Генная терапия использует доставку ДНК в клетки, которую можно осуществить несколькими методами, кратко изложенными ниже. Двумя основными классами методов являются те, которые используют рекомбинантные вирусы (иногда называемые биологическими наночастицами или вирусными векторами), и те, которые используют голую ДНК или комплексы ДНК (невирусные методы).
Все вирусы связываются со своими хозяевами и вводят свой генетический материал в клетку-хозяина в рамках цикла репликации. Этот генетический материал содержит основные «инструкции» о том, как производить больше копий этих вирусов, взламывая нормальный производственный механизм организма для удовлетворения потребностей вируса. Клетка-хозяин будет выполнять эти инструкции и производить дополнительные копии вируса, что приводит к инфицированию все большего и большего количества клеток. Некоторые типы вирусов встраивают свой геном в цитоплазму хозяина, но фактически не проникают в клетку. Другие проникают через клеточную мембрану под видом белковых молекул и проникают в клетку.
Выделяют два основных типа вирусной инфекции: литический и лизогенный . Вскоре после внедрения своей ДНК вирусы литического цикла быстро производят больше вирусов, вырываются из клетки и заражают больше клеток. Лизогенные вирусы интегрируют свою ДНК в ДНК клетки-хозяина и могут жить в организме в течение многих лет, прежде чем отреагировать на триггер. Вирус размножается так же, как клетка, и не причиняет телесного вреда, пока не сработает. Триггер высвобождает ДНК хозяина и использует ее для создания новых вирусов. [ нужна цитата ]
Генетический материал ретровирусов представлен в виде молекул РНК , а генетический материал их хозяев — в виде ДНК. Когда ретровирус заражает клетку-хозяина, он вводит в клетку свою РНК вместе с некоторыми ферментами, а именно обратной транскриптазой и интегразой . Эта молекула РНК ретровируса должна произвести копию ДНК из своей молекулы РНК, прежде чем ее можно будет интегрировать в генетический материал клетки-хозяина. Процесс создания копии ДНК из молекулы РНК называется обратной транскрипцией . Это осуществляется одним из ферментов, присутствующих в вирусе, называемым обратной транскриптазой . После того, как эта копия ДНК будет произведена и окажется в ядре клетки-хозяина, она должна быть включена в геном клетки-хозяина. То есть он должен быть встроен в большие молекулы ДНК в клетке (хромосомы). Этот процесс осуществляется другим ферментом, содержащимся в вирусе, называемым интегразой . [ нужна цитата ]
Теперь, когда генетический материал вируса внедрен, можно сказать, что клетка-хозяин была модифицирована и содержит новые гены. Если эта клетка-хозяин позже разделится, все ее потомки будут содержать новые гены. Иногда гены ретровируса не сразу выражают свою информацию. [ нужна цитата ]
Одна из проблем генной терапии с использованием ретровирусов состоит в том, что фермент интеграза может вставлять генетический материал вируса в любое произвольное положение генома хозяина; он случайным образом вставляет генетический материал в хромосому. Если генетический материал будет вставлен в середину одного из исходных генов клетки-хозяина, этот ген будет разрушен ( инсерционный мутагенез ). Если ген регулирует деление клеток, может произойти неконтролируемое деление клеток (т. е. рак ). Эту проблему недавно начали решать путем использования нуклеаз с цинковыми пальцами [1] или путем включения определенных последовательностей, таких как область контроля локуса бета-глобина, для направления сайта интеграции к определенным хромосомным сайтам.
