Трансген — это ген , который был перенесен естественным путем или с помощью любого из ряда методов генной инженерии из одного организма в другой. Введение трансгена в процессе, известном как трансгенез , может изменить фенотип организма. Трансген описывает сегмент ДНК, содержащий последовательность гена, которая была выделена из одного организма и введена в другой организм. Этот неродной сегмент ДНК может либо сохранить способность производить РНК или белок в трансгенном организме, либо изменить нормальную функцию генетического кода трансгенного организма. В общем, ДНК включается в зародышевую линию организма . Например, у высших позвоночных это может быть достигнуто путем инъекции чужеродной ДНК в ядро оплодотворенной яйцеклетки . Этот метод обычно используется для введения генов человеческих болезней или других интересующих генов в штаммы лабораторных мышей для изучения функции или патологии , связанной с этим конкретным геном.
Для построения трансгена требуется сборка нескольких основных частей. Трансген должен содержать промотор , который является регуляторной последовательностью, определяющей, где и когда трансген активен, экзон , последовательность кодирования белка (обычно полученную из кДНК для интересующего белка) и стоп-последовательность. Обычно они объединяются в бактериальной плазмиде , а кодирующие последовательности обычно выбираются из трансгенов с ранее известными функциями. [1]
Трансгенные или генетически модифицированные организмы , будь то бактерии, вирусы или грибы, служат многим исследовательским целям. Были выведены трансгенные растения , насекомые, рыбы и млекопитающие (включая людей). Трансгенные растения, такие как кукуруза и соя, заменили дикие штаммы в сельском хозяйстве некоторых стран (например, США). Ускользание трансгенов было задокументировано для ГМО-культур с 2001 года с сохранением и инвазивностью. Трансгенные организмы ставят этические вопросы и могут вызвать проблемы биологической безопасности .
Идея формирования организма для удовлетворения конкретных потребностей не является новой наукой. Однако до конца 1900-х годов фермеры и ученые могли выводить новые штаммы растений или организмов только из близкородственных видов, поскольку ДНК должна была быть совместимой, чтобы потомство могло размножаться. [ необходима цитата ]
В 1970-х и 1980-х годах ученые преодолели это препятствие, изобретя процедуры объединения ДНК двух совершенно разных видов с помощью генной инженерии . Организмы, полученные с помощью этих процедур, были названы трансгенными. Трансгенез — это то же самое, что и генная терапия , в том смысле, что они оба трансформируют клетки для определенной цели. Однако они совершенно различны по своим целям, поскольку генная терапия направлена на излечение дефекта в клетках, а трансгенез стремится создать генетически модифицированный организм путем включения определенного трансгена в каждую клетку и изменения генома . Таким образом, трансгенез изменит зародышевые клетки, а не только соматические, чтобы гарантировать, что трансгены будут переданы потомству при размножении организмов. Трансгены изменяют геном, блокируя функцию гена-хозяина; они могут либо заменить ген-хозяина тем, который кодирует другой белок, либо ввести дополнительный ген. [2]
Первый трансгенный организм был создан в 1974 году, когда Энни Чанг и Стэнли Коэн экспрессировали гены Staphylococcus aureus в Escherichia coli . [3] В 1978 году дрожжевые клетки стали первыми эукариотическими организмами, подвергшимися переносу генов. [4] Клетки мышей были впервые трансформированы в 1979 году, а затем в 1980 году — эмбрионы мышей. Большинство самых первых трансмутаций были выполнены путем микроинъекции ДНК непосредственно в клетки. Ученые смогли разработать другие методы для выполнения преобразований, такие как включение трансгенов в ретровирусы и последующее заражение клеток; использование электроинфузии, которая использует электрический ток для пропуска чужеродной ДНК через клеточную стенку; биолистика , которая представляет собой процедуру выстреливания ДНК-пулями в клетки; а также доставку ДНК в недавно оплодотворенную яйцеклетку. [5]
Первые трансгенные животные предназначались только для генетических исследований с целью изучения конкретной функции гена, и к 2003 году были изучены тысячи генов.
