Глутатион S- трансферазы ( GST ), ранее известные как лигандины , представляют собой семейство эукариотических и прокариотических метаболических изоферментов фазы II, наиболее известных своей способностью катализировать конъюгацию восстановленной формы глутатиона (GSH) с ксенобиотическими субстратами с целью детоксикации. . Семейство GST состоит из трех суперсемейств: цитозольных , митохондриальных и микросомальных (также известных как MAPEG ) белков . [1] [2] [3] Члены суперсемейства GST чрезвычайно разнообразны по аминокислотной последовательности , и большая часть последовательностей, хранящихся в общедоступных базах данных, имеет неизвестную функцию. [4] Инициатива по ферментным функциям (EFI) использует GST в качестве модельного суперсемейства для определения новых функций GST.
GST могут составлять до 10% цитозольного белка в некоторых органах млекопитающих. [5] [6] GST катализируют конъюгацию GSH через сульфгидрильную группу с электрофильными центрами на самых разных субстратах, чтобы сделать соединения более растворимыми в воде. [7] [8] Эта активность выводит токсины из эндогенных соединений, таких как перекисные липиды, и способствует расщеплению ксенобиотиков. GST также могут связывать токсины и функционировать как транспортные белки, что привело к появлению раннего термина GST — лигандина . [9] [10]
Последовательность и структура белка являются важными дополнительными критериями классификации для трех суперсемейств (цитозольных, митохондриальных и MAPEG) GST: в то время как классы из цитозольного суперсемейства GST обладают более чем 40% гомологией последовательностей , классы из других классов могут иметь менее 25% гомологии последовательностей. . Цитозольные GST делятся на 13 классов в зависимости от их структуры: альфа, бета, дельта, эпсилон, дзета, тета, мю, ню, пи, сигма, тау, фи и омега. Митохондриальные GST относятся к классу каппа. Суперсемейство микросомальных GST MAPEG состоит из подгрупп, обозначенных I-IV, между которыми идентичность аминокислотных последовательностей составляет менее 20%. Цитозольные GST человека относятся к классам альфа, дзета, тета, мю, пи, сигма и омега, при этом известно существование шести изозимов, принадлежащих к классам I, II и IV суперсемейства MAPEG. [8] [12] [13]
Стандартизированная номенклатура GST, впервые предложенная в 1992 году, идентифицирует виды, к которым принадлежит интересующий изозим, с помощью строчной буквы (например, «h» для человека), которая предшествует аббревиатуре GST. Класс изофермента впоследствии обозначается прописной буквой (например, «А» для альфа), за которой следует арабская цифра, обозначающая подсемейство (или субъединицу) класса. Поскольку как митохондриальные, так и цитозольные GST существуют в виде димеров , а между членами одного и того же класса образуются только гетеродимеры, второй компонент подсемейства димера фермента обозначается дефисом, за которым следует дополнительная арабская цифра. [12] [13] Следовательно, если глутатион S- трансфераза человека является гомодимером подсемейства 1 pi-класса, ее название будет записываться как «hGSTP1-1».
В ранней номенклатуре GST они назывались белками «Y», имея в виду их разделение на фракцию «Y» (в отличие от фракций «X и Z») с использованием хроматографии на сефадексе G75. [14] По мере идентификации субъединиц GST их обозначали как Ya, Yp и т. д., при необходимости с указанием номера, обозначающего изоформу мономера (например, Yb1). Литвак и др. предложили термин «лигандин» для обозначения белков, ранее известных как белки «Y». [10]
В клинической химии и токсикологии чаще всего используются термины альфа-GST, мю-GST и пи-GST.
Сайт связывания глутатиона, или «G-сайт», расположен в тиоредоксин -подобном домене как цитозольных, так и митохондриальных GST. Областью, содержащей наибольшую вариабельность между различными классами, является область спирали α2 , где один из трех различных аминокислотных остатков взаимодействует с глициновым остатком глутатиона. Две подгруппы цитозольных GST были охарактеризованы на основе их взаимодействия с глутатионом: группа Y-GST, которая использует остаток тирозина для активации глутатиона, и S/C-GST, которая вместо этого использует остатки серина или цистеина . [8] [4]
Фермент pGTSP1-1 свиного класса pi был первым GST, структура которого определена, и он является представителем других членов цитозольного суперсемейства GST, которые содержат тиоредоксин-подобный N -концевой домен, а также C -концевой домен . состоящее из альфа-спиралей . [8] [15]
Цитозольные GST млекопитающих являются димерными , причем обе субъединицы принадлежат к одному и тому же классу GST, хотя и не обязательно идентичны. Мономеры имеют размер примерно 25 кДа. [12] [16] Они активны на самых разных субстратах со значительным перекрытием. [17] В следующей таблице перечислены все ферменты GST каждого класса, которые, как известно, существуют у Homo sapiens , согласно данным UniProtKB/Swiss-Prot .