Испытания генной терапии с использованием ретровирусных векторов для лечения Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID) представляют собой наиболее успешное применение генной терапии на сегодняшний день. Более двадцати пациентов прошли лечение во Франции и Великобритании, при этом наблюдался высокий уровень восстановления иммунной системы. Подобные исследования были ограничены или прекращены в США, когда сообщалось о лейкемии у пациентов, проходивших лечение во французском исследовании генной терапии X-SCID. [2] На сегодняшний день у четырех детей во французском исследовании и у одного в британском исследовании развилась лейкемия в результате инсерционного мутагенеза ретровирусным вектором. Все дети, кроме одного, хорошо реагировали на традиционное противолейкозное лечение. Испытания генной терапии для лечения ТКИД из-за дефицита фермента аденозиндезаминазы ( АДА ) (одна из форм ТКИН) [3] продолжаются с относительным успехом в США, Великобритании, Ирландии, Италии и Японии. [ нужна цитата ]
Аденовирусы – это вирусы, которые несут свой генетический материал в виде двухцепочечной ДНК. Они вызывают у человека респираторные, кишечные и глазные инфекции (особенно простуду). Когда эти вирусы заражают клетку-хозяина, они вводят в хозяина свою молекулу ДНК. Генетический материал аденовирусов не включен (временно) в генетический материал клетки-хозяина. Молекула ДНК остается свободной в ядре клетки-хозяина, и инструкции в этой дополнительной молекуле ДНК транскрибируются так же, как и в любом другом гене. Единственное отличие состоит в том, что эти дополнительные гены не реплицируются, когда клетка готовится к делению, поэтому потомки этой клетки не будут иметь дополнительного гена. [ нужна цитата ]
В результате лечение аденовирусом потребует повторного введения в растущую популяцию клеток, хотя отсутствие интеграции в геном клетки-хозяина должно предотвратить тип рака, наблюдаемый в исследованиях SCID. Эту векторную систему рекламировали для лечения рака, и действительно, первый продукт генной терапии, получивший лицензию на лечение рака, Гендицин , представляет собой аденовирус. Гендицин, генная терапия на основе аденовирусного р53, был одобрен китайскими органами регулирования пищевых продуктов и лекарств в 2003 году для лечения рака головы и шеи. Адвексин, аналогичный метод генной терапии от Introgen, был отклонен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в 2008 году. [4]
Опасения по поводу безопасности аденовирусных векторов возникли после смерти Джесси Гелсингера в 1999 году во время его участия в испытаниях генной терапии. С тех пор работа с использованием аденовирусных векторов была сосредоточена на генетически ограниченных версиях вируса. [ нужна цитата ]
Цитомегаловирус (ЦМВ) относится к подсемейству β-герпесвирусов, в которое входят розеоловирусы. ЦМВ развивался одновременно с рядом хозяев-млекопитающих, включая ЦМВ человека (ЦМВС), ЦМВ мыши (ЦМВЦ) и ЦМВ-резус (RhCMV). ЦМВ характеризуются крупными ДНК-геномами и обычно бессимптомным течением инфекции у здоровых хозяев.
Первое исследование цитомегаловируса (ЦМВ) как вектора генной терапии было опубликовано в 2000 году. Тропизм ЦМВ к гемопоэтическим клеткам-предшественникам и его большой геном (230 т.п.н.) первоначально привлекли исследователей. [5] Вакцинные векторы на основе ЦМВ с тех пор используются для индукции Т-клеточного ответа. [6] Совсем недавно ЦМВ, содержащий теломеразу и фоллистатин, вводился внутривенно и интраназально в исследованиях на мышах с целью увеличения продолжительности жизни. [7]
Описанные выше вирусные векторы имеют естественные популяции клеток-хозяев, которые они инфицируют наиболее эффективно. Ретровирусы имеют ограниченный диапазон естественных клеток-хозяев, и хотя аденовирус и аденоассоциированный вирус способны эффективно инфицировать относительно более широкий диапазон клеток, некоторые типы клеток также устойчивы к заражению этими вирусами. Прикрепление и проникновение в восприимчивую клетку опосредованы белковой оболочкой на поверхности вируса. Мембрана ретровирусов и аденоассоциированных вирусов покрыта одним белком, тогда как аденовирусы покрыты как белком оболочки, так и волокнами, отходящими от поверхности вируса. Белки оболочки каждого из этих вирусов связываются с молекулами клеточной поверхности, такими как сульфат гепарина , который локализует их на поверхности потенциального хозяина, а также со специфическим белковым рецептором , который либо индуцирует структурные изменения, способствующие проникновению в вирусный белок. или локализует вирус в эндосомах , где подкисление просвета вызывает повторное сворачивание вирусной оболочки . В любом случае проникновение в потенциальные клетки-хозяева требует благоприятного взаимодействия между белком на поверхности вируса и белком на поверхности клетки. [ нужна цитата ]