Различные трансгенные растения были разработаны для сельского хозяйства с целью производства генетически модифицированных культур , таких как кукуруза, соя, рапсовое масло, хлопок, рис и т. д. По состоянию на 2012 год [обновлять]эти ГМО-культуры были высажены на 170 миллионах гектаров по всему миру. [6]
Одним из примеров трансгенных видов растений является золотистый рис . В 1997 году [ требуется ссылка ] у пяти миллионов детей развилась ксерофтальмия , заболевание, вызванное дефицитом витамина А , только в Юго-Восточной Азии. [7] Из этих детей четверть миллиона ослепла. [7] Чтобы бороться с этим, ученые использовали биолистику для внедрения гена фитоенсинтазы нарцисса в местные сорта риса Азии . [8] Вставка нарцисса увеличила выработку β-каротина . [8] Продуктом был трансгенный вид риса, богатый витамином А, называемый золотистым рисом . Мало что известно о влиянии золотистого риса на ксерофтальмию, поскольку кампании против ГМО предотвратили полный коммерческий выпуск золотистого риса в нуждающиеся сельскохозяйственные системы. [9]
Побег генно-инженерных генов растений через гибридизацию с дикими родственниками впервые обсуждался и изучался в Мексике [10] и Европе в середине 1990-х годов. Существует согласие, что побег трансгенов неизбежен, даже «некоторые доказательства того, что это происходит». [6] До 2008 года было мало задокументированных случаев. [6] [11]
Кукуруза, отобранная в 2000 году из Сьерра-Хуарес, Оахака , Мексика, содержала трансгенный промотор 35S, в то время как большой образец, отобранный другим методом из того же региона в 2003 и 2004 годах, не содержал трансгенного промотора. Образец из другого региона из 2002 года также не содержал, но направленные образцы, отобранные в 2004 году, содержали, что предполагает сохранение трансгена или повторное внедрение. [12] Исследование 2009 года обнаружило рекомбинантные белки в 3,1% и 1,8% образцов, чаще всего на юго-востоке Мексики. Импорт семян и зерна из Соединенных Штатов может объяснить частоту и распределение трансгенов в западно-центральной Мексике, но не на юго-востоке. Кроме того, 5,0% партий семян кукурузы в мексиканских запасах кукурузы экспрессировали рекомбинантные белки, несмотря на мораторий на ГМ-культуры. [13]
В 2011 году в Мексике среди дикого хлопка был обнаружен трансгенный хлопок после 15 лет выращивания ГМО-хлопка. [14]
Трансгенный рапс Brassicus napus – гибридизированный с местным японским видом Brassicus rapa – был обнаружен в Японии в 2011 году [15] после того, как был идентифицирован в 2006 году в Квебеке , Канада. [16] Они были устойчивы в течение шестилетнего периода исследования, без давления отбора гербицидов и несмотря на гибридизацию с дикой формой. Это был первый отчет об интрогрессии – стабильном включении генов из одного генофонда в другой – трансгена устойчивости к гербицидам из Brassica napus в генофонд дикой формы. [17]
Трансгенная полевица ползучая , выведенная с целью устойчивости к глифосату как «одна из первых опыляемых ветром, многолетних и высокопересекающихся трансгенных культур», была посажена в 2003 году в рамках большого (около 160 га) полевого испытания в центральном Орегоне недалеко от Мадраса, штат Орегон . В 2004 году было обнаружено, что ее пыльца достигала дикорастущих популяций полевицы на расстоянии до 14 километров. Перекрестноопыляющаяся Agrostis gigantea была обнаружена даже на расстоянии 21 километра. [18] Производитель, компания Scotts Company, не смогла удалить все генетически модифицированные растения, и в 2007 году Министерство сельского хозяйства США оштрафовало компанию Scotts на 500 000 долларов за несоблюдение правил. [19]
Долгосрочный мониторинг и контроль конкретного трансгена оказался невозможным. [20] Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов опубликовало руководство по оценке риска в 2010 году. [21]
Генетически модифицированные мыши являются наиболее распространенной животной моделью для трансгенных исследований. [22] Трансгенные мыши в настоящее время используются для изучения различных заболеваний, включая рак, ожирение, болезни сердца, артрит, тревожность и болезнь Паркинсона. [23] Два наиболее распространенных типа генетически модифицированных мышей — это мыши с нокаутом и онкомис . Мыши с нокаутом — это тип мышиной модели, которая использует трансгенную вставку для нарушения экспрессии существующего гена. Чтобы создать мышей с нокаутом, трансген с желаемой последовательностью вставляется в изолированную бластоцисту мыши с помощью электропорации . Затем в некоторых клетках естественным образом происходит гомологичная рекомбинация , заменяя интересующий ген разработанным трансгеном. Благодаря этому процессу исследователи смогли продемонстрировать, что трансген может быть интегрирован в геном животного, выполнять определенную функцию внутри клетки и передаваться будущим поколениям. [24]
Онкомис — еще один генетически модифицированный вид мышей, созданный путем вставки трансгенов, которые повышают уязвимость животного к раку. Исследователи рака используют онкомис для изучения профилей различных видов рака, чтобы применить эти знания к исследованиям на людях. [24]
