stringtranslate.com

Дезоксирибонуклеаза

Дезоксирибонуклеаза ( сокращенно ДНКаза ) относится к группе гликопротеиновых эндонуклеаз , которые являются ферментами , катализирующими гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в остове ДНК , тем самым разрушая ДНК. Роль фермента ДНКазы в клетках включает разрушение внеклеточной ДНК (вкДНК), выделяемой при апоптозе , некрозе и нейтрофильных внеклеточных ловушках (НЭТ) клеток, чтобы помочь уменьшить воспалительные реакции, которые в противном случае были бы вызваны. Известно большое разнообразие дезоксирибонуклеаз, которые относятся к одному из двух семейств ( ДНКаза I или ДНКаза II ), которые различаются по своей субстратной специфичности, химическим механизмам и биологическим функциям. Лабораторные применения ДНКазы включают очистку белков при извлечении из прокариотических организмов. Кроме того, ДНКаза применялась в качестве лечения заболеваний, которые вызываются вкДНК в плазме крови. Анализы ДНКазы также появляются в области исследований.

Типы

Два основных типа ДНКазы, обнаруженных у животных , известны как дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I) и дезоксирибонуклеаза II (ДНКаза II). Эти два семейства имеют подкатегории внутри себя.

Семейство ДНКазы I: ДНКаза I, ДНКаза1L1, ДНКаза 1L2, ДНКаза1L3

Первый набор ДНКаз — ДНКаза I. Это семейство состояло из ДНКазы I, ДНКазы1L1 , ДНКазы 1L2 и ДНКазы1L3 . ДНКаза I расщепляет ДНК с образованием двух олигонуклеотидных конечных продуктов с 5'-фосфо- и 3'-гидроксиконцами и вырабатывается в основном органами пищеварительной системы . Семейство ДНКаз I требует катионов Ca2+ и Mg2+ в качестве активаторов и селективно экспрессируется. [1] Что касается pH, то семейство ДНКаз I активно при нормальном pH около 6,5–8.

Семейство ДНКазы II: ДНКаза II α и ДНКаза II β

Второй набор ДНКаз — ДНКаза II. Это семейство состоит из ДНКазы II α и ДНКазы II β. Как и ДНКаза I, ДНКаза II расщепляет ДНК с образованием двух олигонуклеотидных конечных продуктов с 5'-гидрокси и 3'-фосфо концами. Этот тип ДНКазы более широко экспрессируется в тканях из-за высокой экспрессии в макрофагах, но ограниченной экспрессии в типах клеток. В отличие от ДНКазы I, им не нужны катионы Ca2+ и Mg2+ в качестве активаторов. [2] Что касается pH , семейство ДНКазы II экспрессируется при кислом pH. Характер расщепления ДНКазы II изменяется в присутствии диметилсульфоксида ( ДМСО ), который существенно влияет на структуру ДНК.

Структура

Хотя ДНКаза I и ДНКаза II являются гликопротеиновыми эндонуклеазами, ДНКаза I имеет мономерную сэндвичевую структуру с углеводной боковой цепью, тогда как ДНКаза II имеет димерную четвертичную структуру .

Трехмерная структура гликопротеиновой ДНКазы I PDB: 3DNI

Структура ДНКазы I: ДНКаза I представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 30 000 Да и углеводной цепью из 8-10 остатков, прикрепленной к Asn18 (оранжевый). [3] Это 𝛼,𝛽-белок с двумя 6-цепочечными 𝛽-складчатыми слоями, которые образуют ядро ​​структуры. [4] Эти два основных слоя идут параллельно, а все остальные идут антипараллельно. 𝛽-складчатые слои лежат в центре структуры, в то время как 𝛼-спирали обозначены катушками на периферии. ДНКаза I содержит четыре ион-связывающих кармана и требует Ca 2+ и Mg 2+ для гидролиза двухцепочечной ДНК. [5] Два из участков прочно связывают Ca 2+, в то время как два других координируют Mg 2+ . О количестве и местоположении участков связывания Mg 2+ опубликовано немного , хотя было высказано предположение, что Mg 2+ расположен вблизи каталитического кармана и способствует гидролизу. [6] Два Ca 2+ показаны на изображении красным цветом. Они связаны с ДНКазой I в условиях кристаллизации и важны для структурной целостности молекулы, стабилизируя поверхностную петлю Asp198 до Thr204 (голубой) и ограничивая область высокой тепловой подвижности в гибкой петле остатками Gly97 до Gly102 (желтый).