Для целей генной терапии можно либо ограничить, либо расширить диапазон клеток, чувствительных к трансдукции вектором генной терапии. С этой целью было разработано множество векторов, в которых эндогенные белки оболочки вируса заменены либо белками оболочки других вирусов, либо химерными белками. Такая химера будет состоять из тех частей вирусного белка, которые необходимы для включения в вирион, а также последовательностей, предназначенных для взаимодействия со специфическими белками клетки-хозяина. Вирусы, у которых белки оболочки были заменены, как описано, называются псевдотипированными вирусами . Например, наиболее популярным ретровирусным вектором для использования в исследованиях генной терапии был лентивирус вируса иммунодефицита обезьян, покрытый оболочечными белками, G-белком , из вируса везикулярного стоматита . Этот вектор называется G-псевдотипированным лентивирусом VSV и инфицирует практически универсальный набор клеток. Этот тропизм характерен для G-белка VSV, которым покрыт этот вектор. Было предпринято множество попыток ограничить тропизм вирусных векторов одной или несколькими популяциями клеток-хозяев. Это достижение позволит обеспечить системное введение относительно небольшого количества переносчика. Потенциал нецелевой модификации клеток будет ограничен, и многие опасения медицинского сообщества будут сняты. В большинстве попыток ограничить тропизм использовались химерные белки оболочки, несущие фрагменты антител . Эти векторы демонстрируют большие перспективы для разработки «волшебной пули» генной терапии. [ нужна цитата ]
Репликационно-компетентный вектор под названием ONYX-015 используется для репликации опухолевых клеток. Было обнаружено, что в отсутствие вирусного белка E1B-55Kd аденовирус вызывает очень быстрый апоптоз инфицированных клеток p53(+), что приводит к резкому снижению потомства вируса и отсутствию последующего распространения. Апоптоз был главным образом результатом способности EIA инактивировать р300. В клетках p53(-) делеция E1B 55kd не имеет последствий с точки зрения апоптоза, а репликация вируса аналогична репликации вируса дикого типа, что приводит к массовой гибели клеток. [ нужна цитата ]
Вектор с дефектом репликации удаляет некоторые важные гены. Эти удаленные гены все еще необходимы в организме, поэтому их заменяют либо вирусом-помощником, либо молекулой ДНК. [8]
Векторы с дефектами репликации всегда содержат «конструкцию переноса». Транспортная конструкция несет ген, подлежащий трансдукции, или «трансген». Транспортная конструкция также содержит последовательности, необходимые для общего функционирования вирусного генома: упаковочную последовательность, повторы для репликации и, при необходимости, прайминг обратной транскрипции. Это так называемые цис-действующие элементы, поскольку они должны находиться на том же участке ДНК, что и вирусный геном и интересующий ген. Транс-действующие элементы — это вирусные элементы, которые могут кодироваться другой молекулой ДНК. Например, вирусные структурные белки могут экспрессироваться из генетического элемента, отличного от вирусного генома. [8]
Вирус простого герпеса является нейротропным вирусом человека. В основном это исследуется на предмет переноса генов в нервной системе. Вирус HSV-1 дикого типа способен инфицировать нейроны и уклоняться от иммунного ответа хозяина, но все же может реактивироваться и вызывать литический цикл репликации вируса. Поэтому типично использовать мутантные штаммы ВПГ-1, лишенные способности к репликации. Хотя латентный вирус не проявляется транскрипционно, он обладает специфическими для нейронов промоторами, которые могут продолжать нормально функционировать. [ необходимо дальнейшее объяснение ] Антитела к ВПГ-1 часто встречаются у людей, однако осложнения, вызванные герпесной инфекцией, встречаются довольно редко. [9] Необходимо соблюдать осторожность в редких случаях энцефалита, и это дает некоторое обоснование для использования ВПГ-2 в качестве вирусного вектора, поскольку он обычно обладает тропизмом к нейрональным клеткам, иннервирующим урогенитальную область тела, и может затем избавить хозяина от тяжелой патологии. в мозгу. [ нужна цитата ]
