Иммуноферментный анализ с использованием оптоволокна Surround ( SOFIA ) — это сверхчувствительная in vitro диагностическая платформа, включающая сборку оптоволокна Surround , которая захватывает флуоресцентное излучение всего образца. Определяющими характеристиками технологии являются ее чрезвычайно высокий предел обнаружения , чувствительность и динамический диапазон . Чувствительность SOFIA измеряется на уровне аттограммов (10−18 г ), что делает ее примерно в миллиард раз более чувствительной, чем обычные диагностические методы. Благодаря своему расширенному динамическому диапазону SOFIA способна различать уровни аналита в образце более 10 порядков , что облегчает точное титрование . [ требуется цитата ]
Как диагностическая платформа, SOFIA имеет широкий спектр применения. Несколько исследований уже продемонстрировали беспрецедентную способность SOFIA обнаруживать естественные прионы в крови и моче носителей заболеваний. [1] [2] [3] Ожидается, что это приведет к первому надежному тесту на предсмертный скрининг vCJD , BSE , scrapie , CWD и других трансмиссивных губчатых энцефалопатий . [4] Учитывая чрезвычайную чувствительность технологии, ожидаются дополнительные уникальные приложения, включая тесты in vitro на другие нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона . [3]
SOFIA была разработана в результате совместного исследовательского проекта Лос-Аламосской национальной лаборатории и Университета штата Нью-Йорк при поддержке Национальной программы по исследованию прионов Министерства обороны США .
Обычный метод проведения лазерно-индуцированной флуоресценции, а также других типов спектроскопических измерений, таких как инфракрасная , ультрафиолетово-видимая спектроскопия , фосфоресценция и т. д., заключается в использовании небольшого прозрачного лабораторного сосуда, кюветы , для помещения в него анализируемого образца. [ необходима ссылка ]
Для проведения измерения кювета заполняется исследуемой жидкостью, а затем освещается лазером, сфокусированным через одну из сторон кюветы. Линза помещается на одной из сторон кюветы, расположенной под углом 90° от входного окна, чтобы собрать флуоресцентный свет, индуцированный лазером. Только небольшой объем кюветы фактически освещается лазером и производит обнаруживаемую спектроскопическую эмиссию. Выходной сигнал значительно уменьшается, поскольку линза улавливает только около 10% спектроскопической эмиссии из-за соображений телесного угла. Эта техника используется уже не менее 75 лет; даже до появления лазера, когда для возбуждения флуоресценции использовались обычные источники света. [5]
SOFIA решает проблему низкой эффективности сбора, поскольку собирает практически весь флуоресцентный свет, испускаемый анализируемым образцом, увеличивая количество флуоресцентного сигнала примерно в 10 раз по сравнению с обычными приборами.
SOFIA — это устройство и метод для улучшения оптической геометрии для улучшения спектроскопического обнаружения аналитов в образце. Изобретение уже продемонстрировало свою функциональность в качестве концептуального устройства и метода для сверхчувствительного обнаружения прионов и других низкоуровневых аналитов. SOFIA сочетает в себе специфичность, присущую моноклональным антителам для захвата антигена, с чувствительностью технологии объемного оптического обнаружения. Для обнаружения чрезвычайно низких уровней сигнала в качестве детектора системы используется малошумящий фотоэлектрический диод. SOFIA использует лазер для освещения микрокапиллярной трубки, удерживающей образец. Затем свет, собранный из образца, направляется на передающую оптику из оптических волокон. Затем свет оптически фильтруется для обнаружения, что выполняется как измерение тока, усиленное против шума с помощью цифровой обработки сигнала с синхронизацией. Результаты отображаются на компьютере и программном обеспечении, разработанном для сбора данных. [ необходима цитата ]
Преимущества такой матрицы обнаружения многочисленны. Прежде всего, она позволяет использовать очень маленькие образцы при низкой концентрации для оптимального опроса с использованием метода лазерно-индуцированной флуоресценции. Эта волоконно-оптическая система обнаружения адаптируется к существующему оборудованию для обнаружения коротких импульсов , которое изначально было разработано для секвенирования отдельных молекул ДНК. Геометрия также подходит для развертывания для схем обнаружения отдельных молекул с использованием короткоимпульсного лазера. Многопортовая геометрия системы обеспечивает эффективную электронную обработку сигналов с каждого плеча устройства. Наконец, и, возможно, самое важное, волоконно-оптические кабели по существу на 100% эффективны в оптической передаче, имея затухание менее 10 дБ /км. Таким образом, после развертывания для использования на объекте, информация о флуоресценции может быть передана по оптоволокну в удаленное место, где может выполняться обработка и анализ данных.