Трехмерная структура гликопротеиновой ДНКазы II PDB: 5UNB

Структура ДНКазы II: ДНКаза II содержит гомодимерную четвертичную структуру, которая способна связывать двухцепочечную ДНК в архитектуре U-образного зажима. Внутренняя часть U-образного зажима в значительной степени электроположительна, способна связывать отрицательно заряженную ДНК. Подобно ДНКазе I, структура ДНКазы II состоит из смешанной вторичной структуры 𝛼/𝛽 с 9 𝛼-спиралями и 20 𝛽-складчатыми листами. [7] Хотя в отличие от ДНКазы I, ДНКазе II не требуются двухвалентные ионы металлов для катализа. [7] Структура состоит из протомера A (голубой) и протомера B (зеленый). Каждая структура состоит из двух каталитических мотивов, которые для простоты помечены на протомере B: His100 и Lys102 составляют первый мотив (синий), а His279 и Lys281 составляют второй каталитический мотив (красный).

Механизм действия ферментов ДНКазы

Механизм

Некоторые ДНКазы разрезают или «расщепляют» только остатки на концах молекул ДНК. Этот тип экзонуклеаз известен как экзодезоксирибонуклеазы . Другие расщепляют в любом месте цепи, известные как эндодезоксирибонуклеазы (подмножество эндонуклеаз ). [8] Некоторые ДНКазы довольно неразборчивы в отношении последовательности ДНК , по которой они разрезают, в то время как другие, включая ферменты рестрикции , очень специфичны к последовательности. Другие ДНКазы расщепляют только двухцепочечную ДНК , другие специфичны для одноцепочечных молекул, а третьи активны по отношению к обеим.

Действие ДНКазы происходит в три фазы. Начальная фаза вносит множественные надрезы в фосфодиэфирный остов . Вторая фаза производит кислоторастворимые нуклеотиды. Третья фаза, которая является терминальной, состоит из восстановления олигонуклеотидов, вызывая гиперхромный сдвиг в УФ-данных. [9]

Механизм ДНКазы I

ДНКаза I в основном нацелена на двухцепочечную ДНК и в меньшей степени на некоторую одноцепочечную ДНК для расщепления. ДНКаза I катализирует неспецифическое расщепление ДНК путем разрыва фосфодиэфирных связей в одной из цепей. Ее сайт расщепления находится между 3′-атомом кислорода и соседним атомом фосфора, что дает 3′-гидроксильные и 5′-фосфорильные олигонуклеотиды с инверсией конфигурации у фосфора. Фермент ДНКаза полагается на присутствие двухвалентного катиона , который обычно является Ca 2+ , для правильной функции. Активный сайт ДНКазы I включает два остатка гистидина (His134 и His252) и два кислотных остатка ( Glu 78 и Asp 212), все из которых имеют решающее значение для общего кислотно-основного катализа фосфодиэфирных связей. [10]

Механизм ДНКазы II

Дезоксирибонуклеаза II (ДНКаза II) также известна как кислая дезоксирибонуклеаза, поскольку она имеет оптимальную активность в среде лизосом с низким pH, где она обычно встречается у высших эукариот. Некоторые формы рекомбинантной ДНКазы II демонстрируют высокий уровень активности при низком pH в отсутствие ионов двухвалентных металлов, подобно эукариотической ДНКазе II. [7] В отличие от ДНКазы I, ДНКаза II расщепляет фосфодиэфирную связь между 5'-атомом кислорода и соседним атомом фосфора, давая 3΄-фосфорилированные и 5΄-гидроксильные нуклеотиды.

Приложения

Лабораторные приложения

ДНКаза обычно используется при очистке белков, которые извлекаются из прокариотических организмов. Извлечение белка часто включает в себя деградацию клеточной мембраны . Обычно деградированная и хрупкая клеточная мембрана лизируется , высвобождая нежелательную ДНК и желаемые белки. Полученный экстракт ДНК-белка очень вязкий и его трудно очистить, в этом случае для его расщепления добавляют ДНКазу. [11] ДНК гидролизуется , но белки не затрагиваются, и экстракт может подвергаться дальнейшей очистке.

