stringtranslate.com

Двухгибридный скрининг

Обзор двухгибридного анализа, проверяющего взаимодействие двух белков, называемых здесь Bait и Prey .
A. Ген фактора транскрипции Gal4 производит двухдоменный белок ( BD и AD ), необходимый для транскрипции гена-репортера ( LacZ ).
B , C. Готовятся два белка слияния: Gal4BD+Bait и Gal4AD+Prey . Обычно ни одного из них недостаточно для инициации транскрипции (гена-репортера) в одиночку.
D. Когда производятся оба белка слияния и часть Bait первого белка слияния взаимодействует с частью Prey второго, происходит транскрипция гена-репортера.

Двухгибридный скрининг (первоначально известный как дрожжевая двухгибридная система или Y2H ) — это метод молекулярной биологии, используемый для обнаружения белок-белковых взаимодействий (ББВ) [1] и белок-ДНК-взаимодействий [2] [3] путем тестирования физических взаимодействий (таких как связывание) между двумя белками или одним белком и молекулой ДНК соответственно.

Предпосылка теста — активация нижестоящего репортерного гена (ов) путем связывания фактора транскрипции с вышестоящей активирующей последовательностью (UAS). Для двухгибридного скрининга фактор транскрипции разделяется на два отдельных фрагмента, называемых доменом связывания ДНК (DBD или часто также сокращенно BD) и активирующим доменом (AD). BD — это домен, отвечающий за связывание с UAS, а AD — это домен, отвечающий за активацию транскрипции . [1] [2] Таким образом, Y2H — это анализ комплементации белковых фрагментов .

История

Впервые предложенный Стэнли Филдсом и Ок-Кю Сонгом в 1989 году, этот метод изначально был разработан для обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием транскрипционного активатора Gal4 дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Белок Gal4 активировал транскрипцию гена, участвующего в утилизации галактозы, что легло в основу селекции. [4] С тех пор этот же принцип был адаптирован для описания многих альтернативных методов, включая некоторые, которые обнаруживают взаимодействия белок-ДНК или взаимодействия ДНК-ДНК, а также методы, которые используют другие организмы-хозяева, такие как Escherichia coli или клетки млекопитающих вместо дрожжей. [3] [5]

Основная предпосылка

Ключ к двухгибридному скринингу заключается в том, что в большинстве эукариотических факторов транскрипции активирующие и связывающие домены являются модульными и могут функционировать в непосредственной близости друг от друга без прямого связывания. [6] Это означает, что даже если фактор транскрипции разделен на два фрагмента, он все равно может активировать транскрипцию, когда два фрагмента связаны косвенно.

Наиболее распространенным подходом к скринингу является дрожжевой двугибридный анализ. При этом подходе исследователь знает, где на используемой среде (агаровые пластины) находится каждая жертва. За последнее десятилетие с использованием высокопроизводительных систем скрининга (часто с использованием роботов) были проверены миллионы потенциальных взаимодействий в нескольких организмах, и более тысяч взаимодействий были обнаружены и классифицированы в базах данных как BioGRID. [7] [8] Эта система часто использует генетически модифицированный штамм дрожжей, в котором отсутствует биосинтез определенных питательных веществ (обычно аминокислот или нуклеиновых кислот ). При выращивании на среде, в которой отсутствуют эти питательные вещества, дрожжи не выживают. Этот мутантный штамм дрожжей можно заставить включать чужеродную ДНК в форме плазмид . При дрожжевом двугибридном скрининге отдельные плазмиды приманки и добычи одновременно вводятся в мутантный штамм дрожжей или используется стратегия спаривания, чтобы получить обе плазмиды в одной клетке-хозяине. [9]

Вторым высокопроизводительным подходом является подход скрининга библиотеки. В этой установке клетки-приманки и клетки-жертвы спариваются в случайном порядке. После спаривания и отбора выживших клеток на селективной среде ученый секвенирует изолированные плазмиды, чтобы увидеть, какая добыча (последовательность ДНК) взаимодействует с использованной приманкой. Этот подход имеет более низкую скорость воспроизводимости и имеет тенденцию давать большее количество ложноположительных результатов по сравнению с матричным подходом. [9]

Плазмиды конструируются для получения белкового продукта, в котором фрагмент домена связывания ДНК (BD) слит с белком, в то время как другая плазмида конструируется для получения белкового продукта, в котором фрагмент домена активации (AD) слит с другим белком. Белок, слитый с BD, может называться белком-приманкой и обычно является известным белком, который исследователь использует для идентификации новых партнеров по связыванию. Белок, слитый с AD, может называться белком-жертвой и может быть либо отдельным известным белком, либо библиотекой известных или неизвестных белков. В этом контексте библиотека может состоять из коллекции последовательностей, кодирующих белок, которые представляют все белки, экспрессируемые в определенном организме или ткани, или могут быть получены путем синтеза случайных последовательностей ДНК. [3] Независимо от источника, они впоследствии включаются в последовательность, кодирующую белок, плазмиды, которая затем трансфицируется в клетки, выбранные для метода скрининга. [3] При использовании библиотеки этот метод предполагает, что каждая клетка трансфицирована не более чем одной плазмидой и, следовательно, каждая клетка в конечном итоге экспрессирует не более одного члена из библиотеки белков.

