В молекулярной биологии и генетике трансформация — это генетическое изменение клетки , возникающее в результате прямого поглощения и включения экзогенного генетического материала из ее окружения через клеточную мембрану (мембраны). Чтобы трансформация произошла, бактерия-реципиент должна находиться в состоянии компетентности , которое может возникнуть в природе как ограниченный по времени ответ на условия окружающей среды, такие как голод и плотность клеток, а также может быть индуцировано в лаборатории. [1]
Трансформация — это один из трех процессов, которые приводят к горизонтальному переносу генов , при котором экзогенный генетический материал переходит от одной бактерии к другой, два других — это конъюгация (перенос генетического материала между двумя бактериальными клетками при прямом контакте) и трансдукция (инъекция чужеродной ДНК). вирусом- бактериофагом в бактерию-хозяин). [1] При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и его усвоение полностью зависит от бактерии-реципиента. [1]
По состоянию на 2014 год было известно, что около 80 видов бактерий способны к трансформации, причем примерно поровну между грамположительными и грамотрицательными бактериями ; это число может быть завышенным, поскольку некоторые отчеты подкреплены отдельными статьями. [1]
«Трансформация» также может использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку « трансформация » имеет особое значение по отношению к клеткам животных, указывая на переход в раковое состояние, этот процесс обычно называют « трансфекцией ». [2]
Трансформация бактерий была впервые продемонстрирована в 1928 году британским бактериологом Фредериком Гриффитом . [3] Гриффита интересовало, можно ли использовать инъекции убитых нагреванием бактерий для вакцинации мышей против пневмонии. Однако он обнаружил, что невирулентный штамм Streptococcus pneumoniae может стать вирулентным после воздействия вирулентных штаммов, убитых нагреванием. Гриффит предположил, что некий « принцип трансформации » штамма, убитого нагреванием, сделал безвредный штамм вирулентным. В 1944 году Освальд Эйвери , Колин Маклауд и Маклин Маккарти определили этот «преобразующий принцип» как генетический . Они выделили ДНК из вирулентного штамма S. pneumoniae и, используя только эту ДНК, смогли сделать безвредный штамм вирулентным. Они назвали это поглощение и включение ДНК бактериями «трансформацией» (см. эксперимент Эйвери-Маклеода-Маккарти ) [4]. Результаты экспериментов Эйвери и др. были сначала скептически восприняты научным сообществом, и так продолжалось до тех пор, пока разработка генетических маркеров и открытие других методов генетического переноса ( конъюгация в 1947 году и трансдукция в 1953 году) Джошуа Ледербергом , что эксперименты Эйвери были приняты. [5]
Первоначально считалось, что Escherichia coli , широко используемый лабораторный организм, устойчива к трансформации. Однако в 1970 году Мортон Мандель и Акико Хига показали, что после обработки раствором хлорида кальция можно заставить E. coli поглощать ДНК бактериофага λ без использования фага-хелпера . [6] Два года спустя, в 1972 году, Стэнли Норман Коэн , Энни Чанг и Лесли Сюй показали, что CaCl
2лечение также эффективно для трансформации плазмидной ДНК. [7] Метод трансформации Манделя и Хиги позже был усовершенствован Дугласом Ханаханом . [8] Открытие искусственно индуцированной компетентности у E. coli создало эффективную и удобную процедуру трансформации бактерий, которая позволяет использовать более простые методы молекулярного клонирования в биотехнологиях и исследованиях , и теперь это обычно используемая лабораторная процедура.
