Генная терапия использует доставку ДНК в клетки, что может быть достигнуто несколькими методами, которые суммированы ниже. Два основных класса методов - это те, которые используют рекомбинантные вирусы (иногда называемые биологическими наночастицами или вирусными векторами) и те, которые используют голую ДНК или комплексы ДНК (невирусные методы).
Все вирусы связываются со своими хозяевами и вводят свой генетический материал в клетку-хозяина в рамках цикла репликации. Этот генетический материал содержит основные «инструкции» о том, как производить больше копий этих вирусов, взламывая нормальный производственный механизм организма для обслуживания потребностей вируса. Клетка-хозяин будет выполнять эти инструкции и производить дополнительные копии вируса, что приведет к заражению все большего количества клеток. Некоторые типы вирусов вставляют свой геном в цитоплазму хозяина, но на самом деле не проникают в клетку. Другие проникают через клеточную мембрану, замаскировавшись под молекулы белка, и проникают в клетку.
Существует два основных типа вирусной инфекции: литическая и лизогенная . Вскоре после внедрения своей ДНК вирусы литического цикла быстро производят больше вирусов, вырываются из клетки и заражают больше клеток. Лизогенные вирусы интегрируют свою ДНК в ДНК клетки-хозяина и могут жить в организме в течение многих лет, прежде чем отреагировать на триггер. Вирус размножается так же, как и клетка, и не причиняет телесного вреда, пока не будет активирован. Триггер высвобождает ДНК из ДНК хозяина и использует ее для создания новых вирусов. [ необходима цитата ]
Генетический материал ретровирусов находится в форме молекул РНК , в то время как генетический материал их хозяев находится в форме ДНК. Когда ретровирус заражает клетку-хозяина, он вводит в клетку свою РНК вместе с некоторыми ферментами, а именно обратной транскриптазой и интегразой . Эта молекула РНК из ретровируса должна произвести копию ДНК из своей молекулы РНК, прежде чем она сможет быть интегрирована в генетический материал клетки-хозяина. Процесс производства копии ДНК из молекулы РНК называется обратной транскрипцией . Он осуществляется одним из ферментов, переносимых вирусом, называемым обратной транскриптазой . После того, как эта копия ДНК произведена и находится в свободном состоянии в ядре клетки-хозяина, она должна быть включена в геном клетки-хозяина. То есть она должна быть вставлена в большие молекулы ДНК в клетке (хромосомы). Этот процесс выполняется другим ферментом, переносимым вирусом, называемым интегразой . [ необходима цитата ]
Теперь, когда генетический материал вируса был вставлен, можно сказать, что клетка-хозяин была модифицирована, чтобы содержать новые гены. Если эта клетка-хозяин позже разделится, ее потомки будут все содержать новые гены. Иногда гены ретровируса не выражают свою информацию немедленно. [ необходима цитата ]
Одной из проблем генной терапии с использованием ретровирусов является то, что фермент интеграза может вставлять генетический материал вируса в любое произвольное положение в геноме хозяина; он случайным образом вставляет генетический материал в хромосому. Если генетический материал случайно вставляется в середину одного из исходных генов клетки-хозяина, этот ген будет нарушен ( инсерционный мутагенез ). Если ген оказывается геном, регулирующим деление клеток, может возникнуть неконтролируемое деление клеток (т. е. рак ). Эту проблему недавно начали решать с помощью нуклеаз с цинковыми пальцами [1] или путем включения определенных последовательностей, таких как область контроля локуса бета-глобина, чтобы направить место интеграции в определенные хромосомные сайты.