SOFIA включает в себя контейнер для образцов многолуночного планшета, автоматизированное средство для последовательной транспортировки образцов из контейнера для образцов многолуночного планшета в прозрачный капилляр, находящийся внутри держателя образца, источник возбуждения, оптически связанный с образцом, причем излучение от источника возбуждения направлено по длине капилляра, и причем излучение индуцирует сигнал, который испускается образцом, и, по крайней мере, одну линейную решетку. [ необходима ссылка ]
После амплификации и концентрирования целевого аналита образцы маркируются флуоресцентным красителем с использованием антитела для специфичности, а затем загружаются в микрокапиллярную трубку. Эта трубка помещается в специально сконструированный аппарат, так что она полностью окружена оптическими волокнами для захвата всего света, испускаемого после возбуждения красителя с помощью лазера. [6]
Это оборудование представляет собой спектроскопический (светосборный) аппарат и соответствующий метод для быстрого обнаружения и анализа аналитов в образце. Образец облучается источником возбуждения, находящимся в оптической связи с образцом. Источник возбуждения может включать, но не ограничивается, лазер, лампу-вспышку, дуговую лампу, светодиод и т. п.
На рисунке 1 изображена текущая версия системы SOFIA. Четыре линейных массива (101) простираются от держателя образца (102), в котором находится удлиненный прозрачный контейнер для образца, открытый с обоих концов, до концевого порта (103). Дистальный конец концевого порта (104) вставлен в узел концевого порта (200). Линейные массивы (101) содержат множество оптических волокон, имеющих первый конец и второй конец, множество оптических волокон опционально окружено защитной и/или изолирующей оболочкой. Оптические волокна расположены линейно, что означает, что они по существу копланарны по отношению друг к другу, образуя удлиненный ряд волокон.
Аналит интереса может быть биологическим или химическим по своей природе, и в качестве примера, может включать только химические фрагменты (токсины, метаболиты, лекарства и остатки лекарств), пептиды , белки, клеточные компоненты, вирусы и их комбинации. Аналит интереса может находиться либо в жидкости, либо в поддерживающей среде, такой как гель.
SOFIA продемонстрировала свой потенциал как устройство с широким спектром применения. Сюда входят клинические применения, такие как обнаружение заболеваний, выявление предрасположенностей к патологиям, установление диагноза и отслеживание эффективности назначенного лечения, а также неклинические применения, такие как предотвращение попадания токсинов и других патогенных агентов в продукты, предназначенные для потребления человеком:
SOFIA использовался для быстрого обнаружения аномальной формы прионного белка ( PrP Sc ) в образцах биологических жидкостей, таких как кровь или моча. PrP Sc — это маркерный белок, используемый в диагностике трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE), примерами которых являются губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (т. е. болезнь «коровьего бешенства»), скрепи у овец и болезнь Крейтцфельдта-Якоба у людей. В настоящее время не существует быстрых средств для обнаружения PrP Sc до смерти в разбавленных количествах, в которых он обычно появляется в биологических жидкостях. Преимущества SOFIA заключаются в том, что он требует небольшой подготовки образца и позволяет размещать электронное диагностическое оборудование за пределами зоны содержания.
TSE, или прионные заболевания, являются инфекционными нейродегенеративными заболеваниями млекопитающих, которые включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, хроническую изнуряющую болезнь оленей и лосей, скрепи у овец и болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD) у людей. TSE могут передаваться от хозяина к хозяину при употреблении инфицированных тканей или переливании крови. Клинические симптомы TSE включают потерю движения и координации и слабоумие у людей. Они имеют инкубационный период от нескольких месяцев до нескольких лет, но после появления клинических признаков они быстро прогрессируют, не поддаются лечению и неизменно приводят к летальному исходу. Попытки снижения риска TSE привели к значительным изменениям в производстве и торговле сельскохозяйственными товарами, лекарствами, косметикой, донорством крови и тканей и биотехнологическими продуктами. Посмертное нейропатологическое исследование мозговой ткани животного или человека остается «золотым стандартом» диагностики TSE и является очень специфичным, но не таким чувствительным, как другие методы. [7]
Для повышения безопасности пищевых продуктов было бы полезно проводить скрининг всех животных на прионные заболевания с использованием ante mortem , доклинического тестирования, т. е. тестирования до проявления симптомов. Однако уровни PrP Sc очень низкие у предсимптомных хозяев. Кроме того, PrP Sc s, как правило, неравномерно распределены в тканях организма, при этом самая высокая концентрация постоянно обнаруживается в тканях нервной системы, а очень низкие концентрации — в легкодоступных жидкостях организма, таких как кровь или моча. Поэтому любой такой тест должен был бы обнаруживать чрезвычайно малые количества PrP и должен был бы различать PrP C и PrP Sc .
