два из участков прочно связывают Ca 2+, в то время как два других координируют Mg 2+ . О количестве и местоположении участков связывания Mg 2+ опубликовано немного , хотя было высказано предположение, что Mg 2+ расположен вблизи каталитического кармана и способствует гидролизу. [6] Два Ca 2+ показаны на изображении красным цветом. Они связаны с ДНКазой I в условиях кристаллизации и важны для структурной целостности молекулы, стабилизируя поверхностную петлю Asp198 до Thr204 (голубой) и ограничивая область высокой тепловой подвижности в гибкой петле остатками Gly97 до Gly102 (желтый).
Структура ДНКазы II: ДНКаза II содержит гомодимерную четвертичную структуру, которая способна связывать двухцепочечную ДНК в архитектуре U-образного зажима. Внутренняя часть U-образного зажима в значительной степени электроположительна, способна связывать отрицательно заряженную ДНК. Подобно ДНКазе I, структура ДНКазы II состоит из смешанной вторичной структуры 𝛼/𝛽 с 9 𝛼-спиралями и 20 𝛽-складчатыми листами. [7] Хотя в отличие от ДНКазы I, ДНКазе II не требуются двухвалентные ионы металлов для катализа. [7] Структура состоит из протомера A (голубой) и протомера B (зеленый). Каждая структура состоит из двух каталитических мотивов, которые для простоты помечены на протомере B: His100 и Lys102 составляют первый мотив (синий), а His279 и Lys281 составляют второй каталитический мотив (красный).
Некоторые ДНКазы разрезают или «расщепляют» только остатки на концах молекул ДНК. Этот тип экзонуклеаз известен как экзодезоксирибонуклеазы . Другие расщепляют в любом месте цепи, известные как эндодезоксирибонуклеазы (подмножество эндонуклеаз ). [8] Некоторые ДНКазы довольно неразборчивы в отношении последовательности ДНК , по которой они разрезают, в то время как другие, включая ферменты рестрикции , очень специфичны к последовательности. Другие ДНКазы расщепляют только двухцепочечную ДНК , другие специфичны для одноцепочечных молекул, а третьи активны по отношению к обеим.
Действие ДНКазы происходит в три фазы. Начальная фаза вносит множественные надрезы в фосфодиэфирный остов . Вторая фаза производит кислоторастворимые нуклеотиды. Третья фаза, которая является терминальной, состоит из восстановления олигонуклеотидов, вызывая гиперхромный сдвиг в УФ-данных. [9]
ДНКаза I в основном нацелена на двухцепочечную ДНК и в меньшей степени на некоторую одноцепочечную ДНК для расщепления. ДНКаза I катализирует неспецифическое расщепление ДНК путем разрыва фосфодиэфирных связей в одной из цепей. Ее сайт расщепления находится между 3′-атомом кислорода и соседним атомом фосфора, что дает 3′-гидроксильные и 5′-фосфорильные олигонуклеотиды с инверсией конфигурации у фосфора. Фермент ДНКаза полагается на присутствие двухвалентного катиона , который обычно является Ca 2+ , для правильной функции. Активный сайт ДНКазы I включает два остатка гистидина (His134 и His252) и два кислотных остатка ( Glu 78 и Asp 212), все из которых имеют решающее значение для общего кислотно-основного катализа фосфодиэфирных связей. [10]
Дезоксирибонуклеаза II (ДНКаза II) также известна как кислая дезоксирибонуклеаза, поскольку она имеет оптимальную активность в среде лизосом с низким pH, где она обычно встречается у высших эукариот. Некоторые формы рекомбинантной ДНКазы II демонстрируют высокий уровень активности при низком pH в отсутствие ионов двухвалентных металлов, подобно эукариотической ДНКазе II. [7] В отличие от ДНКазы I, ДНКаза II расщепляет фосфодиэфирную связь между 5'-атомом кислорода и соседним атомом фосфора, давая 3΄-фосфорилированные и 5΄-гидроксильные нуклеотиды.