Испытания генной терапии с использованием ретровирусных векторов для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита, сцепленного с Х-хромосомой (X-SCID), представляют собой наиболее успешное применение генной терапии на сегодняшний день. Более двадцати пациентов прошли лечение во Франции и Великобритании, при этом наблюдался высокий уровень восстановления иммунной системы. Аналогичные испытания были ограничены или остановлены в США, когда у пациентов, прошедших лечение во французском исследовании генной терапии X-SCID, была зарегистрирована лейкемия . [2] На сегодняшний день у четырех детей во французском исследовании и одного в британском исследовании развилась лейкемия в результате инсерционного мутагенеза ретровирусным вектором. Все, кроме одного из этих детей, хорошо отреагировали на традиционное лечение лейкемии. Испытания генной терапии для лечения SCID из-за дефицита фермента аденозиндезаминазы ( ADA ) (одна из форм SCID) [3] продолжаются с относительным успехом в США, Великобритании, Ирландии, Италии и Японии. [ необходима цитата ]
Аденовирусы — это вирусы, которые несут свой генетический материал в форме двухцепочечной ДНК. Они вызывают респираторные, кишечные и глазные инфекции у людей (особенно простуду). Когда эти вирусы заражают клетку-хозяина, они вводят в нее свою молекулу ДНК. Генетический материал аденовирусов не включается (транзиторно) в генетический материал клетки-хозяина. Молекула ДНК остается свободной в ядре клетки-хозяина, и инструкции в этой дополнительной молекуле ДНК транскрибируются так же, как и в любом другом гене. Единственное отличие заключается в том, что эти дополнительные гены не реплицируются, когда клетка собирается подвергнуться делению, поэтому у потомков этой клетки не будет дополнительного гена. [ необходима цитата ]
В результате лечение аденовирусом потребует повторного введения в растущую популяцию клеток, хотя отсутствие интеграции в геном клетки-хозяина должно предотвратить тип рака, наблюдаемый в испытаниях SCID. Эта векторная система была предложена для лечения рака, и действительно, первый продукт генной терапии, лицензированный для лечения рака, Gendicine , является аденовирусом. Gendicine, генная терапия на основе аденовируса p53, была одобрена китайскими регуляторами пищевых продуктов и лекарственных средств в 2003 году для лечения рака головы и шеи. Advexin, аналогичный подход генной терапии от Introgen, был отклонен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в 2008 году. [4]
Опасения по поводу безопасности векторов аденовируса возникли после смерти Джесси Гелсингера в 1999 году во время участия в исследовании генной терапии. С тех пор работа с использованием векторов аденовируса была сосредоточена на генетически ограниченных версиях вируса. [ необходима цитата ]
Цитомегаловирус (ЦМВ) является частью подсемейства β-герпесвирусов, включающего розеоловирусы. ЦМВ коэволюционировал с рядом млекопитающих-хозяев, включая человеческий ЦМВ (ЦМВ), мышиный ЦМВ (ЦМВ) и резус-ЦМВ (РhCMV). ЦМВ характеризуются большими геномами ДНК и, как правило, бессимптомной инфекцией у здоровых хозяев.
Первое исследование цитомегаловируса (ЦМВ) как вектора генной терапии было опубликовано в 2000 году. Тропизм ЦМВ к кроветворным клеткам-предшественникам и его большой геном (230 кбн) изначально привлекли исследователей. [5] С тех пор вакцинные векторы на основе ЦМВ использовались для индукции ответа Т-клеток. [6] Совсем недавно ЦМВ, содержащий теломеразу и фоллистатин, вводили внутривенно и интраназально в исследованиях на мышах с целью продления здоровой продолжительности жизни. [7]
Описанные выше вирусные векторы имеют естественные популяции клеток-хозяев, которые они инфицируют наиболее эффективно. Ретровирусы имеют ограниченные естественные диапазоны клеток-хозяев, и хотя аденовирус и аденоассоциированный вирус способны эффективно инфицировать относительно более широкий спектр клеток, некоторые типы клеток также устойчивы к инфицированию этими вирусами. Присоединение к восприимчивой клетке и проникновение в нее опосредуется белковой оболочкой на поверхности вируса. Ретровирусы и аденоассоциированные вирусы имеют один белок, покрывающий их мембрану, в то время как аденовирусы покрыты как оболочечным белком, так и волокнами, которые отходят от поверхности вируса. Оболочечные белки на каждом из этих вирусов связываются с молекулами клеточной поверхности, такими как сульфат гепарина , который локализует их на поверхности потенциального хозяина, а также со специфическим белковым рецептором, который либо вызывает структурные изменения вирусного белка, способствующие проникновению, либо локализует вирус в эндосомах , где закисление просвета вызывает эту повторную укладку вирусной оболочки . В любом случае, проникновение в потенциальные клетки-хозяева требует благоприятного взаимодействия между белком на поверхности вируса и белком на поверхности клетки. [ необходима цитата ]