Если белки приманки и добычи взаимодействуют (т.е. связываются), то AD и BD фактора транскрипции связаны косвенно, что приводит AD в близость к месту начала транскрипции и может произойти транскрипция гена(ов)-репортера. Если два белка не взаимодействуют, транскрипция гена-репортера не происходит. Таким образом, успешное взаимодействие между слитым белком связано с изменением фенотипа клетки. [1]

Проблема разделения клеток, экспрессирующих белки, взаимодействующие с соответствующими белками слияния, от клеток, не взаимодействующих с ними, рассматривается в следующем разделе.

Фиксированные домены

В любом исследовании некоторые из доменов белка, которые исследуются, будут варьироваться в соответствии с целями исследования, тогда как другие домены, которые сами не исследуются, будут оставаться постоянными. Например, в двухгибридном исследовании для выбора доменов связывания ДНК, домен связывания ДНК, BD, будет варьироваться, в то время как два взаимодействующих белка, приманка и добыча, должны оставаться постоянными для поддержания сильной связи между BD и AD. Существует ряд доменов, из которых можно выбрать BD, приманку и добычу и AD, если они должны оставаться постоянными. В исследованиях взаимодействия белок-белок BD может быть выбран из любого из многих сильных доменов связывания ДНК, таких как Zif268 . [2] Частым выбором доменов приманки и добычи являются остатки 263–352 дрожжевого Gal11P с мутацией N342V [2] и остатки 58–97 дрожжевого Gal4, [2] соответственно. Эти домены могут использоваться в методах селекции как на основе дрожжей, так и бактерий, и, как известно, они прочно связываются друг с другом. [1] [2]

Выбранный AD должен быть способен активировать транскрипцию репортерного гена, используя собственный аппарат транскрипции клетки. Таким образом, разнообразие AD, доступных для использования в дрожжевых методах, может не подходить для использования в их бактериальных аналогах. AD, полученные из вируса простого герпеса, VP16 и дрожжевой Gal4 AD были успешно использованы в дрожжах [1], в то время как часть α-субъединицы РНК-полимеразы E. coli была использована в методах, основанных на E. coli . [2] [3]

В то время как домены с мощной активацией могут обеспечивать большую чувствительность к более слабым взаимодействиям, наоборот, более слабый AD может обеспечить большую строгость.

Построение экспрессионных плазмид

Для проведения двугибридного анализа или одного из его производных методов в клетку-хозяина необходимо включить ряд сконструированных генетических последовательностей. Соображения и методы, используемые при построении и доставке этих последовательностей, различаются в зависимости от потребностей анализа и организма, выбранного в качестве экспериментального фона.

Существует две широкие категории гибридных библиотек: случайные библиотеки и библиотеки на основе кДНК. Библиотека кДНК состоит из кДНК, полученной путем обратной транскрипции мРНК, собранной из определенных типов клеток. Эта библиотека может быть лигирована в конструкцию так, чтобы она была прикреплена к BD или AD, используемым в анализе. [1] Случайная библиотека использует отрезки ДНК случайной последовательности вместо этих участков кДНК. Существует ряд методов для получения этих случайных последовательностей, включая кассетный мутагенез . [2] Независимо от источника библиотеки ДНК, она лигируется в соответствующее место в соответствующей плазмиде/фагмиде с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции . [2]

кишечная палочка-конкретные соображения

Помещая гибридные белки под контроль IPTG -индуцируемых lac -промоторов , они экспрессируются только на средах, дополненных IPTG. Кроме того, путем включения различных генов устойчивости к антибиотикам в каждую генетическую конструкцию, рост нетрансформированных клеток легко предотвращается посредством культивирования на средах, содержащих соответствующие антибиотики. Это особенно важно для методов встречной селекции, в которых для выживания клеток необходимо отсутствие взаимодействия. [2]

Ген-репортер может быть вставлен в геном E. coli , если сначала вставить его в эписому , тип плазмиды, способной встраиваться в геном бактериальной клетки [2] с числом копий приблизительно одна на клетку. [10]

Гибридные экспрессирующие фагмиды могут быть электропорированы в клетки E. coli XL-1 Blue, которые после амплификации и инфицирования вспомогательным фагом VCS-M13 дадут запас библиотечного фага. Каждый из этих фагов будет содержать один одноцепочечный член библиотеки фагмид. [2]

Восстановление белковой информации

После того, как отбор выполнен, необходимо определить первичную структуру белков, которые демонстрируют соответствующие характеристики. Это достигается путем извлечения последовательностей, кодирующих белки (в том виде, в котором они были изначально вставлены) из клеток, демонстрирующих соответствующий фенотип.