Экологическое воздействие природных токсинов помогло подготовить дрозофил к воздействию ДДТ
Активность GST зависит от постоянного поступления GSH от синтетических ферментов гамма-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы , а также от действия специфических переносчиков по удалению конъюгатов GSH из клетки. Основная роль GST заключается в детоксикации ксенобиотиков путем катализа нуклеофильной атаки GSH на электрофильные атомы углерода, серы или азота указанных неполярных ксенобиотических субстратов, тем самым предотвращая их взаимодействие с важными клеточными белками и нуклеиновыми кислотами. [13] [19] В частности, функция GST в этой роли двоякая: связывать как субстрат в гидрофобном H- сайте фермента, так и GSH в соседнем гидрофильном G-сайте, которые вместе образуют активный сайт фермента. ; и впоследствии активировать тиоловую группу GSH, обеспечивая нуклеофильную атаку субстрата. [12] Молекула глутатиона связывается в щели между N- и C -концевыми доменами - предполагается, что каталитически важные остатки находятся в N -концевом домене. [20] Обе субъединицы димера GST, гетеро- или гомодимерные по природе, содержат один несубстратный сайт связывания, а также сайт связывания GSH. Однако в гетеродимерных комплексах GST, таких как те, которые образованы цитозольными классами мю и альфа, щель между двумя субъединицами является домом для дополнительного несубстратного сайта связывания ксенобиотиков с высоким сродством, который может объяснять способность ферментов образовывать гетеродимеры. [19] [21]
Соединения, на которые таким образом нацелены GST, охватывают широкий спектр токсинов из окружающей среды или иным образом экзогенных токсинов, включая химиотерапевтические агенты и другие лекарства, пестициды, гербициды, канцерогены и эпоксиды различного происхождения; действительно, GSTs ответственны за конъюгацию β 1 -8,9-эпоксида, реактивного промежуточного продукта, образующегося из афлатоксина B 1 , который является решающим средством защиты от токсина у грызунов. Реакции детоксикации включают первые четыре этапа синтеза меркаптуровой кислоты [19] , при этом конъюгация с GSH делает субстраты более растворимыми и позволяет удалять их из клетки с помощью переносчиков, таких как белок 1, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью ( MRP1 ). . [8] После экспорта продукты конъюгации превращаются в меркаптуровые кислоты и выводятся с мочой или желчью . [13]
Большинство изоферментов млекопитающих имеют сродство к субстрату 1-хлор-2,4-динитробензолу , и спектрофотометрические анализы с использованием этого субстрата обычно используются для определения активности GST. [22] Однако некоторые эндогенные соединения, например, билирубин, могут ингибировать активность GST. У млекопитающих изоформы GST имеют клеточно-специфическое распределение (например, α-GST в гепатоцитах и π-GST в желчных путях печени человека). [23]
GST играют роль в процессе биоактивации пролекарства клопидогреля . [24]
Хотя GST наиболее известны своей способностью конъюгировать ксенобиотики с GSH и тем самым детоксицировать клеточную среду, они также способны связывать несубстратные лиганды , что имеет важное значение для передачи сигналов в клетках . Было показано, что несколько изозимов GST из различных классов ингибируют функцию киназы, участвующей в пути MAPK , которая регулирует пролиферацию и гибель клеток , не позволяя киназе выполнять свою роль в содействии сигнальному каскаду. [25]
Цитозольный GSTP1-1, хорошо изученный изофермент семейства GST млекопитающих, экспрессируется преимущественно в тканях сердца, легких и мозга; Фактически, это наиболее распространенный GST, экспрессируемый вне печени. [25] [26] На основании его сверхэкспрессии в большинстве линий опухолевых клеток человека и распространенности в опухолях, устойчивых к химиотерапии, считается, что GSTP1-1 играет роль в развитии рака и его потенциальной устойчивости к медикаментозному лечению. Дополнительным доказательством этого является знание того, что GSTP может избирательно ингибировать фосфорилирование C -Jun с помощью JNK , предотвращая апоптоз. [25] Во время низкого клеточного стресса комплекс формируется посредством прямых белок-белковых взаимодействий между GSTP и C- концом JNK, эффективно предотвращая действие JNK и, таким образом, индукцию им пути JNK. Клеточный окислительный стресс вызывает диссоциацию комплекса, олигомеризацию GSTP и индукцию пути JNK, что приводит к апоптозу . [27] Связь между ингибированием GSTP проапоптотического пути JNK и сверхэкспрессией изофермента в устойчивых к лекарствам опухолевых клетках может сама по себе объяснять способность опухолевых клеток избегать апоптоза, опосредованного лекарствами, которые не являются субстратами GSTP. [25]
Подобно GSTP, GSTM1 участвует в регуляции путей апоптоза посредством прямых белок-белковых взаимодействий, хотя он действует на ASK1 , который находится выше JNK. Механизм и результат аналогичны механизму действия GSTP и JNK в том смысле, что GSTM1 секвестрирует ASK1 посредством образования комплекса и предотвращает индукцию им проапоптотических частей p38 и JNK сигнального каскада MAPK. Как и GSTP, GSTM1 взаимодействует со своим партнером в отсутствие окислительного стресса, хотя ASK1 также участвует в реакции теплового шока , которая также предотвращается во время секвестрации ASK1. Тот факт, что высокие уровни GST связаны с устойчивостью к апоптозу, индуцированному рядом веществ, включая химиотерапевтические агенты, подтверждает его предполагаемую роль в предотвращении передачи сигналов MAPK. [27]