Для целей генной терапии можно либо ограничить, либо расширить диапазон клеток, восприимчивых к трансдукции вектором генной терапии. С этой целью было разработано много векторов, в которых эндогенные белки вирусной оболочки были заменены либо белками оболочки из других вирусов, либо химерными белками. Такая химера будет состоять из тех частей вирусного белка, которые необходимы для включения в вирион, а также последовательностей, предназначенных для взаимодействия со специфическими белками клетки-хозяина. Вирусы, в которых белки оболочки были заменены, как описано, называются псевдотипированными вирусами . Например, самым популярным ретровирусным вектором для использования в испытаниях генной терапии был лентивирусный вирус иммунодефицита обезьян , покрытый белками оболочки, G-белком , из вируса везикулярного стоматита . Этот вектор называется VSV G-псевдотипированным лентивирусом и заражает почти универсальный набор клеток. Этот тропизм характерен для G-белка VSV, которым покрыт этот вектор. Было сделано много попыток ограничить тропизм вирусных векторов одной или несколькими популяциями клеток-хозяев. Этот прогресс позволил бы системно вводить относительно небольшое количество вектора. Потенциал для модификации нецелевых клеток был бы ограничен, и многие опасения медицинского сообщества были бы смягчены. Большинство попыток ограничить тропизм использовали химерные белки оболочки, несущие фрагменты антител . Эти векторы показывают большие перспективы для разработки генной терапии «волшебной пули». [ необходима цитата ]
Компетентный по репликации вектор ONYX-015 используется для репликации опухолевых клеток. Было обнаружено, что при отсутствии вирусного белка E1B-55Kd аденовирус вызывал очень быстрый апоптоз инфицированных клеток p53(+), что приводит к резкому сокращению потомства вируса и отсутствию последующего распространения. Апоптоз был в основном результатом способности EIA инактивировать p300. В клетках p53(-) делеция E1B 55kd не имеет последствий с точки зрения апоптоза, а репликация вируса аналогична репликации вируса дикого типа, что приводит к массовому уничтожению клеток. [ необходима цитата ]
Вектор с дефектом репликации удаляет некоторые важные гены. Эти удаленные гены все еще необходимы организму, поэтому они заменяются либо вирусом-помощником, либо молекулой ДНК. [8]
Векторы с дефектом репликации всегда содержат «конструкцию переноса». Конструкция переноса несет ген, который должен быть трансдуцирован или «трансген». Конструкция переноса также несет последовательности, которые необходимы для общего функционирования вирусного генома: последовательность упаковки, повторы для репликации и, при необходимости, праймирование обратной транскрипции. Это так называемые цис-действующие элементы, поскольку они должны находиться на том же участке ДНК, что и вирусный геном и интересующий ген. Транс-действующие элементы — это вирусные элементы, которые могут быть закодированы на другой молекуле ДНК. Например, вирусные структурные белки могут быть экспрессированы из другого генетического элемента, чем вирусный геном. [8]
Вирус простого герпеса — это нейротропный вирус человека. В основном его исследуют на предмет переноса генов в нервной системе. Дикий тип вируса HSV-1 способен инфицировать нейроны и уклоняться от иммунного ответа хозяина, но все равно может реактивироваться и вызывать литический цикл репликации вируса. Поэтому обычно используют мутантные штаммы HSV-1, которые лишены способности к репликации. Хотя латентный вирус не проявляется транскрипционно, он обладает специфическими для нейронов промоторами, которые могут продолжать нормально функционировать. [ необходимо дополнительное объяснение ] Антитела к HSV-1 часто встречаются у людей, однако осложнения, вызванные инфекцией герпеса, встречаются довольно редко. [9] Необходимо проявлять осторожность в отношении редких случаев энцефалита, и это дает некоторое обоснование для использования HSV-2 в качестве вирусного вектора, поскольку он, как правило , имеет тропизм к нейрональным клеткам, иннервирующим урогенитальную область тела, и может затем избавить хозяина от тяжелой патологии в мозге. [ необходима цитата ]