Трансформация с помощью электропорации была разработана в конце 1980-х годов, что повысило эффективность трансформации in vitro и увеличило количество бактериальных штаммов , которые можно было трансформировать. [9] Трансформация животных и растительных клеток также была исследована: первая трансгенная мышь была создана путем инъекции гена крысиного гормона роста в эмбрион мыши в 1982 году. [10] В 1897 году бактерия, вызывавшая опухоли растений, Agrobacterium tumefaciens , был открыт, и в начале 1970-х годов было обнаружено, что агент, вызывающий опухоли, представляет собой ДНК- плазмиду , названную Ti-плазмидой . [11] Удалив из плазмиды гены, вызвавшие опухоль, и добавив новые гены, исследователи смогли заразить растения A. tumefaciens и позволить бактериям вставить выбранную ими ДНК в геномы растений. [12] Не все растительные клетки восприимчивы к заражению A. tumefaciens , поэтому были разработаны другие методы, включая электропорацию и микроинъекцию . [13] Бомбардировка частицами стала возможной благодаря изобретению Джоном Сэнфордом в 1980-х годах системы доставки биолистических частиц (генной пушки) . [14] [15] [16]
Трансформация — это одна из трех форм горизонтального переноса генов , которые происходят в природе среди бактерий, при которой ДНК, кодирующая признак, передается от одной бактерии к другой и интегрируется в геном реципиента путем гомологичной рекомбинации ; два других — это трансдукция , осуществляемая с помощью бактериофага , и конъюгация , при которой ген передается при прямом контакте между бактериями. [1] При трансформации генетический материал проходит через промежуточную среду, и его усвоение полностью зависит от бактерии-реципиента. [1]
Компетенция относится к временному состоянию способности поглощать экзогенную ДНК из окружающей среды; его можно вызвать в лаборатории. [1]
Похоже, это древний процесс, унаследованный от общего прокариотического предка, который является полезной адаптацией, способствующей рекомбинационной репарации повреждений ДНК, особенно повреждений, полученных в стрессовых условиях. Естественная генетическая трансформация, по-видимому, представляет собой адаптацию к восстановлению повреждений ДНК, которая также создает генетическое разнообразие . [1] [17]
Трансформация изучалась у важных с медицинской точки зрения видов грамотрицательных бактерий, таких как Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae и Vibrio cholerae . [18] Он также был изучен на грамотрицательных видах, обнаруженных в почве, таких как Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , и на грамотрицательных патогенах растений , таких как Ralstonia solanacearum и Xylella fastidiosa . [18] Трансформация грамположительных бактерий изучалась у важных с медицинской точки зрения видов, таких как Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus и Streptococcus sanguinis , а также у грамположительных почвенных бактерий Bacillus subtilis . [17] Об этом также сообщалось как минимум у 30 видов Pseudomonadota , отнесенных к нескольким различным классам. [19] Наиболее изученными Pseudomonadota в отношении трансформации являются важные с медицинской точки зрения патогены человека Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae и Helicobacter pylori . [17]
«Трансформация» также может использоваться для описания внедрения нового генетического материала в небактериальные клетки, включая клетки животных и растений; однако, поскольку « трансформация » имеет особое значение по отношению к клеткам животных, указывая на переход в раковое состояние, этот процесс обычно называют « трансфекцией ». [2]
Естественно компетентные бактерии несут наборы генов, которые обеспечивают белковый механизм для переноса ДНК через клеточную мембрану(ы). Для транспорта экзогенной ДНК в клетки могут потребоваться белки, которые участвуют в сборке пилей типа IV и системы секреции типа II , а также комплекс ДНК- транслоказы на цитоплазматической мембране. [20]
Из-за различий в строении клеточной оболочки грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют некоторые различия в механизмах поглощения ДНК этими клетками, однако большинство из них имеют общие черты, включающие родственные белки. ДНК сначала связывается с поверхностью компетентных клеток на ДНК-рецепторе и проходит через цитоплазматическую мембрану посредством ДНК-транслоказы. [21] Только одноцепочечная ДНК может пройти, другая цепь при этом разрушается нуклеазами. Транслоцированная одноцепочечная ДНК затем может быть интегрирована в бактериальные хромосомы посредством RecA -зависимого процесса. В грамотрицательных клетках из-за наличия дополнительной мембраны ДНК требует наличия канала, образованного секретинами на внешней мембране. Пилин может потребоваться для компетентности, но его роль неопределенна. [22] Поглощение ДНК, как правило, не является специфичным для последовательности, хотя у некоторых видов наличие специфических последовательностей поглощения ДНК может способствовать эффективному поглощению ДНК. [23]
Естественная трансформация — это бактериальная адаптация к переносу ДНК, которая зависит от экспрессии многочисленных бактериальных генов, продукты которых, по-видимому, ответственны за этот процесс. [20] [19] В целом трансформация – это сложный, энергозатратный процесс развития. Для того чтобы бактерия связалась, забрала и рекомбинировала экзогенную ДНК в свою хромосому, она должна стать компетентной, т. е. войти в особое физиологическое состояние. Развитие компетентности Bacillus subtilis требует экспрессии около 40 генов. [24] ДНК, интегрированная в хромосому хозяина, обычно (но за редкими исключениями) происходит от другой бактерии того же вида и, таким образом, гомологична резидентной хромосоме.