ДНКаза обычно используется при очистке белков, которые извлекаются из прокариотических организмов. Извлечение белка часто включает в себя деградацию клеточной мембраны . Обычно деградированная и хрупкая клеточная мембрана лизируется , высвобождая нежелательную ДНК и желаемые белки. Полученный экстракт ДНК-белка очень вязкий и его трудно очистить, в этом случае для его расщепления добавляют ДНКазу. [11] ДНК гидролизуется , но белки не затрагиваются, и экстракт может подвергаться дальнейшей очистке.
Внеклеточная ДНК (вкДНК) — это ДНК, которая находится в кровотоке. Она появляется в результате апоптоза , некроза или нейтрофильных внеклеточных ловушек (НЭТ)-оза клеток крови и тканей, но также может возникать в результате активной секреции из живых клеток. ВкДНК и их назначенные ДНК-связывающие белки способны активировать ДНК-чувствительные рецепторы, рецепторы распознавания образов (ПРР). ПРР способны стимулировать пути, которые вызывают воспалительный иммунный ответ. В результате несколько исследований воспалительных заболеваний показали, что в плазме крови наблюдаются высокие концентрации вкДНК. По этой причине ДНКаза оказалась возможным средством лечения для снижения вкДНК в плазме крови. ДНКазы могут выводиться как внутриклеточно, так и внеклеточно и могут расщеплять фосфодиэфирную связь ДНК . Эту функцию можно использовать для поддержания низкой концентрации вкДНК, тем самым леча воспаление. Заболевания, возникающие из-за остатков ДНК в крови, были направлены с использованием «разрушающих свойств» ДНКазы. Исследования показали, что ДНКаза может действовать как лечение, уменьшая вязкость слизи. [12] [13] Введение ДНКазы варьируется в зависимости от заболевания. Она может и вводилась перорально , внутриплеврально, внутривенно , внутрибрюшинно и через ингаляцию . [14] Несколько исследований продолжают изучать применение ДНКазы в качестве лечения, а также способы мониторинга здоровья. Например, недавно ДНКаза, полученная из патогенных бактерий, использовалась в качестве индикатора для мониторинга раневой инфекции. [15]
Муковисцидоз — это генетическое заболевание , которое влияет на выработку слизи, пота и пищеварительных жидкостей, в результате чего они становятся более вязкими, а не смазочными . Ферменты ДНКазы могут вдыхаться с помощью небулайзера больными муковисцидозом . Ферменты ДНКазы помогают, поскольку лейкоциты накапливаются в слизи и, когда они распадаются, высвобождают ДНК, что увеличивает «липкость» слизи. Ферменты ДНКазы расщепляют ДНК, и слизь намного легче выводится из легких. В частности, ДНКаза I, также известная как одобренный FDA препарат Пульмозим (также известная как дорназа альфа), используется в качестве лечения для улучшения функции легких.
Было обнаружено, что свойства ДНКаз также оказывают положительное влияние на другие респираторные заболевания , такие как астма [16] , эмпиема плевры [12] и хроническая обструктивная болезнь легких .
Кроме того, недавние исследования показывают, что внутриплевральный тканевой активатор плазминогена (tPA), белок, отвечающий за разрушение тромбов, в сочетании с дезоксирибонуклеазой усиливает плевральный дренаж, сокращает продолжительность пребывания в больнице и снижает необходимость хирургического вмешательства при парапневмонических выпотах и эмпиеме .