Невирусные методы имеют определенные преимущества по сравнению с вирусными методами, при этом простое крупномасштабное производство и низкая иммуногенность хозяина являются всего лишь двумя из них. Ранее низкие уровни трансфекции и экспрессии гена ставили невирусные методы в невыгодное положение; однако недавние достижения в области векторной технологии дали молекулы и методы с эффективностью трансфекции, аналогичной эффективности вирусов. [10]
Это самый простой метод невирусной трансфекции. Клинические испытания, проведенные с внутримышечной инъекцией плазмиды голой ДНК, прошли с некоторым успехом; однако, экспрессия была очень низкой по сравнению с другими методами трансфекции. В дополнение к испытаниям с плазмидами, были испытания с голым продуктом ПЦР , которые имели аналогичный или больший успех. Клеточное поглощение голой ДНК, как правило, неэффективно. Исследовательские усилия, сосредоточенные на повышении эффективности поглощения голой ДНК, привели к появлению нескольких новых методов, таких как электропорация , сонопорация и использование « генной пушки », которая стреляет покрытыми ДНК золотыми частицами в клетку с помощью газа высокого давления. [11]
Электропорация — это метод, который использует короткие импульсы высокого напряжения для переноса ДНК через клеточную мембрану. Считается, что этот шок вызывает временное образование пор в клеточной мембране, позволяя молекулам ДНК проходить через нее. Электропорация, как правило, эффективна и работает в широком диапазоне типов клеток. Однако высокая скорость гибели клеток после электропорации ограничивает ее применение, включая клиническое применение.
Совсем недавно в экспериментах по генной терапии использовался новый метод электропорации, называемый электронно-лавинной трансфекцией. Используя высоковольтный плазменный разряд, ДНК эффективно доставлялась после очень коротких (микросекундных) импульсов. По сравнению с электропорацией, этот метод привел к значительному повышению эффективности и меньшему повреждению клеток.
Использование бомбардировки частицами, или генной пушки , является еще одним физическим методом трансфекции ДНК. В этой технике ДНК покрывается золотыми частицами и загружается в устройство, которое генерирует силу для проникновения ДНК в клетки, оставляя золото позади на «тормозном» диске.
Сонопорация использует ультразвуковые частоты для доставки ДНК в клетки. Считается, что процесс акустической кавитации разрушает клеточную мембрану и позволяет ДНК проникать в клетки.
В методе, называемом магнитофекцией , ДНК связывается с магнитными частицами, а магнит помещается под чашку для культивирования тканей, чтобы привести комплексы ДНК в контакт с клеточным монослоем.
Гидродинамическая доставка подразумевает быструю инъекцию большого объема раствора в сосудистую систему (например, в нижнюю полую вену , желчный проток или хвостовую вену ). Раствор содержит молекулы, которые должны быть введены в клетки, такие как ДНК-плазмиды или siRNA , и перенос этих молекул в клетки осуществляется за счет повышенного гидростатического давления, вызванного большим объемом введенного раствора. [12] [13] [14]
Использование синтетических олигонуклеотидов в генной терапии заключается в дезактивации генов, вовлеченных в процесс заболевания. Существует несколько методов, с помощью которых это достигается. Одна стратегия использует антисмысловые последовательности , специфичные для целевого гена, чтобы нарушить транскрипцию дефектного гена. Другая использует небольшие молекулы РНК, называемые siRNA, чтобы подать сигнал клетке о необходимости расщепления определенных уникальных последовательностей в транскрипте мРНК дефектного гена, нарушая трансляцию дефектной мРНК и, следовательно, экспрессию гена. Еще одна стратегия использует двухцепочечные олигодезоксинуклеотиды в качестве приманки для факторов транскрипции, которые необходимы для активации транскрипции целевого гена. Факторы транскрипции связываются с приманками вместо промотора дефектного гена, что снижает транскрипцию целевого гена, снижая экспрессию. Кроме того, одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК использовались для управления изменением одного основания в мутантном гене. Олигонуклеотид предназначен для отжига с комплементарностью с целевым геном, за исключением центрального основания, целевого основания, которое служит в качестве шаблонной основы для восстановления. Этот метод называется репарацией генов с помощью олигонуклеотидов, целенаправленной репарацией генов или целенаправленным изменением нуклеотидов.
