Слитые белки или химерные (ки-мир-ик) белки (буквально состоящие из частей из разных источников) — это белки, созданные путем соединения двух или более генов , которые первоначально кодировали отдельные белки. Трансляция этого слитого гена приводит к образованию одного или нескольких полипептидов с функциональными свойствами, полученными из каждого из исходных белков. Рекомбинантные слитые белки создаются искусственно с помощью технологии рекомбинантной ДНК для использования в биологических исследованиях или терапии . Химерами или химерами обычно обозначают гибридные белки, состоящие из полипептидов , имеющих разные функции или физико-химические характеристики. Химерные мутантные белки возникают в природе, когда сложная мутация , такая как хромосомная транслокация , тандемная дупликация или ретротранспозиция, создает новую кодирующую последовательность, содержащую части кодирующих последовательностей двух разных генов. Встречающиеся в природе гибридные белки обычно обнаруживаются в раковых клетках, где они могут функционировать как онкопротеины . Слитый белок bcr -abl является хорошо известным примером онкогенного слитого белка и считается основным онкогенным фактором хронического миелогенного лейкоза .
Некоторые слитые белки объединяют целые пептиды и, следовательно, содержат все функциональные домены исходных белков. Однако другие слитые белки, особенно те, которые встречаются в природе, объединяют только части кодирующих последовательностей и поэтому не сохраняют исходные функции родительских генов, которые их сформировали.
Многие слияния целых генов полностью функциональны и могут заменять исходные пептиды. Однако некоторые испытывают взаимодействие между двумя белками, которое может изменить их функции. Помимо этих эффектов, некоторые слияния генов могут вызывать регуляторные изменения , которые изменяют время и место действия этих генов. При частичном слиянии генов перетасовка различных активных сайтов и связывающих доменов может привести к появлению новых белков с новыми функциями.
Слияние флуоресцентных меток с белками в клетке-хозяине — широко популярный метод, используемый в экспериментальных клеточных и биологических исследованиях для отслеживания взаимодействий белков в реальном времени. Первая флуоресцентная метка, зеленый флуоресцентный белок (GFP), была выделена из Aequorea victoria и до сих пор часто используется в современных исследованиях. Более поздние разработки включают фотоконвертируемые флуоресцентные белки (PCFP), которые были впервые выделены из Anthozoa . Наиболее часто используемой PCFP является флуоресцентная метка Kaede , но разработка зелено-красной метки Kikume (KikGR) в 2005 году предлагает более яркий сигнал и более эффективное фотопреобразование. Преимуществом использования флуоресцентных меток PCFP является возможность отслеживать взаимодействие перекрывающихся биохимических путей в режиме реального времени. Метка изменит цвет с зеленого на красный, как только белок достигнет интересующей точки на пути, а белок другого цвета можно будет отслеживать на протяжении всего пути. Этот метод особенно полезен при изучении путей рециркуляции рецепторов, связанных с G-белком (GPCR). Судьба переработанных рецепторов G-белка может быть отправлена либо на плазматическую мембрану для переработки, что отмечено зеленой флуоресцентной меткой, либо может быть отправлено в лизосому для деградации, что отмечено красной флуоресцентной меткой. [1]
Целью создания гибридных белков при разработке лекарств является придание свойств каждого из «родительских» белков полученному химерному белку. В настоящее время для медицинского применения доступно несколько химерных белковых препаратов .
Многие химерные белковые препараты представляют собой моноклональные антитела , специфичность которых к молекуле-мишени была разработана с использованием мышей и, следовательно, изначально представляла собой «мышиные» антитела. Будучи белками, не принадлежащими человеку, мышиные антитела имеют тенденцию вызывать иммунную реакцию при введении людям. Процесс химеризации включает замену сегментов молекулы антитела, которые отличают его от человеческого антитела. Например, можно ввести константные домены человека, тем самым устраняя большую часть потенциально иммуногенных частей лекарственного средства без изменения его специфичности в отношении намеченной терапевтической мишени. Номенклатура антител указывает на этот тип модификации путем вставки -xi- в непатентованное название (например, abci- xi -mab ). Если части вариабельных доменов также заменить человеческими частями, получают гуманизированные антитела. Хотя концептуально этот тип не отличается от химер, он обозначается с помощью -zu-, например, в dacli- zu -mab . Дополнительные примеры см. в списке моноклональных антител .
Помимо химерных и гуманизированных антител, существуют и другие фармацевтические цели создания химерных конструкций. Этанерцепт , например, представляет собой блокатор TNFα , созданный путем комбинации рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) с Fc-сегментом иммуноглобулина G 1 . TNFR обеспечивает специфичность в отношении мишени лекарственного средства, а Fc-сегмент антитела, как полагают, повышает стабильность и доставляемость лекарственного средства. [2] Дополнительные химерные белки, используемые для терапевтических целей, включают:
Рекомбинантный слитый белок представляет собой белок , созданный посредством генной инженерии слитого гена. Обычно это включает удаление стоп- кодона из последовательности кДНК, кодирующей первый белок, а затем добавление последовательности кДНК второго белка в рамку считывания посредством лигирования или ПЦР с перекрывающимся удлинением . Эта последовательность ДНК затем будет экспрессироваться клеткой в виде одного белка. Белок можно сконструировать так, чтобы он включал полную последовательность обоих исходных белков или только часть любого из них.