кишечная палочка

Фагемида, используемая для трансформации клеток E. coli , может быть «спасена» из выбранных клеток путем инфицирования их вспомогательным фагом VCS-M13. Полученные в результате фаговые частицы содержат одноцепочечные фагмиды и используются для инфицирования клеток XL-1 Blue. [2] Двухцепочечные фагмиды впоследствии собираются из этих клеток XL-1 Blue, по сути, обращая процесс, используемый для получения исходного библиотечного фага. Наконец, последовательности ДНК определяются с помощью дидезоксисеквенирования . [2]

Контроль чувствительности

Tet-R -репрессор, полученный из Escherichia coli, может использоваться в соответствии с обычным репортерным геном и может контролироваться тетрациклином или доксициклином (ингибиторы Tet-R). Таким образом, экспрессия Tet-R контролируется стандартной двухгибридной системой, но Tet-R в свою очередь контролирует (подавляет) экспрессию ранее упомянутого репортера, такого как HIS3 , через свой Tet-R-промотор. Тетрациклин или его производные затем могут использоваться для регулирования чувствительности системы, использующей Tet-R. [1]

Чувствительность также может контролироваться путем изменения зависимости клеток от их репортерных генов. Например, на это можно повлиять, изменив концентрацию гистидина в питательной среде для клеток, зависимых от his3 , и концентрацию стрептомицина для клеток, зависимых от aadA . [2] [3] Зависимость от гена селекции также может контролироваться путем применения ингибитора гена селекции в подходящей концентрации. Например, 3-амино-1,2,4-триазол (3-AT) является конкурентным ингибитором продукта гена HIS3 и может использоваться для титрования минимального уровня экспрессии HIS3 , необходимого для роста на среде с дефицитом гистидина. [2]

Чувствительность также можно регулировать, изменяя количество последовательностей операторов в репортерной ДНК.

Неслитые белки

Третий, не слитый белок может быть ко-экспрессирован с двумя слитыми белками. В зависимости от исследования, третий белок может модифицировать один из слитых белков или опосредовать или мешать их взаимодействию. [1]

Совместная экспрессия третьего белка может быть необходима для модификации или активации одного или обоих белков слияния. Например, S. cerevisiae не обладает эндогенной тирозинкиназой. Если исследование включает белок, требующий фосфорилирования тирозина, киназа должна быть предоставлена ​​в форме гена тирозинкиназы. [1]

Неслитый белок может опосредовать взаимодействие, связывая оба слитых белка одновременно, как в случае лиганд-зависимой димеризации рецептора. [1]

Для белка с взаимодействующим партнером его функциональная гомология с другими белками может быть оценена путем поставки третьего белка в неслитой форме, который затем может или не может конкурировать с слитым белком за своего связывающего партнера. Связывание между третьим белком и другим слитым белком прервет формирование комплекса активации экспрессии репортера и, таким образом, снизит экспрессию репортера, что приведет к отличительному изменению фенотипа. [1]

Сплит-убиквитин дрожжи двугибридные

Одним из ограничений классических дрожжевых двухгибридных скринингов является то, что они ограничены растворимыми белками. Поэтому их невозможно использовать для изучения белок-белковых взаимодействий между нерастворимыми интегральными мембранными белками . Система сплит-убиквитина обеспечивает метод преодоления этого ограничения. [11] В системе сплит-убиквитина два изучаемых интегральных мембранных белка сливаются с двумя различными фрагментами убиквитина : С-концевым фрагментом убиквитина («Cub», остатки 35–76) и N-концевым фрагментом убиквитина («Nub», остатки 1–34). Эти слитые белки называются приманкой и добычей соответственно. Помимо слияния с интегральным мембранным белком, фрагмент Cub также сливается с фактором транскрипции (TF), который может быть отщеплен специфичными для убиквитина протеазами . При взаимодействии приманки и добычи Nub и Cub-фрагменты собираются, восстанавливая расщепленный убиквитин. Восстановленная молекула расщепленного убиквитина распознается специфичными для убиквитина протеазами, которые расщепляют фактор транскрипции, позволяя ему индуцировать транскрипцию репортерных генов . [12]

Флуоресцентный двухгибридный анализ

Золгхадр и его коллеги представили флуоресцентную двухгибридную систему, которая использует два гибридных белка, которые слиты с разными флуоресцентными белками, а также с LacI, lac-репрессором . Структура белков слияния выглядит следующим образом: FP2-LacI-приманка и FP1-добыча, где белки приманки и добычи взаимодействуют и приближают флуоресцентные белки (FP1 = GFP , FP2 = mCherry ) в непосредственной близости к сайту связывания белка LacI в геноме клетки-хозяина. [13] Систему также можно использовать для скрининга ингибиторов белок-белковых взаимодействий. [14]

Ферментативные двухгибридные системы: KISS

В то время как исходная система Y2H использовала реконструированный фактор транскрипции, другие системы создают ферментативные активности для обнаружения PPI. Например, KInase Substrate Sensor («KISS») — это двугибридный подход млекопитающих, разработанный для картирования внутриклеточных PPI. Здесь белок-приманка сливается с частью TYK2, содержащей киназу , а добыча соединяется с фрагментом рецептора цитокина gp130 . Когда приманка и добыча взаимодействуют, TYK2 фосфорилирует сайты стыковки STAT3 на химере добычи, что в конечном итоге приводит к активации репортерного гена . [15]

Одно-, трех- и одно-двухгибридные варианты

Одногибридный

Одногибридная вариация этой техники предназначена для исследования взаимодействий белок-ДНК и использует один слитый белок, в котором AD напрямую связан с доменом связывания. Однако домен связывания в этом случае не обязательно имеет фиксированную последовательность, как в двухгибридном анализе белок-белок, а может быть образован библиотекой. Эта библиотека может быть выбрана в соответствии с желаемой целевой последовательностью, которая вставлена ​​в область промотора конструкции гена-репортера. В системе положительного отбора таким образом выбирается домен связывания, который успешно связывает UAS и позволяет транскрипцию. [1]

Обратите внимание, что выбор доменов связывания ДНК не обязательно выполняется с использованием одногибридной системы, но может также выполняться с использованием двухгибридной системы, в которой домен связывания варьируется, а белки приманки и добычи остаются постоянными. [2] [3]

Три-гибридный

Обзор трехгибридного анализа.