Для улучшения доставки новой ДНК в клетку ДНК должна быть защищена от повреждений и иметь положительный заряд. Первоначально для создания липоплексов для синтетических векторов использовались анионные и нейтральные липиды. Однако, несмотря на то, что они малотоксичны, совместимы с жидкостями организма и есть возможность адаптировать их для специфичности к тканям, их производство сложно и требует много времени, поэтому внимание было обращено на катионные версии.
Катионные липиды , благодаря своему положительному заряду, впервые были использованы для конденсации отрицательно заряженных молекул ДНК, чтобы облегчить инкапсуляцию ДНК в липосомы. Позже было обнаружено, что использование катионных липидов значительно повышает стабильность липоплексов. Также в результате своего заряда катионные липосомы взаимодействуют с клеточной мембраной, эндоцитоз широко считался основным путем, по которому клетки поглощают липоплексы. Эндосомы образуются в результате эндоцитоза, однако, если гены не могут быть высвобождены в цитоплазму путем разрушения мембраны эндосомы, они будут отправлены в лизосомы, где вся ДНК будет разрушена, прежде чем они смогут выполнить свои функции. Было также обнаружено, что хотя сами катионные липиды могут конденсировать и инкапсулировать ДНК в липосомы, эффективность трансфекции очень низкая из-за отсутствия способности с точки зрения «эндосомального выхода». Однако, когда липиды-помощники (обычно электронейтральные липиды, такие как ДОФЭ) добавлялись для формирования липоплексов, наблюдалась гораздо более высокая эффективность трансфекции. Позже было обнаружено, что некоторые липиды обладают способностью дестабилизировать эндосомальные мембраны, чтобы облегчить выход ДНК из эндосомы, поэтому эти липиды называются фузогенными липидами. Хотя катионные липосомы широко использовались в качестве альтернативы векторам доставки генов, также наблюдалась дозозависимая токсичность катионных липидов, что могло ограничить их терапевтическое применение. [15]
Наиболее распространенное применение липоплексов было в переносе генов в раковые клетки, где поставляемые гены активировали гены контроля опухолей-супрессоров в клетке и снижали активность онкогенов. Недавние исследования показали, что липоплексы полезны при трансфекции респираторных эпителиальных клеток .
Полимерсомы — это синтетические версии липосом ( везикул с липидным бислоем ), изготовленные из амфифильных блок-сополимеров . Они могут инкапсулировать как гидрофильное , так и гидрофобное содержимое и могут использоваться для доставки грузов, таких как ДНК, белки или лекарства, в клетки. Преимущества полимерсом перед липосомами включают большую стабильность, механическую прочность, время циркуляции крови и емкость для хранения. [16] [17] [18]
Комплексы полимеров с ДНК называются полиплексами. [15] [19] Большинство полиплексов состоят из катионных полимеров, и их изготовление основано на самосборке посредством ионных взаимодействий. Одним из важных различий между методами действия полиплексов и липоплексов является то, что полиплексы не могут напрямую высвобождать свою ДНК-загрузку в цитоплазму. В результате для облегчения выхода наночастиц из эндоцитарной везикулы, образованной во время захвата частиц, потребовалась котрансфекция с эндосомолитическими агентами, такими как инактивированный аденовирус. Однако лучшее понимание механизмов, с помощью которых ДНК может выходить из эндолизосомального пути, т. е. эффекта протонной губки, [20] вызвало новые стратегии синтеза полимеров, такие как включение протонируемых остатков в полимерную основу, и оживило исследования систем на основе поликатионов. [21]
Благодаря своей низкой токсичности, высокой грузоподъемности и простоте изготовления поликатионные наноносители демонстрируют большие перспективы по сравнению со своими конкурентами, такими как вирусные векторы, которые демонстрируют высокую иммуногенность и потенциальную канцерогенность, и векторы на основе липидов, которые вызывают токсичность, зависящую от дозы. Полиэтиленимин [22] и хитозан входят в число полимерных носителей, которые были широко изучены для разработки терапевтических средств доставки генов. Другие поликатионные носители, такие как поли(бета-аминоэфиры) [23] и полифосфорамидат [24], добавляются в библиотеку потенциальных носителей генов. В дополнение к разнообразию полимеров и сополимеров, простота контроля размера, формы, поверхностной химии этих полимерных наноносителей дает им преимущество в возможности нацеливания и использования преимуществ повышенной проницаемости и эффекта удержания. [25]
Дендример — это сильно разветвленная макромолекула сферической формы. Поверхность частицы может быть функционализирована многими способами, и многие свойства полученной конструкции определяются ее поверхностью.