Если эти два объекта являются белками, часто также добавляются линкерные (или «спейсерные») пептиды, которые повышают вероятность того, что белки сворачиваются независимо и ведут себя ожидаемым образом. Особенно в том случае, когда линкеры обеспечивают очистку белка , линкеры в слитых белках или пептидах иногда создаются с сайтами расщепления для протеаз или химических агентов, которые позволяют высвободить два отдельных белка. Этот метод часто используется для идентификации и очистки белков путем слияния белка GST , пептида FLAG или гекса-гис-пептида (6xHis-метка), которые можно выделить с помощью аффинной хроматографии с никелевыми или кобальтовыми смолами. Ди- или мультимерные химерные белки могут быть получены посредством генной инженерии путем слияния с исходными белками пептидных доменов, которые индуцируют ди- или мультимеризацию искусственных белков (например, стрептавидиновые или лейциновые молнии ). Слитые белки также можно производить с прикрепленными к ним токсинами или антителами для изучения развития заболеваний. Промотор гидрогеназы PSH был изучен путем конструирования слияния промотора PSH и gfp с использованием репортерного гена зеленого флуоресцентного белка ( gfp) . [3]
Новые рекомбинантные технологии позволили улучшить дизайн гибридных белков для использования в таких разнообразных областях, как биодетекция, бумажная и пищевая промышленность, а также биофармацевтика. Недавние улучшения включали слияние отдельных пептидов или фрагментов белков с областями существующих белков, такими как N- и C-концы , и, как известно, усиливают следующие свойства: [4]
Самые ранние применения дизайна рекомбинантных белков могут быть зафиксированы в использовании одиночных пептидных меток для очистки белков с помощью аффинной хроматографии . С тех пор было разработано множество методов создания слитых белков для самых разнообразных применений, от флуоресцентных белковых меток до лекарств из рекомбинантных слитых белков. Три широко используемых метода проектирования включают тандемное слияние, вставку домена и посттрансляционную конъюгацию. [5]
Интересующие белки просто соединяются конец в конец посредством слияния N- или C-концов между белками. Это обеспечивает гибкую мостовую структуру, обеспечивающую достаточное пространство между партнерами по слиянию для обеспечения правильного складывания . Однако N- или C-концы пептида часто являются решающими компонентами в получении желаемой структуры сворачивания рекомбинантного белка, что делает простое сквозное соединение доменов неэффективным в этом случае. По этой причине часто необходим белковый линкер для поддержания функциональности интересующих белковых доменов. [5]
Этот метод включает в себя слияние последовательных белковых доменов путем кодирования желаемых структур в одну полипептидную цепь, но иногда может потребоваться вставка домена в другой домен. Этот метод обычно считается более сложным для выполнения, чем тандемное слияние, из-за трудностей с поиском подходящего сайта лигирования в интересующем гене. [5]
Этот метод объединяет белковые домены после рибосомальной трансляции интересующих белков, в отличие от генетического слияния перед трансляцией, используемого в других рекомбинантных технологиях. [5]
Белковые линкеры помогают создавать слитые белки, обеспечивая соответствующее расстояние между доменами, поддерживая правильное сворачивание белка в случае, когда взаимодействия N- или C-концев имеют решающее значение для сворачивания. Обычно белковые линкеры обеспечивают важные взаимодействия доменов, повышают стабильность и уменьшают стерические препятствия, что делает их предпочтительными для использования в дизайне слитых белков, даже когда N- и C-концы могут быть слиты. Три основных типа линкеров — гибкие, жесткие и расщепляемые in vivo. [5] [6]
Встречающиеся в природе слитые гены чаще всего создаются, когда хромосомная транслокация заменяет концевые экзоны одного гена неповрежденными экзонами второго гена. В результате создается единственный ген, который можно транскрибировать , сплайсировать и транслировать для получения функционального слитого белка. Многие важные онкогены, способствующие развитию рака , представляют собой слитые гены, полученные таким путем.
Примеры включают в себя:
Антитела представляют собой слитые белки, образующиеся в результате рекомбинации V(D)J .
Существуют также редкие примеры встречающихся в природе полипептидов, которые представляют собой слияние двух четко определенных модулей, в которых каждый модуль проявляет свою характерную активность или функцию независимо от другого. Двумя основными примерами являются: двойная химера PP2C у Plasmodium falciparum (малярийного паразита), в которой каждый модуль PP2C проявляет ферментативную активность протеинфосфатазы 2C [7] и иммунофилины двойного семейства , которые встречаются у ряда одноклеточных организмов (таких как простейшие). паразиты и флавобактерии ) и содержат полноразмерные шаперонные модули циклофилина и FKBP . [8] [9] Эволюционное происхождение таких химер остается неясным.