У B. subtilis длина перенесенной ДНК превышает 1271 т.п.н. (более 1 млн оснований). [25] Передаваемая длина, вероятно, представляет собой двухцепочечную ДНК и часто составляет более трети общей длины хромосомы, составляющей 4215 т.п.н. [26] Похоже, что около 7-9% клеток-реципиентов занимают всю хромосому. [27]
Способность к естественной трансформации, по-видимому, присутствует у ряда прокариот, и на данный момент известно, что 67 видов прокариот (в семи различных типах) подвергаются этому процессу. [19]
Способность к трансформации обычно индуцируется высокой плотностью клеток и/или ограничением питания, условиями, связанными со стационарной фазой бактериального роста. Трансформация Haemophilus influenzae происходит наиболее эффективно в конце экспоненциального роста, когда рост бактерий приближается к стационарной фазе. [28] Трансформация у Streptococcus mutans , как и у многих других стрептококков, происходит при высокой плотности клеток и связана с образованием биопленок . [29] Компетентность B. subtilis индуцируется ближе к концу логарифмического роста, особенно в условиях ограничения аминокислот. [30] Аналогично, у Micrococcus luteus (представителя менее изученного типа Actinomycetota ) компетентность развивается во время средне-поздней фазы экспоненциального роста и также запускается аминокислотным голоданием. [31] [32]
Считается, что некоторые бактериофаги , высвобождая неповрежденную ДНК хозяина и плазмиды, способствуют трансформации. [33]
Компетентность конкретно индуцируется условиями, повреждающими ДНК. Например, у Streptococcus pneumoniae трансформация индуцируется агентами, повреждающими ДНК, митомицином С (агент, сшивающий ДНК) и фторхинолоном (ингибитор топоизомеразы, вызывающий двухцепочечные разрывы). [34] У B. subtilis трансформация усиливается под действием УФ-света, агента, повреждающего ДНК. [35] У Helicobacter pylori ципрофлоксацин, который взаимодействует с ДНК-гиразой и вводит двухцепочечные разрывы, индуцирует экспрессию генов компетентности, тем самым увеличивая частоту трансформации. [36] Используя Legionella pneumophila , Charpentier et al. [37] протестировали 64 токсичные молекулы, чтобы определить, какие из них вызывают компетентность. Из них только шесть агентов, повреждающих ДНК, вызвали сильную индукцию. Этими агентами, повреждающими ДНК, были митомицин С (который вызывает межцепочечные сшивки ДНК), норфлоксацин, офлоксацин и налидиксовая кислота (ингибиторы ДНК-гиразы, вызывающие двухцепочечные разрывы [38] ), бицикломицин (вызывающий одно- и двухцепочечные разрывы [38] ). 39] ) и гидроксимочевина (индуцирует окисление оснований ДНК [40] ). УФ-свет также индуцировал компетентность L. pneumophila . Шарпантье и др. [37] предположили, что способность к трансформации, вероятно, развилась как реакция на повреждение ДНК.
Логарифмически растущие бактерии отличаются от бактерий, находящихся в стационарной фазе, количеством копий генома, присутствующих в клетке, и это влияет на способность осуществлять важный процесс репарации ДНК . Во время логарифмического роста в бактериальной клетке могут присутствовать две или более копии любого конкретного участка хромосомы, поскольку деление клетки не совсем точно соответствует репликации хромосомы. Процесс гомологичной рекомбинационной репарации (HRR) является ключевым процессом репарации ДНК, который особенно эффективен для восстановления двухцепочечных повреждений, таких как двухцепочечные разрывы. Этот процесс зависит от наличия второй гомологичной хромосомы в дополнение к поврежденной хромосоме. Во время логарифмического роста повреждение ДНК в одной хромосоме может быть исправлено с помощью HRR, используя информацию о последовательности из другой гомологичной хромосомы. Однако когда клетки достигают стационарной фазы, они обычно имеют только одну копию хромосомы, и HRR требует ввода гомологичной матрицы извне клетки путем трансформации. [41]
Чтобы проверить, является ли адаптивная функция трансформации репарацией повреждений ДНК, была проведена серия экспериментов с использованием B. subtilis, облученной УФ-светом, в качестве повреждающего агента (обзоры Michod et al. [42] и Bernstein et al. [41] ] ) Результаты этих экспериментов показали, что трансформация ДНК способствует восстановлению потенциально смертельных повреждений ДНК, вызванных УФ-светом в ДНК-реципиенте. Конкретным процессом, ответственным за ремонт, скорее всего, был HRR. Трансформацию у бактерий можно рассматривать как примитивный половой процесс, поскольку он включает взаимодействие гомологичной ДНК двух особей с образованием рекомбинантной ДНК, которая передается последующим поколениям. Бактериальная трансформация у прокариот, возможно, была наследственным процессом, который привел к мейотическому половому размножению у эукариот (см. Эволюция полового размножения ; Мейоз ).