Было проведено множество исследований, касающихся трансгенеза у плодовой мушки Drosophila melanogaster . Этот организм уже более 100 лет является полезной генетической моделью благодаря хорошо изученному паттерну развития. Перенос трансгенов в геном Drosophila выполняется с использованием различных методов, включая вставку P-элемента , Cre-loxP и ΦC31 . Наиболее практикуемый метод, используемый до сих пор для вставки трансгенов в геном Drosophila, использует P-элементы. Транспонируемые P-элементы, также известные как транспозоны , представляют собой сегменты бактериальной ДНК, которые транслоцируются в геном без наличия комплементарной последовательности в геноме хозяина. P-элементы вводятся парами по два, которые фланкируют интересующую область вставки ДНК. Кроме того, P-элементы часто состоят из двух плазмидных компонентов, один из которых известен как транспозаза P-элемента, а другой — остов транспозона P. Часть транспозазы плазмиды управляет транспозицией остова транспозона P, содержащего интересующий трансген и часто маркер, между двумя конечными участками транспозона. Успешность этой вставки приводит к необратимому добавлению интересующего трансгена в геном. Хотя этот метод доказал свою эффективность, участки вставки элементов P часто неконтролируемы, что приводит к неблагоприятной, случайной вставке трансгена в геном Drosophila . [25]
Для улучшения местоположения и точности трансгенного процесса был введен фермент, известный как Cre . Cre оказался ключевым элементом в процессе, известном как обмен кассетами, опосредованный рекомбиназой (RMCE). Хотя он показал более низкую эффективность трансгенной трансформации, чем транспозазы элементов P, Cre значительно снижает трудоемкое изобилие [ необходимо разъяснение ] балансировки случайных вставок P. Cre помогает в целевом трансгенезе интересующего сегмента гена ДНК, поскольку он поддерживает картирование сайтов вставки трансгена, известных как сайты loxP. Эти сайты, в отличие от элементов P, могут быть специально вставлены для фланкирования интересующего сегмента хромосомы, помогая в целевом трансгенезе. Транспозаза Cre важна для каталитического расщепления пар оснований, присутствующих в тщательно позиционированных сайтах loxP, что позволяет выполнять более специфичные вставки интересующей трансгенной донорной плазмиды. [26]
Для преодоления ограничений и низких выходов, которые дают методы трансформации с использованием транспозона и Cre-loxP, недавно был использован бактериофаг ΦC31 . Недавние прорывные исследования включают микроинъекцию интегразы бактериофага ΦC31, которая показывает улучшенную трансгенную вставку больших фрагментов ДНК, которые не могут быть транспонированы только элементами P. Этот метод включает рекомбинацию между сайтом прикрепления (attP) в фаге и сайтом прикрепления в геноме бактериального хозяина (attB). По сравнению с обычными методами трансгенной вставки с использованием элементов P, ΦC31 интегрирует весь трансгенный вектор, включая бактериальные последовательности и гены устойчивости к антибиотикам. К сожалению, было обнаружено, что наличие этих дополнительных вставок влияет на уровень и воспроизводимость экспрессии трансгена.
Одно из сельскохозяйственных применений — селективное разведение животных по определенным признакам: трансгенный скот с увеличенным мышечным фенотипом был получен путем сверхэкспрессии короткой шпилечной РНК с гомологией с мРНК миостатина с использованием РНК-интерференции . [27] Трансгены используются для производства молока с высоким содержанием белков или шелка из молока коз. Другое сельскохозяйственное применение — селективное разведение животных, устойчивых к болезням, или животных для биофармацевтического производства. [27]
Применение трансгенов является быстрорастущей областью молекулярной биологии . По состоянию на 2005 год было предсказано, что в течение следующих двух десятилетий будет создано 300 000 линий трансгенных мышей. [28] Исследователи выявили множество применений трансгенов, особенно в области медицины. Ученые сосредоточены на использовании трансгенов для изучения функции человеческого генома с целью лучшего понимания болезней, адаптации органов животных для трансплантации людям и производства фармацевтических продуктов, таких как инсулин , гормон роста и факторы, препятствующие свертыванию крови, из молока трансгенных коров. [ необходима цитата ]
По состоянию на 2004 год было известно пять тысяч генетических заболеваний , и возможность лечения этих заболеваний с использованием трансгенных животных, возможно, является одним из самых многообещающих применений трансгенов. Существует возможность использования генной терапии человека для замены мутировавшего гена немутировавшей копией трансгена с целью лечения генетического заболевания. Это можно сделать с помощью Cre-Lox или нокаута . Более того, генетические заболевания изучаются с использованием трансгенных мышей, свиней, кроликов и крыс. Трансгенные кролики были созданы для изучения наследственных сердечных аритмий, поскольку сердце кролика заметно больше напоминает человеческое сердце по сравнению с сердцем мыши. [29] [30] Совсем недавно ученые также начали использовать трансгенных коз для изучения генетических заболеваний, связанных с фертильностью . [31]
Трансгены могут быть использованы для ксенотрансплантации органов свиньи. В ходе изучения отторжения ксеноорганов было установлено, что острое отторжение пересаженного органа происходит при контакте органа с кровью реципиента из-за распознавания чужеродных антител на эндотелиальных клетках пересаженного органа. Ученые выявили антиген у свиней, который вызывает эту реакцию, и поэтому способны пересаживать орган без немедленного отторжения путем удаления антигена. Однако антиген начинает экспрессироваться позже, и происходит отторжение. Поэтому проводятся дальнейшие исследования. [ необходима цитата ] Трансгенные микроорганизмы, способные вырабатывать каталитические белки или ферменты , которые увеличивают скорость промышленных реакций.
Использование трансгенов у людей в настоящее время сопряжено с проблемами. Трансформация генов в человеческие клетки еще не доведена до совершенства. Самый известный пример этого касается некоторых пациентов, у которых развился Т-клеточный лейкоз после лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с Х-хромосомой (X-SCID). [32] Это было связано с близкой близостью вставленного гена к промотору LMO2 , который контролирует транскрипцию протоонкогена LMO2. [33]