Современные методы обнаружения PrP Sc требуют много времени и используют посмертный анализ после того, как у подозрительных животных проявляются один или несколько симптомов заболевания. Современные методы диагностики основаны в основном на обнаружении физико-химических различий между PrP C и PrP Sc , которые на сегодняшний день являются единственными надежными маркерами TSE. Например, наиболее широко используемые диагностические тесты используют относительную резистентность PrP Sc в образцах мозга для различения PrP C и PrP Sc в сочетании с обнаружением на основе антител PK -резистентной части PrP Sc . До сих пор не удалось обнаружить прионные заболевания с помощью традиционных методов, таких как полимеразная цепная реакция, серология или анализы клеточных культур. Специфическая для агента нуклеиновая кислота еще не идентифицирована, и инфицированный хозяин не вызывает ответ антител.
Конформационно измененная форма PrP C — это PrP Sc . Некоторые группы считают, что PrP Sc является инфекционным агентом (прионным агентом) при TSE, в то время как другие группы так не считают. PrP Sc может быть нейропатологическим продуктом процесса заболевания, компонентом инфекционного агента, самим инфекционным агентом или чем-то еще. Независимо от того, какова его фактическая функция в состоянии заболевания, PrP Sc явно специфически связан с процессом заболевания, и его обнаружение указывает на инфицирование агентом, вызывающим прионные заболевания.
SOFIA предоставляет, среди прочего, методы диагностики прионных заболеваний путем обнаружения PrP Sc в биологических образцах. Образцами могут быть мозговая ткань, нервная ткань, кровь, моча, лимфатическая жидкость , спинномозговая жидкость или их комбинация. Отсутствие PrP Sc указывает на отсутствие заражения инфекционным агентом вплоть до пределов обнаружения методов. Обнаружение присутствия PrP Sc указывает на инфицирование инфекционным агентом, связанным с прионным заболеванием. Инфекция прионным агентом может быть обнаружена как на досимптомной, так и на симптоматической стадиях прогрессирования заболевания.
Эти и другие улучшения были достигнуты с помощью SOFIA. [3] Чувствительность и специфичность SOFIA устраняют необходимость в PK-переваривании для различения нормальных и аномальных изоформ PrP. Дальнейшее обнаружение PrP Sc в плазме крови было решено с помощью ограниченной циклической амплификации неправильного сворачивания белка (PMCA) с последующей SOFIA. Благодаря чувствительности SOFIA циклы PMCA могут быть сокращены, тем самым уменьшая вероятность спонтанного образования PrP Sc и обнаружения ложноположительных образцов. SOFIA удовлетворяет потребности в повышенной чувствительности при обнаружении прионных заболеваний как у предсимптомных, так и у симптоматических инфицированных TSE животных, включая людей, предоставляя методы анализа с использованием высокочувствительного оборудования, которое требует меньшей подготовки образцов, чем ранее описанные методы, в сочетании с недавно разработанными моноклональными антителами против PrP. Метод настоящей версии SOFIA обеспечивает уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP Sc в мозговой ткани. В сочетании с ограниченной sPMCA методы настоящего изобретения обеспечивают уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP Sc в плазме крови, тканях и других жидкостях, собранных прижизненно [ необходима ссылка ] .
Методы объединяют специфичность Mab для захвата и концентрации антигена с чувствительностью технологии обнаружения окружающего оптического волокна. В отличие от ранее описанных методов обнаружения PrP Sc в гомогенатах мозга , эти методы, при использовании для изучения гомогенатов мозга, не используют полимеризацию с затравкой, амплификацию или ферментативное переваривание (например, протеиназой K или «PK»). Это важно, поскольку предыдущие отчеты указывали на существование изоформ PrP Sc с различной чувствительностью PK, что снижает надежность анализа. Чувствительность этого анализа делает его подходящим в качестве платформы для быстрого анализа обнаружения прионов в биологических жидкостях. Помимо прионных заболеваний, метод может обеспечить средство для быстрого высокопроизводительного тестирования широкого спектра инфекций и расстройств.