Искусственную компетентность можно вызвать с помощью лабораторных процедур, которые включают в себя создание пассивной проницаемости клетки для ДНК путем воздействия на нее условий, которые обычно не встречаются в природе. [43] Обычно клетки инкубируют в растворе, содержащем двухвалентные катионы (часто хлорид кальция ) в холодных условиях, а затем подвергают воздействию теплового импульса (теплового шока). Хлорид кальция частично разрушает клеточную мембрану, что позволяет рекомбинантной ДНК проникнуть в клетку-хозяина. Клетки, способные усваивать ДНК, называются компетентными клетками.
Установлено, что рост грамотрицательных бактерий в 20 мМ Mg снижает количество связей белок-липополисахарид за счет увеличения соотношения ионных и ковалентных связей, что увеличивает текучесть мембран, облегчая трансформацию. [44] Роль липополисахаридов здесь подтверждается наблюдением, что более короткие О-боковые цепи трансформируются более эффективно – возможно, из-за улучшения доступности ДНК.
Поверхность бактерий, таких как E. coli, заряжена отрицательно из-за фосфолипидов и липополисахаридов на поверхности клеток, а ДНК также заряжена отрицательно. Таким образом, одной из функций двухвалентного катиона может быть экранирование зарядов путем координации фосфатных групп и других отрицательных зарядов, тем самым позволяя молекуле ДНК прилипать к поверхности клетки.
Вход ДНК в клетки E. coli осуществляется через каналы, известные как зоны адгезии или соединение Байера, при этом типичная клетка несет до 400 таких зон. Их роль была установлена, когда было обнаружено, что кобаламин (который также использует эти каналы) конкурентно ингибирует поглощение ДНК. Другой тип каналов, участвующих в поглощении ДНК, состоит из поли (HB): поли P: Ca. Предполагается, что в этом случае поли (HB) обертывается вокруг ДНК (которая сама по себе является полифосфатом) и удерживается в щите, образованном ионами Са. [44]
Предполагается, что воздействие на клетки двухвалентными катионами в холодном состоянии также может изменить или ослабить структуру клеточной поверхности, делая ее более проницаемой для ДНК. Считается, что тепловой импульс создает тепловой дисбаланс в клеточной мембране, который заставляет ДНК проникать в клетки либо через клеточные поры, либо через поврежденную клеточную стенку.
Электропорация - еще один метод повышения компетентности. В этом методе клетки кратковременно подвергают электрическому полю напряженностью 10-20 кВ /см, которое, как полагают, создает отверстия в клеточной мембране, через которые может проникнуть плазмидная ДНК. После удара электрическим током отверстия быстро закрываются механизмами восстановления клеточной мембраны.
Большинство видов дрожжей , включая Saccharomyces cerevisiae , могут быть трансформированы экзогенной ДНК из окружающей среды. Было разработано несколько методов, облегчающих это преобразование с высокой частотой в лаборатории. [45]
Эффективность . Различные роды и виды дрожжей поглощают чужеродную ДНК с разной эффективностью. [53] Кроме того, большинство протоколов трансформации были разработаны для пекарских дрожжей S. cerevisiae и, следовательно, могут быть неоптимальными для других видов. Даже внутри одного вида разные штаммы имеют разную эффективность трансформации, иногда на три порядка. Например, когда штаммы S. cerevisiae были трансформированы 10 мкг плазмиды YEp13, штамм DKD-5D-H давал от 550 до 3115 колоний, тогда как штамм OS1 давал менее пяти колоний. [54]
Существует ряд методов переноса ДНК в растительные клетки. Некоторые векторно -опосредованные методы:
Некоторые безвекторные методы включают в себя:
Существует несколько методов получения трансгенных грибов, большинство из которых аналогичны тем, которые используются для растений. Однако к грибам следует относиться по-разному из-за некоторых их микроскопических и биохимических особенностей:
Как говорилось ранее, ряд методов, используемых для трансформации растений, также работает и с грибами:
Введение ДНК в клетки животных обычно называют трансфекцией и обсуждается в соответствующей статье.
Открытие искусственно индуцированной компетентности бактерий позволяет использовать такие бактерии, как Escherichia coli, в качестве удобного хозяина для манипуляций с ДНК, а также для экспрессии белков. Обычно плазмиды используют для трансформации в E.coli . Чтобы стабильно сохраняться в клетке, молекула плазмидной ДНК должна содержать точку начала репликации , позволяющую ей реплицироваться в клетке независимо от репликации собственной хромосомы клетки.
Эффективность, с которой компетентная культура может поглощать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены, известна как эффективность трансформации и измеряется в колониеобразующих единицах (КОЕ) на мкг использованной ДНК. Эффективность трансформации 1×10 8 КОЕ/мкг для небольшой плазмиды, такой как pUC19 , примерно эквивалентна 1 из 2000 молекул используемой трансформируемой плазмиды.