Уход

Внеклеточная ДНК (вкДНК) — это ДНК, которая находится в кровотоке. Она появляется в результате апоптоза , некроза или нейтрофильных внеклеточных ловушек (НЭТ)-оза клеток крови и тканей, но также может возникать в результате активной секреции из живых клеток. ВкДНК и их назначенные ДНК-связывающие белки способны активировать ДНК-чувствительные рецепторы, рецепторы распознавания образов (ПРР). ПРР способны стимулировать пути, которые вызывают воспалительный иммунный ответ. В результате несколько исследований воспалительных заболеваний показали, что в плазме крови наблюдаются высокие концентрации вкДНК. По этой причине ДНКаза оказалась возможным средством лечения для снижения вкДНК в плазме крови. ДНКазы могут выводиться как внутриклеточно, так и внеклеточно и могут расщеплять фосфодиэфирную связь ДНК . Эту функцию можно использовать для поддержания низкой концентрации вкДНК, тем самым леча воспаление. Заболевания, возникающие из-за остатков ДНК в крови, были направлены с использованием «разрушающих свойств» ДНКазы. Исследования показали, что ДНКаза может действовать как лечение, уменьшая вязкость слизи. [12] [13] Введение ДНКазы варьируется в зависимости от заболевания. Она может и вводилась перорально , внутриплеврально, внутривенно , внутрибрюшинно и через ингаляцию . [14] Несколько исследований продолжают изучать применение ДНКазы в качестве лечения, а также способы мониторинга здоровья. Например, недавно ДНКаза, полученная из патогенных бактерий, использовалась в качестве индикатора для мониторинга раневой инфекции. [15]

Респираторные заболевания

Муковисцидоз — это генетическое заболевание , которое влияет на выработку слизи, пота и пищеварительных жидкостей, в результате чего они становятся более вязкими, а не смазочными . Ферменты ДНКазы могут вдыхаться с помощью небулайзера больными муковисцидозом . Ферменты ДНКазы помогают, поскольку лейкоциты накапливаются в слизи и, когда они распадаются, высвобождают ДНК, что увеличивает «липкость» слизи. Ферменты ДНКазы расщепляют ДНК, и слизь намного легче выводится из легких. В частности, ДНКаза I, также известная как одобренный FDA препарат Пульмозим (также известная как дорназа альфа), используется в качестве лечения для улучшения функции легких.

Было обнаружено, что свойства ДНКаз также оказывают положительное влияние на другие респираторные заболевания , такие как астма [16] , эмпиема плевры [12] и хроническая обструктивная болезнь легких .

Кроме того, недавние исследования показывают, что внутриплевральный тканевой активатор плазминогена (tPA), белок, отвечающий за разрушение тромбов, в сочетании с дезоксирибонуклеазой усиливает плевральный дренаж, сокращает продолжительность пребывания в больнице и снижает необходимость хирургического вмешательства при парапневмонических выпотах и ​​эмпиеме .

Другие заболевания

Сепсис — это опасное для жизни воспалительное заболевание , вызванное экстремальной реакцией организма на инфекцию. Организм начинает атаковать сам себя, поскольку воспалительная реакция охватывает организм человека. В результате высокие уровни экДНК были связаны с кровотоком, и поэтому исследователи рассматривали ДНКазу как подходящее лечение. Исследования показали, что ДНКаза успешно разрушала НЭТ и уменьшала воспалительные реакции. Для дальнейшего утверждения ДНКазы в качестве официального лечения необходимы дополнительные исследования типа и времени введения. [17] [18] [19]

Системная красная волчанка (СКВ) — это аутоиммунное заболевание , которое приводит к образованию аутоантител, вызывающих воспаление, которое приводит к повреждению органов, суставов и почек. СКВ связана с низким уровнем ДНКазы I, поскольку апоптотические клетки становятся аутоантигенами при этом заболевании. ДНКаза I была исследована как возможное лечение для уменьшения количества апоптотических остатков в организме человека. Было высказано предположение, что их трудности могут быть связаны с неспособностью фермента разрушать клеточную мембрану хроматина . Исследования показали противоречивые результаты по этому лечению, однако проводятся дальнейшие исследования для изучения терапевтических преимуществ ДНКазы I. [14] [18] [20]