В частности, можно построить катионный дендример, т.е. дендример с положительным поверхностным зарядом. При наличии генетического материала, такого как ДНК или РНК, комплементарность зарядов приводит к временной ассоциации нуклеиновой кислоты с катионным дендримером. Достигнув места назначения, комплекс дендример-нуклеиновая кислота затем попадает в клетку посредством эндоцитоза.
В последние годы эталоном для агентов трансфекции были катионные липиды. Сообщалось, что ограничения этих конкурирующих реагентов включают: отсутствие способности трансфицировать некоторые типы клеток, отсутствие надежных возможностей активного нацеливания, несовместимость с животными моделями и токсичность. Дендримеры предлагают надежную ковалентную конструкцию и экстремальный контроль над структурой молекулы и, следовательно, размером. Вместе они дают убедительные преимущества по сравнению с существующими подходами.
Производство дендримеров исторически было медленным и дорогим процессом, состоящим из многочисленных медленных реакций, препятствие, которое серьезно ограничивало их коммерческое развитие. Базирующаяся в Мичигане компания Dendritic Nanotechnologies открыла метод производства дендримеров с использованием кинетически управляемой химии, процесс, который не только снизил стоимость в три раза, но и сократил время реакции с более чем месяца до нескольких дней. Эти новые дендримеры «Priostar» могут быть специально сконструированы для переноса полезной нагрузки ДНК или РНК, которая трансфицирует клетки с высокой эффективностью с небольшой или нулевой токсичностью. [ необходима цитата ]
Неорганические наночастицы, такие как золото , кремний , оксид железа (например, магнитофекция ) и фосфаты кальция , как было показано, способны доставлять гены. [26] Некоторые из преимуществ неорганических векторов заключаются в их стабильности при хранении, низкой стоимости производства и часто времени, низкой иммуногенности и устойчивости к микробным атакам. Было показано, что наноразмерные материалы размером менее 100 нм эффективно улавливают ДНК или РНК и позволяют им выходить из эндосомы без деградации. Также было показано, что неорганические частицы демонстрируют улучшенную трансфекцию in vitro для прикрепленных клеточных линий из-за их повышенной плотности и предпочтительного расположения на основании культуральной чашки. Квантовые точки также успешно использовались и позволяют сочетать генную терапию со стабильным флуоресцентным маркером. Также разрабатываются сконструированные органические наночастицы, которые могут быть использованы для совместной доставки генов и терапевтических агентов. [27]
Клеточно-проникающие пептиды (CPP), также известные как домены пептидной трансдукции (PTD), представляют собой короткие пептиды (<40 аминокислот), которые эффективно проходят через клеточные мембраны, будучи ковалентно или нековалентно связанными с различными молекулами, тем самым облегчая проникновение этих молекул в клетки. Проникновение в клетки происходит в основном путем эндоцитоза , но существуют и другие механизмы проникновения. Примерами грузовых молекул CPP являются нуклеиновые кислоты , липосомы и препараты с низкой молекулярной массой. [28] [29]
Груз CPP может быть направлен в определенные клеточные органеллы путем включения последовательностей локализации в последовательности CPP. Например, последовательности ядерной локализации обычно используются для направления груза CPP в ядро. [30] Для направления в митохондрии может использоваться последовательность митохондриального нацеливания ; этот метод используется в протофекции (техника, которая позволяет вставлять чужеродную митохондриальную ДНК в митохондрии клеток). [31] [32]
Поскольку каждый метод переноса генов имеет недостатки, были разработаны некоторые гибридные методы, которые объединяют два или более методов. Виросомы являются одним из примеров; они объединяют липосомы с инактивированным вирусом ВИЧ или гриппа . Было показано, что это обеспечивает более эффективный перенос генов в респираторных эпителиальных клетках, чем только вирусные или липосомальные методы. Другие методы включают смешивание других вирусных векторов с катионными липидами или гибридизацию вирусов. [ необходима цитата ]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )Словарное определение полиплекса в Викисловаре