При трансформации хлорида кальция клетки готовят путем охлаждения клеток в присутствии Ca.2+
(в CaCl
2раствор), благодаря чему клетка становится проницаемой для плазмидной ДНК . Клетки инкубируют с ДНК на льду, а затем подвергают кратковременному тепловому шоку (например, при 42°C в течение 30–120 секунд). Этот метод очень хорошо работает для кольцевой плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно должны давать от 10 6 до 10 7 трансформантов на микрограмм плазмиды; плохой препарат будет около 10 4 /мкг или меньше, но хороший препарат компетентных клеток может дать до ~10 8 колоний на микрограмм плазмиды. [60] Однако существуют протоколы создания суперкомпетентных клеток, эффективность трансформации которых может превышать 10 9 . [61] Однако химический метод обычно не работает для линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, потому, что нативные ферменты клетки экзонуклеазы быстро разрушают линейную ДНК. Напротив, клетки, обладающие природной компетентностью, обычно более эффективно трансформируются линейной ДНК, чем плазмидной ДНК.
Эффективность трансформации с использованием CaCl
2Метод уменьшается с размером плазмиды, и поэтому электропорация может быть более эффективным методом поглощения большой плазмидной ДНК. [62] Клетки, используемые в электропорации, следует сначала подготовить путем промывания в холодной бидистиллированной воде для удаления заряженных частиц, которые могут создавать искры во время процесса электропорации.
Поскольку трансформация обычно приводит к смеси относительно небольшого количества трансформированных клеток и большого количества нетрансформированных клеток, необходим метод отбора клеток, которые приобрели плазмиду. [63] Таким образом, плазмида требует селектируемого маркера , чтобы клетки без плазмиды могли быть убиты или их рост был остановлен. Устойчивость к антибиотикам является наиболее часто используемым маркером прокариот. Трансформирующая плазмида содержит ген, придающий устойчивость к антибиотику, к которому в противном случае бактерии чувствительны. Смесь обработанных клеток культивируют на средах, содержащих антибиотик, так что только трансформированные клетки могут расти. Другой метод отбора — использование определенных ауксотрофных маркеров, которые могут компенсировать неспособность метаболизировать определенные аминокислоты, нуклеотиды или сахара. Этот метод требует использования мутированных соответствующим образом штаммов, у которых отсутствует синтез или полезность конкретной биомолекулы, а трансформированные клетки культивируют в среде, которая позволяет расти только клеткам, содержащим плазмиду.
В эксперименте по клонированию ген может быть вставлен в плазмиду, используемую для трансформации. Однако в таком эксперименте не все плазмиды могут содержать успешно вставленный ген. Поэтому можно дополнительно использовать дополнительные методы для скрининга трансформированных клеток, содержащих плазмиду со вставкой. Репортерные гены могут использоваться в качестве маркеров , например ген lacZ , который кодирует β-галактозидазу, используемую в сине-белом скрининге . Этот метод скрининга основан на принципе α- комплементации , при котором фрагмент гена lacZ ( lacZα ) в плазмиде может комплементировать другой мутантный ген lacZ ( lacZΔM15 ) в клетке. Оба гена сами по себе продуцируют нефункциональные пептиды, однако при совместной экспрессии, например, когда плазмида, содержащая lacZ-α, трансформируется в клетки lacZΔM15 , они образуют функциональную β-галактозидазу. Присутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить при выращивании клеток на чашках, содержащих X-gal , с образованием характерных синих колоний. Однако сайт множественного клонирования , где интересующий ген может быть связан с плазмидным вектором , расположен внутри гена lacZα . Таким образом, успешное лигирование разрушает ген lacZα , и функциональная β-галактозидаза не может образовываться, что приводит к образованию белых колоний. Клетки, содержащие успешно лигированную вставку, можно легко отличить по белому цвету от неудачно лигированных синих.
Другими часто используемыми репортерными генами являются зеленый флуоресцентный белок (GFP), который производит клетки, светящиеся зеленым под синим светом, и фермент люцифераза , который катализирует реакцию с люциферином для излучения света. Рекомбинантную ДНК также можно обнаружить с помощью других методов, таких как гибридизация нуклеиновой кислоты с радиоактивным зондом РНК, тогда как клетки, экспрессирующие желаемый белок из плазмиды, также можно обнаружить с помощью иммунологических методов.
{{cite journal}}
: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на февраль 2024 г. ( ссылка ){{cite journal}}
: CS1 maint: неподходящий URL ( ссылка )