Невирусные методы имеют определенные преимущества перед вирусными методами: простота крупномасштабного производства и низкая иммуногенность хозяина - это всего лишь два из них. Ранее низкие уровни трансфекции и экспрессии гена ставили невирусные методы в невыгодное положение; однако недавние достижения в области векторных технологий позволили создать молекулы и методы с эффективностью трансфекции, аналогичной эффективности вирусов. [10]
Это самый простой метод невирусной трансфекции. Клинические испытания внутримышечной инъекции голой ДНК- плазмиды прошли с некоторым успехом; однако экспрессия была очень низкой по сравнению с другими методами трансфекции. Помимо испытаний с плазмидами, проводились испытания с «голым» продуктом ПЦР , которые имели аналогичный или больший успех. Поглощение «голой» ДНК клетками обычно неэффективно. Исследовательские усилия, направленные на повышение эффективности поглощения обнаженной ДНК, привели к появлению нескольких новых методов, таких как электропорация , сонопорация и использование « генной пушки », которая стреляет в клетку частицами золота, покрытыми ДНК, с помощью газа под высоким давлением. [11]
Электропорация — это метод, в котором используются короткие импульсы высокого напряжения для переноса ДНК через клеточную мембрану. Считается, что этот шок вызывает временное образование пор в клеточной мембране, позволяющих молекулам ДНК проходить через них. Электропорация, как правило, эффективна и действует на широкий спектр типов клеток. Однако высокий уровень гибели клеток после электропорации ограничивает его использование, в том числе в клинических целях.
Совсем недавно в экспериментах по генной терапии был использован новый метод электропорации, названный электронно-лавинной трансфекцией. Используя высоковольтный плазменный разряд, ДНК эффективно доставлялась с помощью очень коротких (микросекундных) импульсов. По сравнению с электропорацией этот метод позволил значительно повысить эффективность и уменьшить повреждение клеток.
Использование бомбардировки частицами или генной пушки — еще один физический метод трансфекции ДНК. В этом методе ДНК наносится на частицы золота и загружается в устройство, которое генерирует силу, обеспечивающую проникновение ДНК в клетки, оставляя золото на «останавливающемся» диске.
Сонопорация использует ультразвуковые частоты для доставки ДНК в клетки. Считается, что процесс акустической кавитации разрушает клеточную мембрану и позволяет ДНК проникать в клетки.
В методе, называемом магнитофекцией , ДНК образует комплекс с магнитными частицами, а магнит помещается под чашку с тканевой культурой, чтобы привести комплексы ДНК в контакт с клеточным монослоем.
Гидродинамическая доставка включает быстрое введение большого объема раствора в сосудистую сеть (например, в нижнюю полую вену , желчный проток или хвостовую вену ). Раствор содержит молекулы, которые необходимо встроить в клетки, такие как ДНК-плазмиды или миРНК , и переносу этих молекул в клетки способствует повышенное гидростатическое давление, вызванное большим объемом инъецируемого раствора. [12] [13] [14]
Использование синтетических олигонуклеотидов в генной терапии направлено на дезактивацию генов, участвующих в патологическом процессе. Существует несколько методов, с помощью которых это достигается. Одна из стратегий использует антисмысловую специфичность гена-мишени для нарушения транскрипции дефектного гена. Другой использует небольшие молекулы РНК, называемые миРНК, чтобы дать сигнал клетке расщеплять определенные уникальные последовательности в транскрипте мРНК дефектного гена, нарушая трансляцию дефектной мРНК и, следовательно, экспрессию гена. Другая стратегия использует двухцепочечные олигодезоксинуклеотиды в качестве приманки для факторов транскрипции, которые необходимы для активации транскрипции целевого гена. Факторы транскрипции связываются с ловушками вместо промотора дефектного гена, что снижает транскрипцию целевого гена, снижая его экспрессию. Кроме того, одноцепочечные ДНК-олигонуклеотиды использовались для управления изменением одного основания в мутантном гене. Олигонуклеотид предназначен для отжига с комплементарностью целевому гену, за исключением центрального основания, целевого основания, которое служит матричной основой для репарации. Этот метод называется репарацией генов, опосредованной олигонуклеотидами, целевой репарацией генов или целевым изменением нуклеотидов.