В то время как около 40 циклов sPMCA в сочетании с иммунопреципитацией оказались недостаточными для обнаружения PrP Sc в плазме с помощью ELISA или вестерн-блоттинга, PrP Sc также, как было обнаружено, легко измеряется методами SOFIA. Ограниченное количество циклов, необходимых для настоящей платформы анализа, фактически исключает возможность получения ложноположительных результатов, связанных с PMCA, таких как те, о которых сообщалось ранее (Thorne and Terry, 2008). [8]
Благодаря быстрому развитию в области исследований биомаркеров многие инфекции и расстройства, которые невозможно было диагностировать с помощью in vitro- тестирования, становятся все более возможными. SOFIA, как ожидается, будет иметь более широкое применение в разработке диагностических тестов для инфекций и расстройств, выходящих за рамки прионных заболеваний. [3] Основное потенциальное применение — для других заболеваний, связанных с неправильным сворачиванием белков, в частности, для болезни Альцгеймера. [7]
Исследование 2011 года сообщило об обнаружении прионов в моче естественно и орально инфицированных овец с клиническим возбудителем скрепи и орально инфицированных преклинически и инфицированных белохвостых оленей с клинической хронической изнуряющей болезнью (CWD). Это первый отчет об обнаружении прионов PrP Sc в моче естественно или преклинически инфицированных прионами овец или оленей. [1]
Исследование 2010 года продемонстрировало умеренное количество циклической амплификации неправильного сворачивания белка (PMCA), связанной с новой схемой обнаружения SOFIA, может быть использовано для обнаружения PrP Sc в необработанной протеазой плазме от доклинических и клинических овец со скрепи и белохвостых оленей с хронической изнуряющей болезнью после естественного и экспериментального заражения. Ассоциированная с заболеванием форма прионного белка (PrP Sc ), возникающая в результате конформационного изменения нормальной (клеточной) формы прионного белка (PrP C ), считается центральной в нейропатогенезе и служит единственным надежным молекулярным маркером для диагностики прионных заболеваний. Хотя самые высокие уровни PrP Sc присутствуют в ЦНС, разработка разумного диагностического анализа требует использования жидкостей организма, которые обычно содержат крайне низкие уровни PrP Sc . PrP Sc был обнаружен в крови больных животных с помощью технологии PMCA. Однако сообщалось, что повторный цикл в течение нескольких дней, который необходим для PMCA материала крови, приводит к снижению специфичности (ложноположительные результаты). Чтобы создать анализ на PrP Sc в крови, который является одновременно высокочувствительным и специфичным, исследователи использовали ограниченный серийный PMCA (sPMCA) с SOFIA. Они не обнаружили никакого усиления sPMCA при добавлении полиадениловой кислоты, и не было необходимости сопоставлять генотипы источников PrP C и PrP Sc для эффективной амплификации. [2]
Исследование 2009 года показало, что SOFIA в своем текущем формате способна обнаружить менее 10 аттограмм (аг) рекомбинантного PrP хомяка, овцы и оленя. Около 10 аг PrP Sc из мозга хомяка, инфицированного 263K, может быть обнаружено с аналогичными нижними пределами обнаружения PrP Sc из мозга овец и оленей, инфицированных скрепи, инфицированных хронической изнуряющей болезнью. Эти пределы обнаружения позволяют разбавлять обработанный протеазой и необработанный материал сверх точки, где PrP C , неспецифические белки или другой посторонний материал могут помешать обнаружению сигнала PrP Sc и/или специфичности. Это не только устраняет проблему специфичности обнаружения PrP Sc , но и повышает чувствительность, поскольку возможность частичного протеолиза PrP Sc больше не является проблемой. SOFIA, вероятно, приведет к раннему обнаружению трансмиссивных энцефалопатий до смерти и также может использоваться с дополнительными протоколами амплификации мишеней. SOFIA представляет собой чувствительный метод обнаружения специфических белков, участвующих в патогенезе заболевания и/или диагностике, которая выходит за рамки трансмиссивных губчатых энцефалопатий. [3]
{{cite journal}}: Цитировать журнал требует |journal=( помощь )