Взаимодействия РНК-белок были исследованы с помощью трехгибридной вариации двухгибридной техники. В этом случае гибридная молекула РНК служит для соединения двух доменов слияния белков, которые не предназначены для взаимодействия друг с другом, а скорее с промежуточной молекулой РНК (через их домены связывания РНК). [1] Методы, включающие негибридные белки, которые выполняют схожую функцию, как описано в разделе «негибридные белки» выше, также могут называться трехгибридными методами.

Один-два-гибрида

Одновременное использование одно- и двухгибридных методов (то есть одновременного взаимодействия белок-белок и белок-ДНК) известно как одно-двухгибридный подход и, как ожидается, повысит строгость скрининга. [1]

Организм-хозяин

Хотя теоретически любая живая клетка может быть использована в качестве фона для двухгибридного анализа, существуют практические соображения, которые диктуют, что именно следует выбрать. Выбранная линия клеток должна быть относительно дешевой и простой в культивировании и достаточно прочной, чтобы выдерживать применение исследовательских методов и реагентов. [1] Последнее особенно важно для проведения высокопроизводительных исследований . Поэтому дрожжи S. cerevisiae были основным организмом-хозяином для двухгибридных исследований. Однако это не всегда идеальная система для изучения взаимодействующих белков из других организмов. [16] Дрожжевые клетки часто не имеют одинаковых посттрансляционных модификаций, имеют разное использование кодонов или не имеют определенных белков, которые важны для правильной экспрессии белков. Чтобы справиться с этими проблемами, было разработано несколько новых двухгибридных систем. В зависимости от используемой системы для выращивания клеток и обеспечения отбора для взаимодействия используются агаровые пластины или определенная среда роста. Наиболее распространенным используемым методом является метод агарового посева, при котором клетки высеваются на селективную среду, чтобы увидеть, происходит ли взаимодействие. Клетки, не имеющие взаимодействующих белков, не должны выживать на этой селективной среде. [7] [17]

S. cerevisiae(дрожжи)

Дрожжи S. cerevisiae были модельным организмом, использованным при создании двухгибридной техники. Она широко известна как система Y2H. Она обладает несколькими характеристиками, которые делают ее надежным организмом для взаимодействия, включая способность образовывать третичные белковые структуры, нейтральный внутренний pH, повышенную способность образовывать дисульфидные связи и восстановленный глутатион среди других факторов цитозольного буфера для поддержания гостеприимной внутренней среды. [1] Моделью дрожжей можно манипулировать с помощью немолекулярных методов, и известна ее полная последовательность генома. [1] Дрожжевые системы устойчивы к различным условиям культивирования и агрессивным химикатам, которые нельзя применять к культурам тканей млекопитающих. [1]

Ряд штаммов дрожжей были созданы специально для скрининга Y2H, например, Y187 [18] и AH109 , ​​[19] оба производятся Clontech . Также использовались штаммы дрожжей R2HMet и BK100. [20]

Кандида альбиканс

C. albicans — это дрожжи с особой особенностью: они транслируют кодон CUG в серин, а не в лейцин. Из-за этого различного использования кодонов сложно использовать модельную систему S. cerevisiae в качестве Y2H для проверки белок-белковых взаимодействий с использованием генов C. albicans . Чтобы обеспечить более нативную среду,была разработана двугибридная (C2H) система C. albicans . С помощью этой системы белок-белковые взаимодействия можно изучать в самом C. albicans . [21] [22] Недавним дополнением стало создание высокопроизводительной системы. [23] [24] [25]

кишечная палочка

Бактериальные двухгибридные методы (B2H или BTH) обычно применяются в E. coli и имеют некоторые преимущества по сравнению с системами на основе дрожжей. Например, более высокая эффективность трансформации и более высокая скорость роста позволяют E. coli использовать более крупные библиотеки (более 10 8 ). [2] Отсутствие необходимости включения сигнала ядерной локализации в последовательность белка и возможность изучать белки, которые были бы токсичны для дрожжей, также могут быть основными факторами, которые следует учитывать при выборе экспериментального фонового организма. [2]

Метилирующая активность некоторых белков метилтрансферазы ДНК E. coli может мешать некоторым выборам связывающих ДНК белков. Если это ожидается, то использование штамма E. coli , дефектного для определенной метилтрансферазы, может быть очевидным решением. [2] B2H может быть не идеальным при изучении эукариотических белок-белковых взаимодействий (например, человеческих белков), поскольку белки могут не сворачиваться, как в эукариотических клетках, или могут не иметь другой обработки.