Чтобы улучшить доставку новой ДНК в клетку, ДНК должна быть защищена от повреждений и положительно заряжена. Первоначально анионные и нейтральные липиды использовались для построения липоплексов синтетических векторов. Однако, несмотря на то, что с ними связана небольшая токсичность, они совместимы с жидкостями организма и существует возможность адаптации их к тканеспецифическим свойствам; их производство сложно и требует много времени, поэтому внимание было обращено на катионные версии.
Катионные липиды из-за их положительного заряда впервые были использованы для конденсации отрицательно заряженных молекул ДНК, чтобы облегчить инкапсуляцию ДНК в липосомы. Позднее было установлено, что использование катионных липидов существенно повышает стабильность липоплексов. Кроме того, из-за своего заряда катионные липосомы взаимодействуют с клеточной мембраной, и широко распространено мнение, что эндоцитоз является основным путем поглощения клетками липоплексов. Эндосомы образуются в результате эндоцитоза, однако, если гены не могут быть высвобождены в цитоплазму путем разрушения мембраны эндосомы, они будут отправлены в лизосомы, где вся ДНК будет разрушена, прежде чем они смогут выполнить свои функции. Было также обнаружено, что хотя катионные липиды сами по себе могут конденсировать и инкапсулировать ДНК в липосомы, эффективность трансфекции очень низка из-за отсутствия способности к «эндосомальному выходу». Однако когда для образования липоплексов добавляли хелперные липиды (обычно электронейтральные липиды, такие как ДОФЕ), наблюдалась гораздо более высокая эффективность трансфекции. Позже было обнаружено, что некоторые липиды обладают способностью дестабилизировать эндосомальные мембраны, облегчая выход ДНК из эндосомы, поэтому эти липиды получили название фузогенных липидов. Хотя катионные липосомы широко используются в качестве альтернативы векторам доставки генов, также наблюдалась дозозависимая токсичность катионных липидов, что может ограничивать их терапевтическое применение. [15]
Наиболее распространенным применением липоплексов является перенос генов в раковые клетки, где поставляемые гены активируют в клетке гены, контролирующие опухолевые супрессоры, и снижают активность онкогенов. Недавние исследования показали, что липоплексы могут быть полезны для трансфекции респираторных эпителиальных клеток .
Полимерсомы — синтетические варианты липосом ( везикулы с липидным бислоем ), изготовленные из амфифильных блок-сополимеров . Они могут инкапсулировать как гидрофильное , так и гидрофобное содержимое и могут использоваться для доставки грузов, таких как ДНК, белки или лекарства, в клетки. Преимущества полимерсом перед липосомами включают большую стабильность, механическую прочность, время кровообращения и емкость хранения. [16] [17] [18]
Комплексы полимеров с ДНК называются полиплексами. [15] [19] Большинство полиплексов состоят из катионных полимеров, и их изготовление основано на самосборке за счет ионных взаимодействий. Одним из важных различий между методами действия полиплексов и липоплексов является то, что полиплексы не могут напрямую высвободить свою ДНК-нагрузку в цитоплазму. В результате потребовалась совместная трансфекция эндосомолитическими агентами, такими как инактивированный аденовирус, чтобы облегчить выход наночастиц из эндоцитарной везикулы, образующейся во время поглощения частиц. Однако лучшее понимание механизмов, с помощью которых ДНК может выйти из эндолизосомного пути, то есть эффекта протонной губки, [20] привело к появлению новых стратегий синтеза полимеров, таких как включение протонируемых остатков в основную цепь полимера, и активизировало исследования систем на основе поликатионов. [21]
Благодаря своей низкой токсичности, высокой нагрузочной способности и простоте изготовления поликатионные наноносители демонстрируют большие перспективы по сравнению со своими конкурентами, такими как вирусные векторы, которые демонстрируют высокую иммуногенность и потенциальную канцерогенность, а также векторы на основе липидов, которые вызывают дозозависимую токсичность. Полиэтиленимин [22] и хитозан входят в число полимерных носителей, которые широко изучались для разработки средств доставки генов. К библиотеке потенциальных носителей генов добавляются и другие поликатионные носители, такие как поли(бета-аминоэфиры) [23] и полифосфорамидат [24] . В дополнение к разнообразию полимеров и сополимеров, простота контроля размера, формы и химического состава поверхности этих полимерных наноносителей дает им преимущество в способности нацеливать и использовать преимущества повышенной проницаемости и эффекта удержания. [25]
Дендример – это сильно разветвленная макромолекула сферической формы. Поверхность частицы может быть функционализирована разными способами, и многие свойства полученной конструкции определяются ее поверхностью.