Сепсис — это опасное для жизни воспалительное заболевание , вызванное экстремальной реакцией организма на инфекцию. Организм начинает атаковать сам себя, поскольку воспалительная реакция охватывает организм человека. В результате высокие уровни экДНК были связаны с кровотоком, и поэтому исследователи рассматривали ДНКазу как подходящее лечение. Исследования показали, что ДНКаза успешно разрушала НЭТ и уменьшала воспалительные реакции. Для дальнейшего утверждения ДНКазы в качестве официального лечения необходимы дополнительные исследования типа и времени введения. [17] [18] [19]
Системная красная волчанка (СКВ) — это аутоиммунное заболевание , которое приводит к образованию аутоантител, вызывающих воспаление, которое приводит к повреждению органов, суставов и почек. СКВ связана с низким уровнем ДНКазы I, поскольку апоптотические клетки становятся аутоантигенами при этом заболевании. ДНКаза I была исследована как возможное лечение для уменьшения количества апоптотических остатков в организме человека. Было высказано предположение, что их трудности могут быть связаны с неспособностью фермента разрушать клеточную мембрану хроматина . Исследования показали противоречивые результаты по этому лечению, однако проводятся дальнейшие исследования для изучения терапевтических преимуществ ДНКазы I. [14] [18] [20]
Противоопухолевое лечение. Известно, что ДНКаза обладает противоопухолевым действием благодаря своей способности расщеплять ДНК. В крови больных раком обнаружены высокие уровни ДНК, что позволяет предположить, что ДНКаза I может быть возможным лечением. До сих пор нет понимания того, почему существуют такие высокие уровни экДНК и будет ли ДНКаза действовать как эффективное лечение. Несколько исследований на мышах показали положительные результаты в противоопухолевой прогрессии с использованием внутривенной ДНКазы I. Однако необходимо провести больше исследований, прежде чем представить их публике. [21] [14]
ДНК поглощает ультрафиолетовый (УФ) свет с длиной волны максимального поглощения около 260 нм. Это поглощение обусловлено пи-электронами в ароматических основаниях ДНК. В двуцепочечной ДНК или даже в областях РНК , где встречается двухцепочечная структура, основания укладываются параллельно друг другу, и перекрытие молекулярных орбиталей оснований приводит к уменьшению поглощения УФ-света. Это явление называется гипохромным эффектом . Когда ДНКаза высвобождает нуклеотиды из двуцепочечной ДНК, основания больше не укладываются так, как в двуцепочечной ДНК, так что перекрытие орбиталей сводится к минимуму, а поглощение УФ-излучения увеличивается. Это увеличение поглощения лежит в основе единицы Кунитца активности ДНКазы. Одна единица Куница определяется как количество фермента, добавленного к 1 мг/мл ДНК спермы лосося, которое вызывает увеличение поглощения на 0,001 в минуту на длине волны 260 нм при воздействии на высокополимеризованную ДНК при 25 °C в буфере 0,1 M NaOAc (pH 5,0). Название единицы дано в честь российско-американского биохимика Моисея Куница , который предложил стандартный тест в 1946 году. [22]
Стандартный ферментный препарат следует проводить параллельно с неизвестным, поскольку стандартизация препаратов ДНК и степени их полимеризации в растворе невозможна.
Single Radial Enzyme Diffusion (SRED) Этот простой метод измерения активности ДНКазы I был предложен Надано и др. и основан на переваривании ДНК в агарозном геле ДНКазой, которая присутствует в образцах, пробитых в гель. [14] Активность ДНКазы представлена размером распределенной круглой лунки в слое агарозного геля, в которой ДНК, окрашенная бромистым этидием, равномерно распределена. После инкубации образуется круглая темная зона, поскольку фермент диффундирует из лунки радиально в гель и расщепляет ДНК. SRED претерпел множество модификаций, которые привели к повышению чувствительности и безопасности, таких как замена бромистого этидия на SYBR Green I или другие красители геля ДНК. [23]
Колориметрический анализ активности ДНКазы I
Кинетический колориметрический анализ активности ДНКазы I разработан для оценки стабильности человеческой рекомбинантной ДНКазы I (Пульмозим). Метод был скорректирован с колориметрического анализа конечной точки активности фермента, основанного на деградации комплекса ДНК/метиловый зеленый. [24]
{{cite book}}
: |work=
проигнорировано ( помощь )