Клетки млекопитающих

В последние годы была разработана система млекопитающих с двумя гибридами (M2H) для изучения белок-белковых взаимодействий млекопитающих в клеточной среде, которая точно имитирует нативную белковую среду. [26] В этой системе используются транзиторно трансфицированные клетки млекопитающих для поиска белок-белковых взаимодействий. [27] [28] Использование линии клеток млекопитающих для изучения белок-белковых взаимодействий млекопитающих дает преимущество работы в более нативном контексте. [5] Посттрансляционные модификации, фосфорилирование, ацилирование и гликозилирование аналогичны. Внутриклеточная локализация белков также более правильная по сравнению с использованием дрожжевой двухгибридной системы. [29] [30] С помощью двугибридной системы млекопитающих также можно изучать входные сигналы. [31] Еще одним большим преимуществом является то, что результаты могут быть получены в течение 48 часов после трансфекции. [5]

Arabidopsis thaliana

В 2005 году была разработана двухгибридная система в растениях. Используя протопласты A. thaliana, можно изучать белок-белковые взаимодействия в растениях. Таким образом, взаимодействия можно изучать в их нативном контексте. В этой системе GAL4 AD и BD находятся под контролем сильного промотора 35S. Взаимодействие измеряется с помощью репортера GUS. Для обеспечения высокопроизводительного скрининга векторы были сделаны совместимыми с шлюзом. Система известна как система двухгибридных протопластов (P2H). [32]

Аплизия калифорнийская

Морской заяц A californica является модельным организмом в нейробиологии для изучения, среди прочего, молекулярных механизмов долговременной памяти. Для изучения взаимодействий, важных в неврологии, в более естественной среде была разработана двухгибридная система в нейронах A californica . В этой системе используются A GAL4 AD и BD. [33] [34]

Тутовый шелкопряд

Система двугибридного насекомого (I2H) была разработана в клеточной линии шелкопряда из личинки или гусеницы одомашненного шелкопряда Bombyx mori (клетки BmN4). Эта система использует GAL4 BD и домен активации мышиного NF-κB P65. Оба находятся под контролем промотора OpIE2. [35]

Приложения

Определение последовательностей, имеющих решающее значение для взаимодействия

Изменяя определенные аминокислоты путем мутации соответствующих пар оснований ДНК в используемых плазмидах, можно определить важность этих аминокислотных остатков в поддержании взаимодействия. [1]

После использования метода на основе бактериальных клеток для отбора ДНК-связывающих белков необходимо проверить специфичность этих доменов, поскольку существует предел тому, в какой степени геном бактериальной клетки может действовать как поглотитель для доменов со сродством к другим последовательностям (или, по сути, общим сродством к ДНК). [2]

Открытие наркотиков и ядов

Взаимодействия белок-белковой сигнализации представляют собой подходящие терапевтические цели из-за их специфичности и всепроникаемости. Подход случайного открытия лекарств использует банки соединений, которые включают случайные химические структуры, и требует высокопроизводительного метода для проверки этих структур в их предполагаемой цели. [1] [17]

Клетка, выбранная для исследования, может быть специально сконструирована так, чтобы отражать молекулярный аспект, который исследователь намерен изучить, а затем использоваться для идентификации новых терапевтических средств для человека или животных или средств против вредителей. [1] [17]

Определение функции белка

Путем определения партнеров по взаимодействию неизвестных белков можно сделать вывод о возможных функциях этих новых белков. [1] Это можно сделать, используя один известный белок против библиотеки неизвестных белков или наоборот, выбрав из библиотеки известных белков один белок с неизвестной функцией. [1]

Выбор белка цинкового пальца

Для отбора белков цинковых пальцев (ZFP) для белковой инженерии с успехом использовались методы, адаптированные из техники двухгибридного скрининга. [2] [3] ZFP сам по себе является ДНК-связывающим белком, используемым для построения индивидуальных ДНК-связывающих доменов, которые связываются с желаемой последовательностью ДНК. [36]

Используя ген отбора с желаемой целевой последовательностью, включенной в UAS, и рандомизируя соответствующие аминокислотные последовательности для получения библиотеки ZFP, можно выбрать клетки, которые содержат взаимодействие ДНК-ZFP с требуемыми характеристиками. Каждый ZFP обычно распознает только 3–4 пары оснований, поэтому для предотвращения распознавания участков за пределами UAS рандомизированный ZFP конструируется в «каркас», состоящий из еще двух ZFP постоянной последовательности. Таким образом, UAS разработан для включения целевой последовательности постоянного каркаса в дополнение к последовательности, для которой выбран ZFP. [2] [3]

С помощью этой системы можно также исследовать ряд других доменов связывания ДНК. [2]

Сильные стороны

Слабые стороны

Причина столь высокого уровня ошибок кроется в характеристиках экрана:

Каждый из этих пунктов в отдельности может привести к ложным результатам. Из-за совокупного воздействия всех источников ошибок дрожжевые двугибридные следует интерпретировать с осторожностью. Вероятность генерации ложноположительных результатов означает, что все взаимодействия должны быть подтверждены высоконадежным анализом, например, коиммунопреципитацией эндогенных белков, что сложно для крупномасштабных данных белок-белкового взаимодействия. В качестве альтернативы данные Y2H можно проверить с помощью нескольких вариантов Y2H [38] или методов биоинформатики. Последние проверяют, экспрессируются ли взаимодействующие белки одновременно, имеют ли некоторые общие черты (например, аннотации онтологии генов или определенные топологии сетей ), имеют ли гомологичные взаимодействия в других видах. [39]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcdefghijklmnopqrstu vw Young KH (февраль 1998). «Двугибридные дрожжи: так много взаимодействий, (за) так мало времени». Biology of Reproduction . 58 (2): 302–11. doi : 10.1095/biolreprod58.2.302 . PMID  9475380.
  2. ^ abcdefghijklmnopqrstu vwx Joung JK, Ramm EI, Pabo CO (июнь 2000 г.). «Бактериальная двухгибридная система отбора для изучения белок-ДНК и белок-белковых взаимодействий». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 97 (13): 7382–7. Bibcode : 2000PNAS...97.7382J. doi : 10.1073/pnas.110149297 . PMC 16554. PMID  10852947 . 
  3. ^ abcdefghi Hurt JA, Thibodeau SA, Hirsh AS, Pabo CO, Joung JK (октябрь 2003 г.). «Высокоспецифичные белки цинковых пальцев, полученные путем направленной перетасовки доменов и клеточного отбора». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 100 (21): 12271–6. Bibcode : 2003PNAS..10012271H. doi : 10.1073/pnas.2135381100 . PMC 218748. PMID  14527993 . 
  4. ^ Fields S, Song O (июль 1989). "Новая генетическая система для обнаружения белок-белковых взаимодействий". Nature . 340 (6230): 245–6. Bibcode :1989Natur.340..245F. doi :10.1038/340245a0. PMID  2547163. S2CID  4320733.Аннотация предоставляется бесплатно; полный текст статьи — платный.
  5. ^ abc Luo Y, Batalao A, Zhou H, Zhu L (февраль 1997 г.). «Двугибридная система млекопитающих: дополнительный подход к двугибридной системе дрожжей». BioTechniques . 22 (2): 350–2. doi : 10.2144/97222pf02 . PMID  9043710.
  6. ^ Verschure PJ, Visser AE, Rots MG (2006). Step out of the Groove: Epigenetic Gene Control Systems and Engineered Transcription Factors . Advances in Genetics. Vol. 56. pp. 163–204. doi :10.1016/S0065-2660(06)56005-5. ISBN 9780120176564. PMID  16735158. [ мертвая ссылка ‍ ]
  7. ^ ab Brückner A, Polge C, Lentze N, Auerbach D, Schlattner U (июнь 2009 г.). «Двугибридные дрожжи — мощный инструмент для системной биологии». International Journal of Molecular Sciences . 10 (6): 2763–88. doi : 10.3390/ijms10062763 . PMC 2705515. PMID  19582228 . 
  8. ^ Gietz RD, Triggs-Raine B, Robbins A, Graham KC, Woods RA (июль 1997 г.). «Идентификация белков, взаимодействующих с интересующим белком: применение дрожжевой двугибридной системы». Молекулярная и клеточная биохимия . 172 (1–2): 67–79. doi :10.1023/A:1006859319926. PMID  9278233. S2CID  32413316.
  9. ^ abcd Auerbach D, Stagljar I (2005). "Двугибридные сети белок-белкового взаимодействия дрожжей". Протеомика и белок-белковые взаимодействия . Обзоры белков. Том 3. С. 19–31. doi :10.1007/0-387-24532-4_2. ISBN 978-0-387-24531-7. S2CID  82470771.
  10. ^ Whipple FW (август 1998). « Генетический анализ прокариотических и эукариотических ДНК-связывающих белков в Escherichia coli». Nucleic Acids Research . 26 (16): 3700–6. doi :10.1093/nar/26.16.3700. PMC 147751. PMID  9685485. 
  11. ^ Stagljar I, Korostensky C, Johnsson N, te Heesen S (апрель 1998 г.). «Генетическая система на основе сплит-убиквитина для анализа взаимодействий между мембранными белками in vivo». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (9): 5187–92. Bibcode : 1998PNAS...95.5187S. doi : 10.1073/pnas.95.9.5187 . PMC 20236. PMID  9560251 . 
  12. ^ Snider J, Kittanakom S, Curak J, Stagljar I (февраль 2010 г.). «Двугибридная (MYTH) система мембранных дрожжей на основе сплит-убиквитина: мощный инструмент для идентификации белок-белковых взаимодействий». Journal of Visualized Experiments (36). doi : 10.3791/1698. PMC 2818708. PMID  20125081 . 