В частности, можно построить катионный дендример, т.е. дендример с положительным поверхностным зарядом. В присутствии генетического материала, такого как ДНК или РНК, комплементарность зарядов приводит к временной ассоциации нуклеиновой кислоты с катионным дендримером. Достигнув пункта назначения, комплекс дендример-нуклеиновая кислота попадает в клетку посредством эндоцитоза.
В последние годы эталоном трансфекционных агентов стали катионные липиды. Сообщается, что к ограничениям этих конкурирующих реагентов относятся: отсутствие способности трансфицировать некоторые типы клеток, отсутствие надежных возможностей активного нацеливания, несовместимость с моделями на животных и токсичность. Дендримеры обеспечивают надежную ковалентную конструкцию и исключительный контроль над структурой молекулы и, следовательно, над размером. В совокупности это дает убедительные преимущества по сравнению с существующими подходами.
Производство дендримеров исторически было медленным и дорогостоящим процессом, состоящим из множества медленных реакций, что серьезно ограничивало их коммерческое развитие. Компания Dendritic Nanotechnologies из Мичигана обнаружила метод производства дендримеров с использованием кинетической химии, процесс, который не только снизил стоимость в три раза, но и сократил время реакции с более чем месяца до нескольких дней. Эти новые дендримеры «Приостар» могут быть специально сконструированы так, чтобы нести полезную нагрузку ДНК или РНК, которая трансфицирует клетки с высокой эффективностью с минимальной токсичностью или без нее. [ нужна цитата ]
Было показано, что неорганические наночастицы, такие как золото , кремнезем , оксид железа (например, магнитофекция ) и фосфаты кальция , способны доставлять гены. [26] Некоторые из преимуществ неорганических векторов заключаются в их стабильности при хранении, низких производственных затратах и часто времени, низкой иммуногенности и устойчивости к микробному воздействию. Было показано, что наноразмерные материалы размером менее 100 нм эффективно улавливают ДНК или РНК и позволяют им выйти из эндосомы без деградации. Также было показано, что неорганические вещества демонстрируют улучшенную трансфекцию in vitro прикрепленных клеточных линий из-за их повышенной плотности и предпочтительного расположения на дне культуральной чашки. Квантовые точки также успешно используются и позволяют сочетать генную терапию со стабильным флуоресцентным маркером. Также разрабатываются искусственные органические наночастицы, которые можно будет использовать для совместной доставки генов и терапевтических агентов. [27]
Пептиды, проникающие в клетку (CPP), также известные как домены пептидной трансдукции (PTD), представляют собой короткие пептиды (<40 аминокислот), которые эффективно проходят через клеточные мембраны, будучи ковалентно или нековалентно связанными с различными молекулами, тем самым облегчая работу этих молекул. проникновение в клетки. Проникновение клеток происходит преимущественно путем эндоцитоза , но существуют и другие механизмы проникновения. Примеры грузовых молекул CPP включают нуклеиновые кислоты , липосомы и лекарства с низкой молекулярной массой. [28] [29]
Груз CPP может быть направлен в определенные клеточные органеллы путем включения последовательностей локализации в последовательности CPP. Например, последовательности ядерной локализации обычно используются для направления груза CPP в ядро. [30] Для направления в митохондрии можно использовать последовательность, нацеленную на митохондрии ; этот метод используется при протофекции (метод, позволяющий вставлять чужеродную митохондриальную ДНК в митохондрии клеток). [31] [32]
Поскольку каждый метод переноса генов имеет недостатки, были разработаны гибридные методы, сочетающие в себе два или более метода. Виросомы являются одним из примеров; они сочетают липосомы с инактивированным вирусом ВИЧ или гриппа . Было показано, что этот метод обеспечивает более эффективный перенос генов в респираторных эпителиальных клетках, чем только вирусные или липосомальные методы. Другие методы включают смешивание других вирусных векторов с катионными липидами или гибридизацию вирусов. [ нужна цитата ]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )Словарное определение полиплекса в Викисловаре