Появляется все больше данных, подтверждающих роль GST, особенно GSTP, в развитии рака и устойчивости к химиотерапии. Связь между GSTP и раком наиболее очевидна при сверхэкспрессии GSTP при многих видах рака, но она также подтверждается тем фактом, что трансформированный фенотип опухолевых клеток связан с аберрантно регулируемыми киназными сигнальными путями и клеточной зависимостью от сверхэкспрессируемых белков. Тот факт, что большинство противораковых препаратов являются плохими субстратами для GSTP, указывает на то, что роль повышенного уровня GSTP во многих линиях опухолевых клеток заключается не в детоксикации соединений, а в другой цели; Эта гипотеза также подтверждается общим обнаружением сверхэкспрессии GSTP в линиях опухолевых клеток, которые не устойчивы к лекарствам. [28]
Помимо своей роли в развитии рака и устойчивости к химиотерапевтическим препаратам, GST участвуют в различных заболеваниях благодаря их участию в GSH. Хотя доказательства влияния полиморфизмов GST классов альфа, мю, пи и тета на предрасположенность к различным типам рака минимальны, многочисленные исследования выявили участие таких генотипических вариаций в астме , атеросклерозе , аллергии и других воспалительных заболеваниях. [19]
Поскольку диабет является заболеванием, которое включает окислительное повреждение, а метаболизм GSH у пациентов с диабетом нарушен, GST могут представлять собой потенциальную мишень для медикаментозного лечения диабета. Кроме того, известно, что введение инсулина приводит к увеличению экспрессии гена GST через путь PI3K/AKT/mTOR и снижению внутриклеточного окислительного стресса, в то время как глюкагон снижает экспрессию такого гена. [29]
Гены GST омега-класса (GSTO), в частности, связаны с неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера , Паркинсона и боковой амиотрофический склероз ; Опять же, считается, что виновником является окислительный стресс, снижение экспрессии гена GSTO приводит к снижению возраста начала заболеваний. [30]
Высокие внутриклеточные концентрации GST в сочетании с их клеточно-специфичным клеточным распределением позволяют им функционировать в качестве биомаркеров для локализации и мониторинга повреждений определенных типов клеток. Например, гепатоциты содержат высокие уровни альфа-GST, а сывороточный альфа-GST является индикатором повреждения гепатоцитов при трансплантации , токсичности и вирусных инфекциях. [31] [32] [33]
Аналогично, у людей клетки проксимальных канальцев почек содержат высокие концентрации альфа-GST, тогда как клетки дистальных канальцев содержат pi-GST. [34] Такое специфическое распределение позволяет использовать измерение GST в моче для количественной оценки и локализации повреждения почечных канальцев при трансплантации , нефротоксичности и ишемического повреждения. [35]
В доклинических исследованиях на грызунах было показано, что альфа-GST в моче и сыворотке крови являются чувствительными и специфическими индикаторами некроза проксимальных канальцев почек и некроза гепатоцитов соответственно. [36] [37]
GST можно добавить к интересующему белку, чтобы очистить его от раствора с помощью процесса, известного как анализ с понижением уровня белка . Это достигается путем вставки кодирующей последовательности ДНК GST рядом с той, которая кодирует интересующий белок. Таким образом, после транскрипции и трансляции белок GST и интересующий белок будут экспрессироваться вместе в виде слитого белка . Поскольку белок GST обладает сильным сродством к GSH, к белковой смеси можно добавлять шарики, покрытые этим соединением; в результате интересующий белок, прикрепленный к GST, будет прилипать к шарикам, изолируя белок от остальных белков в растворе. Гранулы извлекают и промывают свободным GSH, чтобы отделить интересующий белок от гранул, в результате чего получается очищенный белок. Этот метод можно использовать для выяснения прямых белок-белковых взаимодействий. Недостатком этого анализа является то, что интересующий белок присоединяется к GST, изменяя его нативное состояние. [38] [39]
GST-метка часто используется для разделения и очистки белков, содержащих слитый GST белок. Размер метки составляет 220 аминокислот (приблизительно 26 кДа), [40] что по сравнению с такими метками, как Myc-tag или FLAG-tag , довольно велико. Он может быть слит либо с N -концом , либо с С -концом белка. Помимо функции очищающей метки, GST действует как шаперон для прикрепленного белка, способствуя его правильному сворачиванию, а также предотвращая его агрегацию в тельцах включения при экспрессии в бактериях. Метку GST можно легко удалить после очистки путем добавления протеазы тромбина, если между меткой GST и интересующим белком вставлен подходящий сайт расщепления (который обычно включен во многие коммерчески доступные источники плазмид, меченных GST). [38] [41]