Противоопухолевое лечение. Известно, что ДНКаза обладает противоопухолевым действием благодаря своей способности расщеплять ДНК. В крови больных раком обнаружены высокие уровни ДНК, что позволяет предположить, что ДНКаза I может быть возможным лечением. До сих пор нет понимания того, почему существуют такие высокие уровни экДНК и будет ли ДНКаза действовать как эффективное лечение. Несколько исследований на мышах показали положительные результаты в противоопухолевой прогрессии с использованием внутривенной ДНКазы I. Однако необходимо провести больше исследований, прежде чем представить их публике. [21] [14]

Анализы

ДНК поглощает ультрафиолетовый (УФ) свет с длиной волны максимального поглощения около 260 нм. Это поглощение обусловлено пи-электронами в ароматических основаниях ДНК. В двуцепочечной ДНК или даже в областях РНК , где встречается двухцепочечная структура, основания укладываются параллельно друг другу, и перекрытие молекулярных орбиталей оснований приводит к уменьшению поглощения УФ-света. Это явление называется гипохромным эффектом . Когда ДНКаза высвобождает нуклеотиды из двуцепочечной ДНК, основания больше не укладываются так, как в двуцепочечной ДНК, так что перекрытие орбиталей сводится к минимуму, а поглощение УФ-излучения увеличивается. Это увеличение поглощения лежит в основе единицы Кунитца активности ДНКазы. Одна единица Куница определяется как количество фермента, добавленного к 1 мг/мл ДНК спермы лосося, которое вызывает увеличение поглощения на 0,001 в минуту на длине волны 260 нм при воздействии на высокополимеризованную ДНК при 25 °C в буфере 0,1 M NaOAc (pH 5,0). Название единицы дано в честь российско-американского биохимика Моисея Куница , который предложил стандартный тест в 1946 году. [22]

Стандартный ферментный препарат следует проводить параллельно с неизвестным, поскольку стандартизация препаратов ДНК и степени их полимеризации в растворе невозможна.

Single Radial Enzyme Diffusion (SRED) Этот простой метод измерения активности ДНКазы I был предложен Надано и др. и основан на переваривании ДНК в агарозном геле ДНКазой, которая присутствует в образцах, пробитых в гель. [14] Активность ДНКазы представлена ​​размером распределенной круглой лунки в слое агарозного геля, в которой ДНК, окрашенная бромистым этидием, равномерно распределена. После инкубации образуется круглая темная зона, поскольку фермент диффундирует из лунки радиально в гель и расщепляет ДНК. SRED претерпел множество модификаций, которые привели к повышению чувствительности и безопасности, таких как замена бромистого этидия на SYBR Green I или другие красители геля ДНК. [23]

Колориметрический анализ активности ДНКазы I

Кинетический колориметрический анализ активности ДНКазы I разработан для оценки стабильности человеческой рекомбинантной ДНКазы I (Пульмозим). Метод был скорректирован с колориметрического анализа конечной точки активности фермента, основанного на деградации комплекса ДНК/метиловый зеленый. [24]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Junowicz, E. (1973). «Исследования бычьей панкреатической дезоксирибонуклеазы A. II. Влияние различных двухвалентных металлов на специфичность деградации ДНК». Biochim. Biophys. Acta . 312 (1): 85–102. doi :10.1016/0005-2787(73)90054-3. PMID  4353710.
  2. ^ Ohkouchi, S.; Shibata, M; Sasaki, M; Koike, M; Safig, P; Peters, C; Nagata, S; Uchiyama, Y (2013). «Биогенез и протеолитическая обработка лизосомальной ДНКазы II». PLOS ONE . 8 (3): e59148. Bibcode : 2013PLoSO...859148O. doi : 10.1371/journal.pone.0059148 . PMC 3596287. PMID  23516607 . 
  3. ^ Сак, Д.; Офнер, К.; Кабш, В. (1984). «Трехмерная структура бычьей панкреатической ДНКазы I при разрешении 2,5 А». Журнал EMBO . 3 (10): 2423–2430. doi : 10.1002 /j.1460-2075.1984.tb02149.x. PMC 557703. PMID  6499835. 
  4. ^ wwPDB.org. "wwPDB: Всемирный банк данных по белкам". www.wwpdb.org . Получено 26.10.2022 .
  5. ^ Геру, Марк; Пико, Даниэль; Аби-Ганем, Жозефина; Хартманн, Брижит; Бааден, Марк (18.11.2010). Левитт, Майкл (ред.). «Как катионы могут помогать ДНКазе I в связывании и гидролизе ДНК». PLOS Computational Biology . 6 (11): e1001000. Bibcode : 2010PLSCB...6E1000G. doi : 10.1371/journal.pcbi.1001000 . ISSN  1553-7358. PMC 2987838. PMID 21124947  . 
  6. ^ Джонс, С.Дж.; Уорралл, А.Ф.; Коннолли, БА (1996-12-20). «Сайт-направленный мутагенез каталитических остатков бычьей панкреатической дезоксирибонуклеазы I». Журнал молекулярной биологии . 264 (5): 1154–1163. doi :10.1006/jmbi.1996.0703. ISSN  0022-2836. PMID  9000637.
  7. ^ abc Варела-Рамирес, Армандо; Абендрот, Ян; Мехия, Адриан А.; Фан, Изабель К.; Лоример, Дональд Д.; Эдвардс, Томас Э.; Агилера, Ренато Дж. (2017-06-02). «Структура кислой дезоксирибонуклеазы». Nucleic Acids Research . 45 (10): 6217–6227. doi :10.1093/nar/gkx222. ISSN  0305-1048. PMC 5449587. PMID 28369538  . 
  8. ^ Bowen RA, Austgen L, Rouge M (20 февраля 2000 г.). «Эндонуклеазы рестрикции и ферменты модификации ДНК». Нуклеазы: ДНКаза и РНКаза. Архивировано из оригинала 5 августа 2004 г. Получено 8 января 2017 г. {{cite book}}: |work=проигнорировано ( помощь )
  9. ^ Бернарди, Джорджио (1971-01-01), Бойер, Пол Д. (ред.), "11 Дезоксирибонуклеаза селезеночной кислоты", Ферменты , Гидролиз, т. 4, Academic Press, стр. 271–287, doi :10.1016/S1874-6047(08)60371-6, ISBN 9780121227043, получено 2022-10-27
  10. ^ Лазарус, Роберт А.; Вагенер†, Джеффри С. (2019), «Рекомбинантная человеческая дезоксирибонуклеаза I», Фармацевтическая биотехнология , Cham: Springer International Publishing, стр. 471–488, doi :10.1007/978-3-030-00710-2_22, ISBN 978-3-030-00709-6, ЧМЦ  7124075
  11. ^ Ninfa AJ, Ballou DP, Benore M (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии (2-е изд.). Соединенные Штаты Америки: John Wiley & Sons, Inc. стр. 234. ISBN 978-0-470-08766-4.
  12. ^ ab Simpson, G.; Roomes, D.; Heron, M. (2006). «Влияние стрептокиназы и дезоксирибонуклеазы на вязкость хирургического и эмпиэмного гноя человека». Chest . 117 (6): 1728–1733. doi :10.1378/chest.117.6.1728. ISSN  0012-3692. PMID  10858409.
  13. ^ Дж. Б. Армстронг, Дж. К. Уайт Разжижение вязких гнойных экссудатов дезоксирибонуклеазой Ланцет, 259 (1950), стр. 739-742
  14. ^ abcd Лаукова, Люсия; Конечна, Барбора; Яновичова, Любица; Влкова, Барбора; Селец, Питер (11 июля 2020 г.). «Дезоксирибонуклеазы и их применение в биомедицине». Биомолекулы . 10 (7): 1036. doi : 10.3390/biom10071036 . ISSN  2218-273X. ПМК 7407206 . ПМИД  32664541. 
  15. ^ Xiong Z, Achavananthadith S, Lian S, Madden LE, Ong ZX, Chua W и др. (2021). «Беспроводной и безбатарейный датчик раневой инфекции на основе ДНК-гидрогеля». Science Advances . 7 (47): eabj1617. Bibcode : 2021SciA....7.1617X. doi : 10.1126/sciadv.abj1617. PMC 8604401. PMID 34797719  . 
  16. ^ Бугаард, Р.; Смит, Ф.; Шорнагель, Р.; Вассен-Верберн, А.а. ПХ; Кувенберг, Дж. М.; Хеккелан, М.; Хендрикс, Т.; Фейт, SWW; Хоп, WCJ; де Йонгсте, JC; Меркус, PJFM (2008). «Рекомбинантная дезоксирибонуклеаза человека для лечения острой астмы у детей». Торакс . 63 (2): 141–146. дои : 10.1136/thx.2007.081703 . ISSN  1468-3296. PMID  17675321. S2CID  309718.
  17. ^ Чэнь, ЦиСин; Е, Лин; Цзинь, ЮйХун; Чжан, Нин; Лу, ТяньЧжэн; Цю, ЗеЛян; Цзинь, Юэ; Чэн, БаоЛи; Фан, СянМин (2012). «Циркулирующие нуклеосомы как предиктор сепсиса и дисфункции органов у пациентов в критическом состоянии». Международный журнал инфекционных заболеваний . 16 (7): e558–564. doi : 10.1016/j.ijid.2012.03.007 . ISSN  1878-3511. PMID  22609014.
  18. ^ аб Яновичова, Любица; Чонка, Йозеф; Лаукова, Люсия; Селец, Питер (01 октября 2022 г.). «Вариабельность активности эндогенной дезоксирибонуклеазы и ее патофизиологические последствия». Молекулярные и клеточные зонды . 65 : 101844. doi : 10.1016/j.mcp.2022.101844. ISSN  0890-8508. PMID  35803442. S2CID  250328196.
  19. ^ Mai, Safiah H. C†; Khan, Momina*†; Dwivedi, Dhruva J.†‡; Ross, Catherine A.§; Zhou, Ji†; Gould, Travis J†; Gross, Peter L†‡; Weitz, Jeffrey I†‡; Fox-Robichaud, Alison E†‡∥; Liaw, Patricia C†‡∥ для Канадской группы трансляционной биологии интенсивной терапии. Отсроченное, но не раннее лечение ДНКазой уменьшает повреждение органов и улучшает исход в мышиной модели сепсиса. Shock: август 2015 г. — том 44 — выпуск 2 — стр. 166–172 doi :10.1097/SHK.00000000000000396
  20. ^ Фернандо Мартинес Валле, Ева Балада, Хосеп Орди-Рос, Микель Виларделл-Таррес, ДНКаза 1 и системная красная волчанка , Обзоры аутоиммунитета, том 7, выпуск 5, 2008 г., страницы 359–363, ISSN  1568-9972, doi : 10.1016/ j.autrev.2008.02.002.
  21. ^ Трехо-Бесеррил, Каталина; Перес-Карденас, Энрике; Гутьеррес-Диас, Бланка; Де Ла Крус-Сигуэнса, Дезире; Таха-Чайеб, Люсия; Гонсалес-Баллестерос, Маурисио; Гарсиа-Лопес, Патрисия; Чанона, Хосе; Дуэньяс-Гонсалес, Альфонсо (26 июля 2016 г.). «Противоопухолевые эффекты системной ДНКазы I и протеаз в модели in vivo». Интегративная терапия рака . 15 (4): NP35–NP43. дои : 10.1177/1534735416631102. ISSN  1534-7354. PMC 5739158. PMID  27146129 . 
  22. ^ Роулетт, Русс. "К". Словарь единиц измерения . Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл . Получено 27 октября 2022 г.
  23. ^ Ясуда, Т.; Такешита, Х; Наказато, Э.; Накадзима, Т.; Хосоми, О.; Накашима, И.; Киши, К. (1998). «Измерение активности дезоксирибонуклеаз I и II с пикограммовой чувствительностью на основе флуоресценции ДНК/SYBR Green I». Anal. Biochem . 255 (2): 274–276. doi :10.1006/abio.1997.2496. PMID  9451514.
  24. ^ Хорни, DL; Вебстер, DA (1971). «Дезоксирибонуклеаза: чувствительный анализ с использованием радиальной диффузии в агарозе, содержащей комплекс метиловый зеленый-ДНК». Biochim. Biophys. Acta . 247 (1): 54–61. doi :10.1016/0005-2787(71)90806-9. PMID  4946282.

Внешние ссылки