  13. ^ Zolghadr K, Mortusewicz O, Rothbauer U, Kleinhans R, Goehler H, Wanker EE, Cardoso MC, Leonhardt H (ноябрь 2008 г.). «Флуоресцентный двухгибридный анализ для прямой визуализации белковых взаимодействий в живых клетках». Molecular & Cellular Proteomics . 7 (11): 2279–87. doi : 10.1074/mcp.M700548-MCP200 . PMID  18622019.
  14. ^ Юрлова Л., Деркс М., Бухфельнер А., Хиксон И., Янссен М., Моррисон Д., Стэнсфилд И., Браун К.Дж., Гадесси Ф.Дж., Лейн Д.П., Ротбауэр У., Золгад К., Крауз Э. (апрель 2014 г.). «Флуоресцентный двухгибридный анализ для скрининга ингибиторов белок-белкового взаимодействия в живых клетках: нацеливание на взаимодействие p53 с Mdm2 и Mdm4». Журнал биомолекулярного скрининга . 19 (4): 516–25. doi : 10.1177/1087057113518067 . PMID  24476585.
  15. ↑ Ливенс С., Герло С., Лемменс I, Де Клерк DJ, Риссеу М.Д., Вандеррост Н., Де Смет А.С., Рюйсинк Е., Чевет Э., Ван Каленберг С., Тавернье Дж. (декабрь 2014 г.). «Сенсор субстрата киназы (KISS), датчик взаимодействия белков in situ млекопитающих». Молекулярная и клеточная протеомика . 13 (12): 3332–42. дои : 10.1074/mcp.M114.041087 . ПМЦ 4256487 . ПМИД  25154561. 
  16. ^ Stynen B, Tournu H, Tavernier J, Van Dijck P (июнь 2012 г.). «Разнообразие генетических методов in vivo для исследований взаимодействия белок-белок: от дрожжевой двухгибридной системы до системы сплит-люциферазы млекопитающих». Microbiology and Molecular Biology Reviews . 76 (2): 331–82. doi :10.1128/MMBR.05021-11. PMC 3372256 . PMID  22688816. 
  17. ^ abc Hamdi A, Colas P (февраль 2012 г.). «Двугибридные методы дрожжей и их применение в разработке лекарств». Trends in Pharmacological Sciences . 33 (2): 109–18. doi :10.1016/j.tips.2011.10.008. PMID  22130009.
  18. ^ Fromont-Racine M, Rain JC, Legrain P (июль 1997). «К функциональному анализу генома дрожжей посредством исчерпывающего двухгибридного скрининга». Nature Genetics . 16 (3): 277–82. doi :10.1038/ng0797-277. PMID  9207794. S2CID  32591856.
  19. ^ Lu L, Horstmann H, Ng C, Hong W (декабрь 2001 г.). «Регулирование структуры и функции аппарата Гольджи с помощью ARF-подобного белка 1 (Arl1)». Journal of Cell Science . 114 (Pt 24): 4543–55. doi :10.1242/jcs.114.24.4543. PMID  11792819.
  20. ^ Хадка С., Вангелофф А.Д., Чжан С., Сиддаватам П., Хитон Н.С., Ван Л., Сенгупта Р., Сахасрабуде С., Рэндалл Г., Грибсков М., Кун Р.Дж., Перера Р., LaCount DJ (декабрь 2011 г.). «Сеть физического взаимодействия вируса денге и белков человека». Молекулярная и клеточная протеомика . 10 (12): М111.012187. дои : 10.1074/mcp.M111.012187 . ПМК 3237087 . ПМИД  21911577. 
  21. ^ Шотерс, Флорис; Ван Дейк, Патрик (7 августа 2019 г.). «Белко-белковые взаимодействия у Candida albicans». Границы микробиологии . 10 : 1792. дои : 10.3389/fmicb.2019.01792 . ПМК 6693483 . ПМИД  31440220. 
  22. ^ Стайнен Б., Ван Дейк П., Турню Х. (октябрь 2010 г.). «Кодон CUG адаптирован к двухгибридной системе патогенного гриба Candida albicans». Исследования нуклеиновых кислот . 38 (19): e184. дои : 10.1093/nar/gkq725. ПМЦ 2965261 . ПМИД  20719741. 
  23. ^ Schoeters, Floris; Munro, Carol A.; d'Enfert, Christophe; Van Dijck, Patrick; Mitchell, Aaron P. (22 августа 2018 г.). «Высокопроизводительная двухгибридная система». mSphere . 3 (4). doi :10.1128/mSphere.00391-18. PMC 6106057 . PMID  30135223. 
  24. ^ Легран, Мелани; Башелье-Басси, Софи; Ли, Кеунсук К.; Чаудхари, Йогеш; Турню, Элен; Арбогаст, Лоуренс; Бойер, Элен; Шовель, Мюриэль; Кабрал, Витор; Мофрэ, Коринн; Нессейр, Одри; Масланка, Ирена; Пермаль, Эммануэль; Россиньоль, Тристан; Уокер, Луиза А; Зейдлер, Юте; Знайди, Садри; Шотерс, Флорис; Мажье, Шарлотта; Жюльен, Рено А; Ма, Лоуренс; Тичит, Магали; Бушье, Кристиан; Ван Дейк, Патрик; Манро, Кэрол А; д'Энфер, Кристоф (10 августа 2018 г.). "Создание геномных платформ для изучения патогенеза Candida albicans" (PDF) . Nucleic Acids Research . 46 (16): 8664. doi :10.1093/nar/gky747. PMC 6144791 . PMID  30107554. 
  25. ^ Шотерс, Флорис; Ван Дейк, Патрик (2019). «Белко-белковые взаимодействия у Candida albicans». Границы микробиологии . 10 : 1792. дои : 10.3389/fmicb.2019.01792 . ISSN  1664-302X. ПМК 6693483 . ПМИД  31440220. 
  26. ^ Двухгибридная система млекопитающих CheckMateTM promega.com
  27. ^ Feng XH, Derynck R (2001). «Двухгибридные анализы млекопитающих: анализ белок-белковых взаимодействий в сигнальном пути трансформирующего фактора роста-β». Двугибридные системы . Т. 177. С. 221–239. doi :10.1385/1-59259-210-4:221. ISBN 978-1-59259-210-4. PMID  11530609.
  28. ^ ab Deane CM, Salwiński Ł, Xenarios I, Eisenberg D (май 2002 г.). «Взаимодействия белков: два метода оценки надежности высокопроизводительных наблюдений». Molecular & Cellular Proteomics . 1 (5): 349–56. doi : 10.1074/mcp.M100037-MCP200 . PMID  12118076.
  29. ^ Buckholz RG, Gleeson MA (ноябрь 1991 г.). «Дрожжевые системы для коммерческого производства гетерологичных белков». Bio/Technology . 9 (11): 1067–72. doi :10.1038/nbt1191-1067. PMID  1367623. S2CID  31597609.
  30. ^ Fagan R, Flint KJ, Jones N (сентябрь 1994 г.). «Фосфорилирование E2F-1 модулирует его взаимодействие с продуктом гена ретинобластомы и аденовирусным белком E4 19 кДа». Cell . 78 (5): 799–811. doi :10.1016/s0092-8674(94)90522-3. PMID  8087847. S2CID  22888513.
  31. ^ Лю, Цзюнь О. (1998). «Все, что вам нужно знать о дрожжевой двугибридной системе». Nature Structural Biology . 5 (7): 535–536. doi :10.1038/788. S2CID  37127696.
  32. ^ Ehlert A, Weltmeier F, Wang X, Mayer CS, Smeekens S, Vicente-Carbajosa J, Dröge-Laser W (июнь 2006 г.). "Анализ взаимодействия двух гибридных белков в протопластах Arabidopsis: создание карты гетеродимеризации факторов транскрипции bZIP группы C и группы S". The Plant Journal . 46 (5): 890–900. doi : 10.1111/j.1365-313X.2006.02731.x . PMID  16709202.
  33. ^ Choi JH, Lee JA, Yim SW, Lim CS, Lee CH, Lee YD, Bartsch D, Kandel ER, Kaang BK (2003). «Использование двухгибридной системы аплизии для изучения взаимодействий между факторами транскрипции, участвующими в долгосрочном облегчении нервной системы аплизии». Обучение и память . 10 (1): 40–3. doi :10.1101/lm.55303. PMC 196654. PMID 12551962  . 
  34. ^ Lee JA, Lee SH, Lee C, Chang DJ, Lee Y, Kim H, Cheang YH, Ko HG, Lee YS, Jun H, Bartsch D, Kandel ER, Kaang BK (сентябрь 2006 г.). «Гетеродимер ApAF-ApC/EBP, активируемый PKA, является ключевым нисходящим эффектором ApCREB и необходим и достаточен для консолидации долгосрочного содействия». Журнал клеточной биологии . 174 (6): 827–38. doi :10.1083/jcb.200512066. PMC 2064337. PMID  16966424 . 
  35. ^ Mon H, Sugahara R, Hong SM, Lee JM, Kamachi Y, Kawaguchi Y, Kusakabe T (сентябрь 2009 г.). «Анализ взаимодействия белков с двухгибридной системой в культивируемых клетках насекомых». Аналитическая биохимия . 392 (2): 180–2. doi :10.1016/j.ab.2009.05.033. PMID  19481053.
  36. ^ Gommans WM, Haisma HJ, Rots MG (декабрь 2005 г.). «Инженерия факторов транскрипции белка цинкового пальца: терапевтическая значимость включения или выключения эндогенной экспрессии генов по команде». Журнал молекулярной биологии . 354 (3): 507–19. doi :10.1016/j.jmb.2005.06.082. PMID  16253273.[ постоянная мертвая ссылка ‍ ]
  37. ^ Ю Х, Браун П., Йылдирим М.А., Лемменс I, Венкатесан К., Сахали Дж., Хирозан-Кишикава Т., Гебреаб Ф., Ли Н., Симонис Н., Хао Т., Руал Дж.Ф., Дрико А., Васкес А., Мюррей Р.Р., Саймон С. , Тардиво Л., Там С., Сврзикапа Н., Фан С., де Смет А.С., Мотиль А., Хадсон М.Э., Парк Дж., Синь Х., Кьюсик М.Е., Мур Т., Бун С., Снайдер М., Рот Ф.П., Барабаси А.Л., Тавернье Дж., Хилл Д.Э., Видал М. (октябрь 2008 г.). «Высококачественная карта взаимодействия бинарных белков сети интерактома дрожжей». Наука . 322 (5898): 104–10. Бибкод : 2008Sci...322..104Y. doi :10.1126/science.1158684. PMC 2746753. PMID  18719252 . 
  38. ^ Chen YC, Rajagopala SV, Stellberger T, Uetz P (сентябрь 2010 г.). «Исчерпывающий бенчмаркинг дрожжевой двухгибридной системы». Nature Methods . 7 (9): 667–8, ответ автора 668. doi :10.1038/nmeth0910-667. PMC 10332476 . PMID  20805792. S2CID  35834541. 
  39. ^ Koegl M, Uetz P (декабрь 2007 г.). «Улучшение систем скрининга двугибридных дрожжей». Briefings in Functional Genomics & Proteomics . 6 (4): 302–12. doi : 10.1093/bfgp/elm035 . PMID  18218650.

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
двухгибридном скрининге
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках