Кинетика ферментов

Изучение скорости биохимических реакций, катализируемых ферментом.

Дигидрофолатредуктаза из E. coli с двумя ее субстратами дигидрофолатом (справа) и НАДФН (слева), связанными в активном центре. Белок показан в виде ленточной диаграммы , где альфа-спирали показаны красным, бета-оболочки — желтым, а петли — синим. ( PDB : 7DFR ​)

Кинетика ферментов — это изучение скорости химических реакций , катализируемых ферментами . В кинетике ферментов измеряют скорость реакции и исследуют влияние изменения условий реакции. Изучение кинетики фермента таким способом может выявить каталитический механизм этого фермента, его роль в метаболизме , то, как контролируется его активность и как лекарство или модификатор ( ингибитор или активатор ) могут повлиять на скорость.

Фермент (Е) — это белковая молекула , которая служит биологическим катализатором, облегчая и ускоряя химическую реакцию в организме. Он делает это посредством связывания другой молекулы, ее субстрата (S), на который фермент воздействует с образованием желаемого продукта. Субстрат связывается с активным центром фермента с образованием комплекса фермент-субстрат ES и трансформируется в комплекс фермент-продукт EP, а оттуда в продукт P через переходное состояние ES*. Последовательность шагов известна как механизм :

Э + С ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P

В этом примере предполагается простейший случай реакции с одним субстратом и одним продуктом. Такие случаи существуют: например, мутаза , такая как фосфоглюкомутаза , катализирует перенос фосфогруппы из одного положения в другое, а изомераза — более общий термин для фермента, который катализирует любую односубстратную однопродуктовую реакцию, например триозофосфатизомераза . . Однако такие ферменты не очень распространены, и их численность значительно превосходит ферменты, катализирующие двухсубстратные реакции с двумя продуктами: к ним относятся, например, НАД-зависимые дегидрогеназы , такие как алкогольдегидрогеназа , которая катализирует окисление этанола НАД ⁺ . Реакции с тремя или четырьмя субстратами или продуктами встречаются реже, но они существуют. Нет необходимости, чтобы количество продуктов было равно количеству подложек; например, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа имеет три субстрата и два продукта.

Когда ферменты связывают несколько субстратов, таких как дигидрофолатредуктаза (показана справа), кинетика ферментов также может показать последовательность связывания этих субстратов и последовательность высвобождения продуктов. Примером ферментов, которые связывают один субстрат и высвобождают несколько продуктов, являются протеазы , которые расщепляют один белковый субстрат на два полипептидных продукта. Другие соединяют два субстрата вместе, например, ДНК-полимераза, связывающая нуклеотид с ДНК . Хотя эти механизмы часто представляют собой сложную серию этапов, обычно существует один этап, определяющий скорость , который определяет общую кинетику. Эта стадия, определяющая скорость, может представлять собой химическую реакцию или конформационное изменение фермента или субстратов, например тех, которые участвуют в высвобождении продукта(ов) из фермента.

Знание структуры фермента помогает при интерпретации кинетических данных. Например, структура может указывать на то, как субстраты и продукты связываются во время катализа; какие изменения происходят в ходе реакции; и даже роль отдельных аминокислотных остатков в этом механизме. Некоторые ферменты значительно меняют форму в ходе этого механизма; в таких случаях полезно определить структуру фермента со связанными аналогами субстрата и без них, которые не вступают в ферментативную реакцию.

Не все биологические катализаторы являются белковыми ферментами: катализаторы на основе РНК , такие как рибозимы и рибосомы , необходимы для многих клеточных функций, таких как сплайсинг и трансляция РНК . Основное различие между рибозимами и ферментами состоит в том, что РНК-катализаторы состоят из нуклеотидов, тогда как ферменты состоят из аминокислот. Рибозимы также выполняют более ограниченный набор реакций, хотя механизмы и кинетику их реакций можно анализировать и классифицировать теми же методами.

Общие принципы

По мере добавления к реакции большего количества субстрата доступные центры связывания фермента заполняются до предела . За этим пределом фермент насыщается субстратом и скорость реакции перестает увеличиваться. ${\displaystyle V_{\max }}$

В реакции, катализируемой ферментом, используются точно такие же реагенты и образуются точно те же продукты, что и в некатализируемой реакции. Как и другие катализаторы , ферменты не изменяют положение равновесия между субстратами и продуктами. ^[1] Однако, в отличие от некатализируемых химических реакций, реакции, катализируемые ферментами, демонстрируют кинетику насыщения. Для данной концентрации фермента и относительно низких концентраций субстрата скорость реакции линейно возрастает с концентрацией субстрата; Молекулы фермента в значительной степени могут катализировать реакцию, и увеличение концентрации субстрата означает увеличение скорости, с которой молекулы фермента и субстрата сталкиваются друг с другом. Однако при относительно высоких концентрациях субстрата скорость реакции асимптотически приближается к теоретическому максимуму; активные центры фермента почти все заняты субстратами, что приводит к насыщению, а скорость реакции определяется собственной скоростью оборота фермента. ^[2] Концентрация субстрата, находящаяся посередине между этими двумя предельными случаями, обозначается K _M . Таким образом, K _M — это концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной скорости. ^[2]

Двумя важными свойствами кинетики ферментов являются то, насколько легко фермент насыщается субстратом и максимальная скорость, которую он может достичь. Знание этих свойств позволяет предположить, что фермент может делать в клетке, и показать, как фермент будет реагировать на изменения в этих условиях.

Ферментные анализы

Кривая хода ферментативной реакции. Наклон в период начальной скорости представляет собой начальную скорость реакции v . Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает, как этот наклон меняется в зависимости от концентрации субстрата.

Ферментные анализы — это лабораторные процедуры, позволяющие измерить скорость ферментативных реакций. Поскольку ферменты не расходуются на реакции, которые они катализируют, ферментные анализы обычно отслеживают изменения концентрации субстратов или продуктов для измерения скорости реакции. Существует множество методов измерения. Спектрофотометрические анализы наблюдают за изменением поглощения света между продуктами и реагентами; Радиометрические анализы включают в себя введение или выброс радиоактивности для измерения количества продукта, полученного с течением времени. Спектрофотометрические анализы наиболее удобны, поскольку позволяют непрерывно измерять скорость реакции. Хотя радиометрические анализы требуют отбора и подсчета проб (т.е. они представляют собой прерывистые анализы), они обычно чрезвычайно чувствительны и могут измерять очень низкие уровни активности ферментов. ^[3] Аналогичным подходом является использование масс-спектрометрии для мониторинга включения или высвобождения стабильных изотопов по мере превращения субстрата в продукт. Иногда анализ терпит неудачу, и для восстановления неудачного анализа необходимы подходы.

В наиболее чувствительных ферментных анализах используются лазеры, сфокусированные через микроскоп , чтобы наблюдать изменения в отдельных молекулах ферментов по мере того, как они катализируют свои реакции. В этих измерениях используются либо изменения флуоресценции кофакторов во время механизма реакции фермента, либо флуоресцентные красители, добавляемые к определенным участкам белка , чтобы сообщить о движениях , происходящих во время катализа. ^[4] Эти исследования дают новый взгляд на кинетику и динамику отдельных ферментов, в отличие от традиционной кинетики ферментов, которая наблюдает среднее поведение популяций миллионов молекул ферментов. ^{[5] [6]}

Пример кривой прогресса ферментного анализа показан выше. Фермент производит продукт с начальной скоростью, которая приблизительно линейна в течение короткого периода после начала реакции. По мере того, как реакция протекает и субстрат расходуется, скорость постоянно замедляется (пока субстрат не находится на уровне насыщения). Чтобы измерить начальную (и максимальную) скорость, ферментные анализы обычно проводятся, когда реакция продвинулась всего на несколько процентов до полного завершения. Продолжительность периода начальной скорости зависит от условий анализа и может варьироваться от миллисекунд до часов. Однако оборудование для быстрого смешивания жидкостей позволяет проводить быстрые кинетические измерения с начальной скоростью менее одной секунды. ^[7] Эти очень быстрые анализы необходимы для измерения кинетики в предстационарном состоянии, которая обсуждается ниже.

Большинство исследований кинетики ферментов концентрируются на этой начальной, приблизительно линейной части ферментативных реакций. Однако также возможно измерить полную кривую реакции и подогнать эти данные к нелинейному уравнению скорости . Этот способ измерения ферментативных реакций называется анализом кривой прогресса. ^[8] Этот подход полезен в качестве альтернативы быстрой кинетике, когда начальная скорость слишком высока для точного измерения.

Рекомендации по стандартизации представления энзимологических данных предоставляют минимальную информацию, необходимую для полного отчета о кинетических и равновесных данных, полученных в результате исследований активности ферментов, включая соответствующие экспериментальные условия. Рекомендации были разработаны для того, чтобы предоставлять данные о функциональных ферментах со строгостью и надежностью.

Односубстратные реакции

Ферменты с односубстратным механизмом включают изомеразы , такие как триозофосфатизомераза или бисфосфоглицератмутаза , внутримолекулярные лиазы, такие как аденилатциклаза и рибозим «головка молотка» , РНК-лиаза. ^[9] Однако некоторые ферменты, имеющие только один субстрат, не попадают в эту категорию механизмов. Каталаза является примером этого, поскольку фермент реагирует с первой молекулой субстрата перекиси водорода , окисляется, а затем восстанавливается второй молекулой субстрата. Хотя задействован один субстрат, существование модифицированного промежуточного фермента означает, что механизм каталазы на самом деле представляет собой механизм пинг-понга, тип механизма, который обсуждается в разделе «Многосубстратные реакции» ниже.

Кинетика Михаэлиса – Ментен

Поскольку реакции, катализируемые ферментами, являются насыщаемыми, скорость их катализа не имеет линейной реакции на увеличение количества субстрата. Если начальная скорость реакции измеряется в диапазоне концентраций субстрата (обозначается как [S]), начальная скорость реакции ( ) увеличивается с увеличением [S], как показано справа. Однако по мере того, как [S] становится выше, фермент насыщается субстратом, и начальная скорость достигает V _max , максимальной скорости фермента. ${\displaystyle v_{0}}$

Кинетическая модель Михаэлиса -Ментен односубстратной реакции показана справа. Между ферментом Е и субстратом S происходит первоначальная бимолекулярная реакция с образованием фермент-субстратного комплекса ES. Скорость ферментативной реакции увеличивается с увеличением концентрации субстрата до определенного уровня, называемого V _max ; при V _max увеличение концентрации субстрата не вызывает увеличения скорости реакции, поскольку больше нет фермента (E), доступного для реакции с субстратом (S). При этом скорость реакции становится зависимой от комплекса ES и реакция становится мономолекулярной реакцией нулевого порядка. Хотя ферментативный механизм мономолекулярной реакции может быть довольно сложным, обычно существует одна ферментативная стадия, определяющая скорость, которая позволяет моделировать эту реакцию как одну каталитическую стадию с кажущейся мономолекулярной константой _{скорости} kcat . Если путь реакции протекает через один или несколько промежуточных продуктов, k _cat будет функцией нескольких элементарных констант скорости, тогда как в простейшем случае одной элементарной реакции (например, без промежуточных продуктов) она будет идентична элементарной мономолекулярной константе скорости k ₂ . Кажущаяся мономолекулярная константа скорости k _cat также называется числом оборота и обозначает максимальное количество ферментативных реакций, катализируемых в секунду. ${\displaystyle {\ce {ES ->[k_{cat}] E + P}}}$

Уравнение Михаэлиса-Ментен ^[10] описывает, как (начальная) скорость реакции v _{0 зависит от положения} равновесия субстрат-связывания и константы скорости k ₂ .

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$    (уравнение Михаэлиса – Ментен)

с константами

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

Это уравнение Михаэлиса-Ментен является основой кинетики большинства односубстратных ферментов. В основе этого уравнения лежат два важных предположения (кроме общего предположения о том, что механизм включает только ингибирование промежуточных продуктов или продуктов, а также отсутствие аллостеричности или кооперативности ). Первое предположение представляет собой так называемое предположение квазистационарного состояния (или гипотезу псевдостационарного состояния), а именно, что концентрация связанного с субстратом фермента (а, следовательно, и несвязанного фермента) изменяется гораздо медленнее, чем концентрация фермента, связанного с субстратом. продукт и субстрат, и, таким образом, изменение комплекса с течением времени можно свести к нулю . Второе предположение заключается в том, что общая концентрация фермента не меняется с течением времени, т.е. Полный вывод можно найти здесь . ${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$ ${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}$

Константа Михаэлиса K _M экспериментально определяется как концентрация, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину V _max , что можно проверить, подставив [S] = K _M в уравнение Михаэлиса-Ментен, а также можно увидеть графически. Если ферментативная стадия, определяющая скорость, медленная по сравнению с диссоциацией субстрата ( ), константа Михаэлиса K _M примерно равна константе диссоциации K _D комплекса ES. ${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$

Если мал по сравнению с этим, то образуется очень небольшой ES-комплекс, т.е. Следовательно, скорость образования продукта равна ${\displaystyle {\ce {[S]}}}$ ${\displaystyle K_{M}}$ ${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\approx [{\ce {S}}]/K_{M}}$ ${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\approx [E]}}}$

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

Таким образом, скорость образования продукта зависит как от концентрации фермента, так и от концентрации субстрата, уравнение напоминает бимолекулярную реакцию с соответствующей константой скорости псевдовторого порядка . Эта константа является мерой каталитической эффективности . Наиболее эффективные ферменты достигают а в диапазоне 10 ⁸ – 10 ¹⁰ М ^-1 с ^-1 . Эти ферменты настолько эффективны, что эффективно катализируют реакцию каждый раз, когда сталкиваются с молекулой субстрата, и, таким образом, достигают верхнего теоретического предела эффективности ( диффузионного предела ); и иногда их называют кинетически совершенными ферментами . ^[11] Но большинство ферментов далеки от совершенства: средние значения и составляют около и соответственно. ^[12] ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$ ${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$   ${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$ ${\displaystyle k_{2}}$ ${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$ ${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$

Прямое использование уравнения Михаэлиса – Ментен для кинетического анализа с течением времени.

Наблюдаемые скорости, предсказанные уравнением Михаэлиса-Ментен, можно использовать для прямого моделирования временного исчезновения субстрата и образования продукта путем включения уравнения Михаэлиса-Ментен в уравнение химической кинетики первого порядка. Однако этого можно достичь только в том случае, если признать проблему, связанную с использованием числа Эйлера при описании химической кинетики первого порядка. т.е. e ^{- k} представляет собой константу разделения, которая вносит систематическую ошибку в расчеты и может быть переписана как одна константа, которая представляет собой оставшийся субстрат после каждого периода времени. ^[13]

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max }[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

В 1983 году Стюарт Бил (а также независимо Сантьяго Шнелл и Клаудио Мендоса в 1997 году) получили решение в замкнутой форме для анализа кинетики механизма Михаэлиса-Ментен во времени. ^{[14] [15]} Решение, известное как уравнение Шнеля-Мендозы, имеет вид:

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

где W[] — функция Ламберта-W . ^{[16] [17]} и где F(t) –

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

Это уравнение охватывается приведенным ниже уравнением, полученным Бербераном-Сантосом ^[18] , которое также справедливо, когда начальная концентрация субстрата близка к концентрации фермента:

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

где W[] снова является функцией Ламберта-W .

Линейные графики уравнения Михаэлиса – Ментен

График Лайнуивера-Берка или график двойной обратной связи кинетических данных, показывающий значимость пересечений осей и градиента.

График зависимости v от [S] выше не является линейным; хотя первоначально он линеен при низком [S], он наклоняется к насыщению при высоком [S]. До современной эры нелинейной аппроксимации кривых на компьютерах эта нелинейность могла затруднить точную оценку K _M и V _max . Поэтому несколько исследователей разработали линеаризацию уравнения Михаэлиса-Ментен, такую ​​как график Лайнуивера-Бёрка , диаграмму Иди-Хофсти и график Хейнса-Вульфа . Все эти линейные представления могут быть полезны для визуализации данных, но ни одно из них не следует использовать для определения кинетических параметров, поскольку легко доступно компьютерное программное обеспечение, позволяющее более точно определять методы нелинейной регрессии . ^[19]

График Лайнуивера-Берка или график двойной взаимности является распространенным способом иллюстрации кинетических данных. Это получается путем взятия обратных величин обеих частей уравнения Михаэлиса-Ментен. Как показано справа, это линейная форма уравнения Михаэлиса-Ментен, которая дает прямую линию с уравнением y = m x + c с точкой пересечения y , эквивалентной 1/ V _max , и точкой пересечения x графика. представляющий -1/ K _M .

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

Естественно, никакие экспериментальные значения не могут быть приняты при отрицательном 1/[S]; нижнее предельное значение 1/[S] = 0 ( пересечение оси y ) соответствует бесконечной концентрации субстрата, где 1/v=1/V _max , как показано справа; таким образом, точка пересечения с x представляет собой экстраполяцию экспериментальных данных, полученных при положительных концентрациях. В более общем плане график Лайнуивера-Берка искажает важность измерений, проведенных при низких концентрациях субстрата, и, таким образом, может давать неточные оценки V _max и K _M . ^[20] Более точным методом линейного построения является график Иди-Хофсти . В этом случае v отображается в зависимости от v /[S]. В третьем обычном линейном представлении график Хейнса-Вулфа [S]/ v отображается в зависимости от [S]. В целом, нормализация данных может помочь уменьшить объем экспериментальной работы и повысить надежность результатов, а также подходит как для графического, так и для численного анализа. ^[21]

Практическое значение кинетических констант

Изучение кинетики ферментов важно по двум основным причинам. Во-первых, это помогает объяснить, как работают ферменты, а во-вторых, помогает предсказать, как ферменты ведут себя в живых организмах. Определенные выше кинетические константы K _M и V _max имеют решающее значение для попыток понять, как ферменты работают вместе, контролируя метаболизм .

Сделать эти прогнозы непросто даже для простых систем. Например, оксалоацетат образуется в митохондриях под действием малатдегидрогеназы . Затем оксалоацетат может потребляться цитратсинтазой , фосфоенолпируваткарбоксикиназой или аспартатаминотрансферазой , обеспечивая участие в цикле лимонной кислоты , глюконеогенезе или биосинтезе аспарагиновой кислоты соответственно. Чтобы предсказать, сколько оксалоацетата в какой путь пойдет, необходимо знать концентрацию оксалоацетата, а также концентрацию и кинетику каждого из этих ферментов. Эта цель прогнозирования поведения метаболических путей достигает своего наиболее сложного выражения в синтезе огромного количества данных о кинетике и экспрессии генов в математические модели целых организмов. Альтернативно, одним из полезных упрощений проблемы метаболического моделирования является игнорирование основной кинетики ферментов и полагаться только на информацию о стехиометрии реакционной сети, метод, называемый анализом баланса потоков . ^{[22] [23]}

Кинетика Михаэлиса – Ментен с промежуточным

Можно также рассмотреть менее простой случай

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

где существует комплекс с ферментом и промежуточным соединением, и промежуточное соединение превращается в продукт на втором этапе. В этом случае мы имеем очень похожее уравнение ^[24]

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}}$

но константы разные

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

Мы видим, что для предельного случая , когда последний шаг намного быстрее предыдущего, мы снова получаем исходное уравнение. Математически мы имеем тогда и . ${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$ ${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$ ${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$ ${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$

Мультисубстратные реакции

Многосубстратные реакции следуют сложным уравнениям скорости, которые описывают, как связываются субстраты и в какой последовательности. Анализ этих реакций значительно упрощается, если концентрация субстрата А остается постоянной, а концентрация субстрата В варьируется. В этих условиях фермент ведет себя так же, как фермент с одним субстратом, и график v по [S] дает видимые константы K _M и V _max для субстрата B. Если набор этих измерений выполняется при различных фиксированных концентрациях A, эти данные можно использовать для выяснения механизма реакции. Для фермента, который берет два субстрата A и B и превращает их в два продукта P и Q, существует два типа механизма: тройной комплекс и пинг-понг.

Тройно-комплексные механизмы

Тройной комплексный механизм случайного порядка для ферментативной реакции. Путь реакции показан линией, а под линией написаны промежуточные продукты фермента, содержащие субстраты A и B или продукты P и Q.

В этих ферментах оба субстрата связываются с ферментом одновременно, образуя тройной комплекс EAB. Порядок связывания может быть либо случайным (при случайном механизме), либо субстраты должны связываться в определенной последовательности (при упорядоченном механизме). Когда набор кривых v по [S] (фиксированное A, варьируемое B) фермента с тройным комплексным механизмом наносится на график Лайнуивера-Бёрка , набор полученных линий будет пересекаться.

Ферменты с тройным комплексным механизмом включают глутатион S -трансферазу , ^[25] дигидрофолатредуктазу ^[26] и ДНК-полимеразу . ^[27] По следующим ссылкам показаны короткие анимации тройного комплекса механизмов ферментов дигидрофолатредуктазы ^[β] и ДНК-полимеразы ^[γ] .

Механизмы пинг-понга

${\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}}$

Механизм пинг-понга ферментативной реакции. Промежуточные продукты содержат субстраты A и B или продукты P и Q.

Как показано справа, ферменты с механизмом пинг-понга могут существовать в двух состояниях: Е и химически модифицированной форме фермента Е*; этот модифицированный фермент известен как промежуточный продукт . В таких механизмах субстрат A связывается, заменяет фермент на E*, например, перенося химическую группу в активный центр, а затем высвобождается. Только после высвобождения первого субстрата субстрат B может связываться и реагировать с модифицированным ферментом, регенерируя немодифицированную форму E. Когда набор кривых v по [S] (фиксированное A, варьируемое B) фермента с механизмом пинг-понга наносится на график Лайнуивера-Бёрка, будет получен набор параллельных линий. Это называется вторичным сюжетом .

Ферменты с механизмом «пинг-понг» включают некоторые оксидоредуктазы , такие как тиоредоксинпероксидаза , ^[28] трансферазы , такие как ацилнейраминацитидилилтрансфераза ^[29] , и сериновые протеазы , такие как трипсин и химотрипсин . ^[30] Сериновые протеазы представляют собой очень распространенное и разнообразное семейство ферментов, включающее пищеварительные ферменты (трипсин, химотрипсин и эластазу), несколько ферментов каскада свертывания крови и многие другие. В этих сериновых протеазах промежуточное соединение E* представляет собой разновидность ацил-фермента, образующуюся в результате атаки серинового остатка в активном центре на пептидную связь в белковом субстрате. Здесь приведена короткая анимация, показывающая механизм действия химотрипсина. ^[δ]

Обратимый катализ и уравнение Холдейна

Внешние факторы могут ограничивать способность фермента катализировать реакцию в обоих направлениях (тогда как природа катализатора сама по себе означает, что он не может катализировать только одно направление в соответствии с принципом микроскопической обратимости ). Рассмотрим случай фермента, катализирующего реакцию в обоих направлениях:

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

Стационарная начальная скорость реакции равна ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$является положительным, если реакция протекает в прямом направлении ( ), и отрицательным в противном случае. ${\displaystyle S\rightarrow P}$

Равновесие требует того , что происходит, когда . Это показывает, что термодинамика устанавливает связь между значениями четырех констант скорости. ${\displaystyle v=0}$ ${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$

Значения прямых и обратных максимальных скоростей, полученные для , и , соответственно, равны и соответственно. Их соотношение не равно константе равновесия, а это означает, что термодинамика не ограничивает соотношение максимальных скоростей. Это объясняет, что ферменты могут быть гораздо «лучшими катализаторами» ( с точки зрения максимальной скорости ) в одном конкретном направлении реакции. ^[31] ${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$ ${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$ ${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$ ${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$

Он также может вывести две константы Михаэлиса и . Уравнение Холдейна представляет собой соотношение . ${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$ ${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$ ${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$

Следовательно, термодинамика ограничивает соотношение между прямыми и обратными значениями, а не соотношение значений. ${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$ ${\displaystyle V_{\rm {max}}}$

Кинетика Не-Михаэлиса-Ментен

Кривая насыщения ферментативной реакции, показывающая сигмовидную кинетику.

Многие различные ферментные системы следуют поведению, отличному от Михаэлиса-Ментена. Некоторые избранные примеры включают кинетику самокаталитических ферментов, кооперативных и аллостерических ферментов, межфазных и внутриклеточных ферментов, процессивных ферментов и так далее. Некоторые ферменты образуют сигмовидную диаграмму v по [S], которая часто указывает на кооперативное связывание субстрата с активным центром. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата влияет на связывание последующих молекул субстрата. Такое поведение наиболее распространено в мультимерных ферментах с несколькими взаимодействующими активными центрами. ^[32] Здесь механизм сотрудничества подобен механизму взаимодействия гемоглобина : связывание субстрата с одним активным центром изменяет сродство других активных центров к молекулам субстрата. Положительная кооперативность возникает, когда связывание первой молекулы субстрата увеличивает сродство других активных центров к субстрату. Отрицательная кооперативность возникает, когда связывание первого субстрата снижает сродство фермента к другим молекулам субстрата.

Аллостерические ферменты включают тирозил-тРНК-синтетазу млекопитающих, которая демонстрирует отрицательную кооперативность ^[33] и бактериальную аспартат-транскарбамоилазу ^[34] и фосфофруктокиназу ^[35] , которые демонстрируют положительную кооперативность.

Кооперативность на удивление распространена и может помочь регулировать реакцию ферментов на изменения концентрации их субстратов. Положительная кооперативность делает ферменты гораздо более чувствительными к [S], и их активность может сильно меняться в узком диапазоне концентраций субстрата. И наоборот, отрицательная кооперативность делает ферменты нечувствительными к небольшим изменениям [S].

Уравнение Хилла ^[36] часто используется для количественного описания степени кооперативности в кинетике, отличной от Михаэлиса-Ментен. Полученный коэффициент Хилла n измеряет, насколько связывание субстрата с одним активным центром влияет на связывание субстрата с другими активными центрами. Коэффициент Хилла <1 указывает на отрицательную кооперативность, а коэффициент >1 указывает на положительную кооперативность .

Предстационарная кинетика

Кривая прогресса в предстационарном состоянии, показывающая фазу взрыва ферментативной реакции.

В первый момент после смешивания фермента с субстратом не образуется ни продукта, ни промежуточных продуктов . Изучение следующих нескольких миллисекунд реакции называется предстационарной кинетикой. Таким образом, предстационарная кинетика связана с образованием и потреблением промежуточных продуктов фермент-субстрат (таких как ES или E *) до тех пор, пока не будут достигнуты их стационарные концентрации .

Этот подход был впервые применен к реакции гидролиза, катализируемой химотрипсином . ^[37] Часто обнаружение промежуточного соединения является важным доказательством в исследовании механизма действия фермента. Например, в механизмах пинг-понга, показанных выше, быстрые кинетические измерения могут отслеживать высвобождение продукта P и измерять образование модифицированного промежуточного фермента E *. ^[38] В случае химотрипсина этот промежуточный продукт образуется в результате атаки на субстрат нуклеофильного серина в активном центре и образования ацил-ферментного промежуточного продукта.

На рисунке справа фермент быстро производит E* в первые несколько секунд реакции. Затем скорость замедляется по мере достижения устойчивого состояния. Эта фаза быстрого взрыва реакции измеряет один оборот фермента. Следовательно, количество продукта, высвободившегося при этом взрыве, показанное в виде точки на оси y графика, также дает количество функционального фермента, присутствующего в анализе. ^[39]

Химический механизм

Важной целью измерения кинетики ферментов является определение химического механизма ферментативной реакции, т. е. последовательности химических стадий, которые превращают субстрат в продукт. Обсужденные выше кинетические подходы покажут, с какой скоростью образуются и взаимопревращаются промежуточные соединения, но они не могут точно определить, что это за промежуточные соединения.

Кинетические измерения, проведенные в различных условиях раствора или на слегка модифицированных ферментах или субстратах, часто проливают свет на этот химический механизм, поскольку они выявляют стадию, определяющую скорость, или промежуточные соединения в реакции. Например, разрыв ковалентной связи с атомом водорода является обычным этапом, определяющим скорость. Какой из возможных переносов водорода является определяющим, можно показать, измеряя кинетические эффекты замены каждого водорода дейтерием , его стабильным изотопом . Скорость изменится при замене критического водорода из-за первичного кинетического изотопного эффекта , который возникает потому, что связи с дейтерием разорвать труднее, чем связи с водородом. ^[40] Также возможно измерить аналогичные эффекты с другими изотопными заменами, такими как ¹³ C/ ¹² C и ¹⁸ O/ ¹⁶ O, но эти эффекты более тонкие. ^[41]

Изотопы также можно использовать для выяснения судьбы различных частей молекул субстрата в конечных продуктах. Например, иногда трудно определить происхождение атома кислорода в конечном продукте; поскольку он мог появиться из воды или части субстрата. Это можно определить путем систематического замещения стабильного изотопа кислорода ¹⁸ O в различные молекулы, участвующие в реакции, и проверки наличия изотопа в продукте. ^[42] Химический механизм также может быть выяснен путем изучения кинетики и изотопных эффектов при различных условиях pH, ^[43] путем изменения ионов металлов или других связанных кофакторов , ^[44] путем направленного мутагенеза консервативных аминокислотных остатков или путем изучения поведения фермента в присутствии аналогов субстрата(ов). ^[45]

Ингибирование и активация ферментов

Кинетическая схема обратимых ингибиторов ферментов.

Ингибиторы ферментов — это молекулы, которые уменьшают или отменяют активность ферментов, тогда как активаторы ферментов — это молекулы, которые увеличивают каталитическую скорость ферментов. Эти взаимодействия могут быть как обратимыми (т. е. удаление ингибитора восстанавливает активность фермента), так и необратимыми (т. е. ингибитор навсегда инактивирует фермент).

Обратимые ингибиторы

Традиционно обратимые ингибиторы ферментов классифицируются как конкурентные , неконкурентные и неконкурентные в зависимости от их влияния на K _M и V _max . Эти различные эффекты возникают в результате связывания ингибитора с ферментом E, с фермент-субстратным комплексом ES или с обоими соответственно. Разделение этих классов возникает из-за проблемы их вывода и приводит к необходимости использовать две разные константы привязки для одного события привязки. Связывание ингибитора и его влияние на ферментативную активность — это две совершенно разные вещи, еще одна проблема, которую традиционные уравнения не признают. При неконкурентном ингибировании связывание ингибитора приводит только к 100% ингибированию фермента и не учитывает возможность чего-либо промежуточного. ^[46] При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается с ферментом в его аллостерическом сайте; следовательно, аффинность связывания субстрата с ферментом, обратная K _{M , останется прежней.} С другой стороны, V _max будет уменьшаться по сравнению с неингибированным ферментом. На графике Лайнуивера-Бёрка присутствие неконкурентного ингибитора иллюстрируется изменением точки пересечения оси y, определяемым как 1/V _max . Перехват x, определенный как −1/ K _M , останется прежним. При конкурентном ингибировании ингибитор связывается с ферментом в активном центре, конкурируя с субстратом. В результате K _M увеличится, а V _max останется прежним. ^[47] Общая форма ингибирующего термина также скрывает взаимосвязь между связыванием ингибитора с ферментом и его связью с любым другим связывающим термином, будь то уравнение Михаэлиса-Ментен или кривая доза-эффект, связанная со связыванием лиганда с рецептором. Чтобы продемонстрировать взаимосвязь, можно провести следующую перестановку:

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

Добавление нуля внизу ([I]-[I])

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

Деление на [I]+K _i

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Эти обозначения показывают, что, как и в уравнении Михаэлиса-Ментен, где скорость реакции зависит от процента популяции ферментов, взаимодействующих с субстратом, эффект ингибитора является результатом процента популяции ферментов, взаимодействующих с ингибитором. Единственная проблема с этим уравнением в его нынешней форме заключается в том, что оно предполагает абсолютное ингибирование фермента при связывании ингибитора, хотя на самом деле может быть широкий диапазон эффектов: от 100% ингибирования обмена субстрата до >0%. Чтобы учесть это, уравнение можно легко изменить, чтобы учесть различные степени ингибирования, включив в него член дельта V _max .

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

или

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Этот термин затем может определять остаточную ферментативную активность, присутствующую, когда ингибитор взаимодействует с отдельными ферментами в популяции. Однако включение этого термина имеет дополнительную ценность, поскольку допускает возможность активации, если вторичный член V _max окажется выше начального. Чтобы учесть возможность активации, обозначения можно затем переписать, заменив ингибитор «I» термином-модификатором, обозначенным здесь как «X».

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Хотя эта терминология приводит к упрощенному способу рассмотрения кинетических эффектов, связанных с максимальной скоростью уравнения Михаэлиса-Ментен, она выдвигает на первый план потенциальные проблемы с термином, используемым для описания эффектов, связанных с K _M . K _M , относящийся к сродству фермента к субстрату, в большинстве случаев должен относиться к потенциальным изменениям в сайте связывания фермента, которые могут быть непосредственно результатом взаимодействия ингибитора фермента . Таким образом , в большинстве ситуаций должен быть уместным термин, аналогичный предложенному выше для модуляции V _{max :} ^[48]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Необратимые ингибиторы

Ингибиторы ферментов также могут необратимо инактивировать ферменты, обычно путем ковалентной модификации остатков в активном центре. Эти реакции, которые можно назвать субстратами самоубийства, подчиняются экспоненциальным функциям распада и обычно являются насыщаемыми. Ниже насыщения они подчиняются кинетике первого порядка по отношению к ингибитору. Необратимое ингибирование можно разделить на два различных типа. Аффинное мечение — это тип необратимого ингибирования, при котором функциональная группа, обладающая высокой реакционной способностью, модифицирует каталитически критический остаток интересующего белка, вызывая ингибирование. С другой стороны, ингибирование, основанное на механизме, включает связывание ингибитора с последующими ферментативно-опосредованными изменениями, которые превращают последний в реактивную группу, которая необратимо модифицирует фермент.

Философский дискурс об обратимости и необратимости торможения

Обсудив обратимое и необратимое ингибирование в двух предыдущих заголовках, следует отметить, что концепция обратимости (или необратимости) является чисто теоретической конструкцией, зависящей исключительно от временных рамок анализа, т. е. обратимого анализа. включение ассоциации и диссоциации молекулы ингибитора в минутные сроки могло бы показаться необратимым, если бы анализ оценивал результат в секундах, и наоборот. Существует континуум поведения ингибиторов, охватывающий обратимость и необратимость в заданные непроизвольные сроки анализа. Существуют ингибиторы, которые проявляют медленное начало действия, и большинство из этих ингибиторов неизменно также демонстрируют прочное связывание с интересующим белком-мишенью.

Механизмы катализа

Изменение энергии в зависимости от координаты реакции показывает стабилизацию переходного состояния ферментом.

Предпочтительной моделью взаимодействия фермент-субстрат является модель индуцированного соответствия. ^[49] Эта модель предполагает, что первоначальное взаимодействие между ферментом и субстратом относительно слабое, но эти слабые взаимодействия быстро вызывают конформационные изменения в ферменте, которые усиливают связывание. Эти конформационные изменения также приближают каталитические остатки в активном центре к химическим связям в субстрате, которые будут изменены в реакции. ^[50] Конформационные изменения можно измерить с помощью кругового дихроизма или интерферометрии двойной поляризации . После того, как происходит связывание, один или несколько механизмов катализа снижают энергию переходного состояния реакции, обеспечивая альтернативный химический путь реакции. Механизмы катализа включают катализ напряжением связи; по близости и ориентации; донорами или акцепторами протонов активного центра; ковалентный катализ и квантовое туннелирование . ^{[38] [51]}

Кинетика ферментов не может доказать, какие способы катализа использует фермент. Однако некоторые кинетические данные могут указывать на возможность изучения других методов. Например, механизм пинг-понга с кинетикой предустановленного состояния в фазе взрыва позволяет предположить, что ковалентный катализ может быть важен в механизме этого фермента. Альтернативно, наблюдение сильного влияния pH на V _max , но не на K _M , может указывать на то, что остаток в активном центре должен находиться в определенном состоянии ионизации , чтобы происходил катализ.

История

В 1902 году Виктор Анри предложил количественную теорию кинетики ферментов ^[52] , но в то время экспериментальное значение концентрации ионов водорода еще не было признано. После того, как Питер Лауриц Соренсен в 1909 году определил логарифмическую шкалу pH и представил концепцию буферизации ^[53], немецкий химик Леонор Михаэлис и доктор Мод Леонора Ментен (в то время постдокторант в лаборатории Михаэлиса) повторили эксперименты Анри и подтвердили его уравнение, которое сейчас обычно называют кинетикой Михаэлиса-Ментен (иногда также кинетикой Анри-Михаэлиса-Ментена ). ^[54] Их работа получила дальнейшее развитие GE Briggs и JBS Haldane , которые вывели кинетические уравнения, которые до сих пор широко считаются отправной точкой в ​​моделировании ферментативной активности. ^[55]

Основным вкладом подхода Анри-Микаэлиса-Ментена было рассмотрение ферментативных реакций в две стадии. В первом случае субстрат обратимо связывается с ферментом, образуя фермент-субстратный комплекс. Иногда это называют комплексом Михаэлиса. Затем фермент катализирует химическую стадию реакции и высвобождает продукт. Кинетика многих ферментов адекватно описывается простой моделью Михаэлиса-Ментена, но все ферменты имеют внутренние движения , которые не учитываются в модели, и могут иметь значительный вклад в общую кинетику реакции. Это можно смоделировать, представив несколько путей Михаэлиса-Ментен, связанных с колебательными темпами, ^{[56] [57] [58]} , которые являются математическим расширением основного механизма Михаэлиса Ментена. ^[59]

Программное обеспечение

ENZO (Enzyme Kinetics) — это инструмент с графическим интерфейсом для построения кинетических моделей реакций, катализируемых ферментами. ENZO автоматически генерирует соответствующие дифференциальные уравнения на основе заданной схемы ферментативной реакции. Эти дифференциальные уравнения обрабатываются с помощью числового решателя и алгоритма регрессии, который подгоняет коэффициенты дифференциальных уравнений к экспериментально наблюдаемым кривым зависимости от времени. ENZO позволяет быстро оценить конкурирующие схемы реакций и может использоваться для рутинных тестов кинетики ферментов. ^[60]

Смотрите также

• Динамика белка
• Фермент, ограниченный диффузией
• Модель адсорбции Ленгмюра

Сноски

α. ^ Ссылка: Интерактивное руководство по кинетике Михаэлиса-Ментен (требуется Java)

β. ^ Ссылка: механизм дигидрофолатредуктазы (Gif)

γ. ^ Ссылка: механизм ДНК-полимеразы (Gif)

δ. ^ Ссылка: Механизм химотрипсина (требуется Flash)

Рекомендации

1. Райтон М.С., Эббинг Д.Д. (1993). Общая химия (4-е изд.). Бостон: Хоутон Миффлин. ISBN 978-0-395-63696-1.
2. Fromm HJ, Hargrove MS (2012) Кинетика ферментов. В: Основы биохимии. Шпрингер, Берлин, Гейдельберг
3. Дэнсон М., Эйзенталь Р. (2002). Ферментные анализы: практический подход . Оксфорд [Оксфордшир]: Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-963820-8.
4. Се XS, Лу HP (июнь 1999 г.). «Одномолекулярная энзимология». Журнал биологической химии . 274 (23): 15967–15970. дои : 10.1074/jbc.274.23.15967 . ПМИД  10347141.
5. Лу HP (июнь 2004 г.). «Исследование динамики конформационных изменений в ферментативных реакциях с помощью спектроскопии одиночных молекул». Современная фармацевтическая биотехнология . 5 (3): 261–269. дои : 10.2174/1389201043376887. ПМИД  15180547.
6. Шнелл-младший, Дайсон Х.Дж. , Райт П.Е. (2004). «Структура, динамика и каталитическая функция дигидрофолатредуктазы». Ежегодный обзор биофизики и биомолекулярной структуры . 33 : 119–140. doi :10.1146/annurev.biophys.33.110502.133613. ПМИД  15139807.
7. Гибсон QH (1969). «[6] Быстрое перемешивание: поток остановлен». Быстрое перемешивание: поток остановлен . Методы энзимологии. Том. 16. стр. 187–228. дои : 10.1016/S0076-6879(69)16009-7. ISBN 978-0-12-181873-9.
8. Дагглби Р.Г. (1995). «[3] Анализ кривых прогресса ферментов методом нелинейной регрессии». Анализ кривых прогресса ферментов методом нелинейной регрессии . Методы энзимологии. Том. 249. стр. 61–90. дои : 10.1016/0076-6879(95)49031-0. ISBN 978-0-12-182150-0. ПМИД  7791628.
9. Мюррей Дж.Б., Данэм СМ, Скотт В.Г. (январь 2002 г.). «РН-зависимое конформационное изменение, а не химическая стадия, по-видимому, ограничивает скорость реакции расщепления рибозима «головка молотка». Журнал молекулярной биологии . 315 (2): 121–130. дои : 10.1006/jmbi.2001.5145. PMID  11779233. S2CID  18102624.
10. Михаэлис Л. и Ментен М.Л. Кинетика дер Invertinwirkung Biochem. З. 1913 г.; 49:333–369 английский перевод, по состоянию на 6 апреля 2007 г.
11. Стропполо М.Э., Фалькони М., Каккури А.М., Дезидери А. (сентябрь 2001 г.). «Сверхэффективные ферменты». Клеточные и молекулярные науки о жизни . 58 (10): 1451–1460. дои : 10.1007/PL00000788. PMID  11693526. S2CID  24874575.
12. Бар-Эвен А., Нур Э., Савир Ю., Либермейстер В., Давиди Д., Тауфик Д.С., Майло Р. (май 2011 г.). «Умеренно эффективный фермент: эволюционные и физико-химические тенденции, определяющие параметры фермента». Биохимия . 50 (21): 4402–4410. дои : 10.1021/bi2002289. ПМИД  21506553.
13. Уолш Р., Мартин Э., Дарвеш С. (январь 2010 г.). «Метод описания реакций, катализируемых ферментами, путем объединения кинетических параметров фермента в устойчивом состоянии и во времени». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1800 (1): 1–5. дои : 10.1016/j.bbagen.2009.10.007. ПМИД  19840832.
14. Бил С.Л. (декабрь 1983 г.). «Вычисление явного решения уравнения Михаэлиса-Ментен». Журнал фармакокинетики и биофармацевтики . 11 (6): 641–657. дои : 10.1007/BF01059062. PMID  6689584. S2CID  32571415.
15. Шнелл С., Мендоса С. (1997). «Решение в закрытой форме для зависящей от времени кинетики ферментов». Журнал теоретической биологии . 187 (2): 207–212. Бибкод : 1997JThBi.187..207S. дои : 10.1006/jtbi.1997.0425.
16. Goudar CT, Sonnad JR, Duggleby RG (январь 1999 г.). «Оценка параметров с использованием прямого решения интегрированного уравнения Михаэлиса-Ментен» (PDF) . Biochimica et Biophysical Acta (BBA) - Структура белка и молекулярная энзимология . 1429 (2): 377–383. дои : 10.1016/s0167-4838(98)00247-7. PMID  9989222. Архивировано из оригинала (PDF) 9 ноября 2015 года.
17. Гудар КТ, Харрис С.К., Макинерни М.Дж., Суфлита Дж.М. (декабрь 2004 г.). «Анализ кривой прогресса ферментных и микробных кинетических реакций с использованием явных решений, основанных на W-функции Ламберта». Журнал микробиологических методов . 59 (3): 317–326. дои : 10.1016/j.mimet.2004.06.013. ПМИД  15488275.
18. Берберан-Сантос Миннесота (2010). «Общее рассмотрение кинетики ферментов Анри Михаэлиса Ментена: точное серийное решение и приближенные аналитические решения» (PDF) . МАТЧ-коммуникации в математической и компьютерной химии . 63 : 283.
19. Джонс МЭ (декабрь 1992 г.). «Анализ алгебраических взвешенных оценок параметров ферментов методом наименьших квадратов». Биохимический журнал . 288 (Часть 2) (Часть 2): 533–538. дои : 10.1042/bj2880533. ПМК 1132043 . ПМИД  1463456. 
20. Ценг SJ, Сюй JP (август 1990 г.). «Сравнение процедур оценки параметров модели Михаэлиса-Ментен». Журнал теоретической биологии . 145 (4): 457–464. Бибкод : 1990JThBi.145..457T. дои : 10.1016/S0022-5193(05)80481-3. ПМИД  2246896.
21. Браво И.Г., Бусто Ф., Де Арриага Д., Ферреро М.А., Родригес-Апарисио Л.Б., Мартинес-Бланко Х., Реглеро А. (сентябрь 2001 г.). «Нормализованный график как новый и экономящий время инструмент комплексного кинетического анализа ферментов». Биохимический журнал . 358 (Часть 3): 573–583. дои : 10.1042/bj3580573. ПМЦ 1222113 . ПМИД  11577687. 
22. Алмаас Э., Ковач Б., Вичек Т., Олваи З.Н., Барабаши А.Л. (февраль 2004 г.). «Глобальная организация метаболических потоков у бактерии Escherichia coli». Природа . 427 (6977): 839–843. arXiv : q-bio/0403001 . Бибкод : 2004Natur.427..839A. дои : 10.1038/nature02289. PMID  14985762. S2CID  715721.
23. Рид Дж.Л., Во Т.Д., Шиллинг Ч., Палссон Б.О. (2003). «Модель расширенного генома Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR)». Геномная биология . 4 (9): Р54. дои : 10.1186/gb-2003-4-9-r54 . ЧВК 193654 . ПМИД  12952533. 
24. полный вывод см. здесь
25. Дирр Х., Райнемер П., Хубер Р. (март 1994 г.). «Рентгеновские кристаллические структуры цитозольных глутатион S-трансфераз. Значение для архитектуры белка, распознавания субстрата и каталитической функции». Европейский журнал биохимии . 220 (3): 645–661. doi :10.1111/j.1432-1033.1994.tb18666.x. ПМИД  8143720.
26. Стоун С.Р., Моррисон Дж.Ф. (июль 1988 г.). «Дигидрофолатредуктаза из Escherichia coli: кинетический механизм с НАДФН и восстановленным ацетилпиридин-адениндинуклеотид-фосфатом в качестве субстратов». Биохимия . 27 (15): 5493–5499. дои : 10.1021/bi00415a016. ПМИД  3052577.
27. Фишер, Пенсильвания (1994). Энзимологический механизм репликативной ДНК-полимеразы у высших эукариот. Прогресс в исследованиях нуклеиновых кислот и молекулярной биологии. Том. 47. стр. 371–97. дои : 10.1016/S0079-6603(08)60257-3. ISBN 978-0-12-540047-3. ПМИД  8016325.
28. Акерман С.Е., Мюллер С. (август 2003 г.). «2-Циспероксиредоксин PfTrx-Px1 участвует в антиоксидантной защите Plasmodium falciparum». Молекулярная и биохимическая паразитология . 130 (2): 75–81. дои : 10.1016/S0166-6851(03)00161-0. ПМИД  12946843.
29. Браво И.Г., Барралло С., Ферреро М.А., Родригес-Апарисио Л.Б., Мартинес-Бланко Х., Реглеро А. (сентябрь 2001 г.). «Кинетические свойства ацилнейраминацитидилилтрансферазы Pasteurella haemolytica A2». Биохимический журнал . 358 (Часть 3): 585–598. дои : 10.1042/bj3580585. ПМК 1222114 . ПМИД  11577688. 
30. Краут Дж (1977). «Сериновые протеазы: структура и механизм катализа». Ежегодный обзор биохимии . 46 : 331–358. doi : 10.1146/annurev.bi.46.070177.001555. ПМИД  332063.
31. Корниш-Боуден А (2012). Основы кинетики ферментов . Уайли-Блэквелл. Некоторые ферменты являются гораздо более эффективными катализаторами в одном направлении, чем в другом. Яркий пример: предельная скорость прямой реакции, катализируемой метионин-аденозилтрансферазой, примерно в 10 ⁵ выше, чем в обратном направлении, хотя константа равновесия близка к единице (стр. 59).
32. Рикар Дж., Корниш-Боуден А. (июль 1987 г.). «Кооперативные и аллостерические ферменты: 20 лет спустя». Европейский журнал биохимии . 166 (2): 255–272. дои : 10.1111/j.1432-1033.1987.tb13510.x . ПМИД  3301336.
33. Уорд WH, Фершт AR (июль 1988 г.). «Тирозил-тРНК-синтетаза действует как асимметричный димер при зарядке тРНК. Обоснование активности половины сайтов». Биохимия . 27 (15): 5525–5530. дои : 10.1021/bi00415a021. ПМИД  3179266.
34. Хельмштедт К., Краппманн С., Браус Г.Х. (сентябрь 2001 г.). «Аллостерическая регуляция каталитической активности: аспартат-транскарбамоилаза Escherichia coli по сравнению с хоризматмутазой дрожжей». Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 65 (3): 404–21, оглавление. дои :10.1128/MMBR.65.3.404-421.2001. ПМК 99034 . ПМИД  11528003. 
35. Ширмер Т., Эванс PR (январь 1990 г.). «Структурные основы аллостерического поведения фосфофруктокиназы». Природа . 343 (6254): 140–145. Бибкод : 1990Natur.343..140S. дои : 10.1038/343140a0. PMID  2136935. S2CID  4272821.
36. Хилл А.В. (1910). «Возможные эффекты агрегации молекул гемоглобина на кривые его диссоциации». Дж. Физиол . 40 : iv–vii.
37. Хартли Б.С., Килби Б.А. (февраль 1954 г.). «Реакция п-нитрофениловых эфиров с химотрипсином и инсулином». Биохимический журнал . 56 (2): 288–297. дои : 10.1042/bj0560288. ПМЦ 1269615 . ПМИД  13140189. 
38. Фершт, Алан (1999). Структура и механизм в науке о белках: руководство по ферментативному катализу и сворачиванию белков . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6.
39. Бендер М.Л., Беге-Кантон М.Л., Блейкли Р.Л., Брубахер Л.Дж., Федер Дж., Гюнтер Ч.Р. и др. (декабрь 1966 г.). «Определение концентрации растворов гидролитических ферментов: альфа-химотрипсина, трипсина, папаина, эластазы, субтилизина и ацетилхолинэстеразы». Журнал Американского химического общества . 88 (24): 5890–5913. дои : 10.1021/ja00976a034. ПМИД  5980876.
40. Клеланд WW (январь 2005 г.). «Использование изотопных эффектов для определения ферментативных механизмов». Архив биохимии и биофизики . 433 (1): 2–12. дои : 10.1016/j.abb.2004.08.027. ПМИД  15581561.
41. Нортроп ДБ (1981). «Выражение эффектов изотопов в реакциях, катализируемых ферментами». Ежегодный обзор биохимии . 50 : 103–131. doi : 10.1146/annurev.bi.50.070181.000535. ПМИД  7023356.
42. Бэйли Т.А., Реттенмайер А.В. (1986). «Биотрансформация лекарств: механистические исследования со стабильными изотопами». Журнал клинической фармакологии . 26 (6): 448–451. doi :10.1002/j.1552-4604.1986.tb03556.x. PMID  3734135. S2CID  39193680.
43. Клеланд WW (1982). «Использование изотопных эффектов для выяснения ферментативных механизмов». Критические обзоры CRC по биохимии . 13 (4): 385–428. дои : 10.3109/10409238209108715. ПМИД  6759038.
44. Кристиансон Д.В. , Кокс Дж.Д. (1999). «Катализ активированным металлом гидроксидом в металлоферментах цинка и марганца». Ежегодный обзор биохимии . 68 : 33–57. doi :10.1146/annurev.biochem.68.1.33. ПМИД  10872443.
45. Краут Д.А., Кэрролл К.С., Хершлаг Д. (2003). «Проблемы ферментного механизма и энергетики». Ежегодный обзор биохимии . 72 : 517–571. doi : 10.1146/annurev.biochem.72.121801.161617. ПМИД  12704087.
46. Уолш Р., Мартин Э., Дарвеш С. (декабрь 2011 г.). «Ограничения традиционных классификаций ингибиторов». Интегративная биология . 3 (12): 1197–1201. дои : 10.1039/c1ib00053e. ПМИД  22038120.
47. Клеланд WW (февраль 1963 г.). «Кинетика ферментативно-катализируемых реакций с двумя или более субстратами или продуктами. III. Прогнозирование начальной скорости и характера ингибирования путем проверки». Биохимика и биофизика Acta . 67 : 188–196. дои : 10.1016/0006-3002(63)91816-x. ПМИД  14021669.
48. Уолш Р., Мартин Э., Дарвеш С. (май 2007 г.). «Универсальное уравнение для описания кинетики обратимого ингибирования и активации ферментов: моделирование бета-галактозидазы и бутирилхолинэстеразы». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1770 (5): 733–746. doi : 10.1016/j.bbagen.2007.01.001. ПМИД  17307293.
49. Кошланд Д.Э. (февраль 1958 г.). «Применение теории специфичности ферментов к синтезу белка». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 44 (2): 98–104. Бибкод : 1958PNAS...44...98K. дои : 10.1073/pnas.44.2.98 . ПМЦ 335371 . ПМИД  16590179. 
50. Хаммес Г.Г. (июль 2002 г.). «Множественные конформационные изменения в ферментативном катализе». Биохимия . 41 (26): 8221–8228. дои : 10.1021/bi0260839. ПМИД  12081470.
51. Сатклифф MJ, Scrutton NS (июль 2002 г.). «Новая концептуальная основа ферментативного катализа. Туннелирование водорода в сочетании с динамикой ферментов во флавопротеиновых и хинопротеиновых ферментах». Европейский журнал биохимии . 269 ​​(13): 3096–3102. дои : 10.1046/j.1432-1033.2002.03020.x. ПМИД  12084049.
52. Анри V (1902). «Общая теория действия некоторых диастазов». Компет. Ренд. акад. наук. Париж . 135 : 916–9.
53. Соренсен PL (1909). «Enzymstudien {II}. Über die Messung und Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration bei enzymatischen Prozessen» [Ферментные исследования III: Об измерении и значении концентрации ионов водорода в ферментативных процессах]. Биохим. З. (на немецком языке). 21 : 131–304.
54. Михаэлис Л., Ментен М. (1913). «Die Kinetik der Invertinwirkung» [Кинетика действия инвертазы]. Биохим. З. (на немецком языке). 49 : 333–369.; Михаэлис Л., Ментен М.Л., Джонсон К.А., Гуди Р.С. (октябрь 2011 г.). «Оригинальная константа Михаэлиса: перевод статьи Михаэлиса-Ментен 1913 года». Биохимия . 50 (39): 8264–8269. дои : 10.1021/bi201284u. ПМЦ 3381512 . ПМИД  21888353. 
55. Бриггс Дж. Э., Холдейн Дж. Б. (1925). «Заметки о кинетике действия ферментов». Биохимический журнал . 19 (2): 338–339. дои : 10.1042/bj0190338. ПМК 1259181 . ПМИД  16743508. 
56. Фломенбом О, Велония К, Лоос Д, Масуо С, Котлет М, Энгельборгс Ю и др. (февраль 2005 г.). «Растянутый экспоненциальный спад и корреляции в каталитической активности колеблющихся одиночных молекул липазы». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (7): 2368–2372. Бибкод : 2005PNAS..102.2368F. дои : 10.1073/pnas.0409039102 . ПМК 548972 . ПМИД  15695587. 
57. English BP, Мин В., ван Ойен А.М., Ли К.Т., Луо Г., Сунь Х. и др. (февраль 2006 г.). «Постоянно колеблющиеся молекулы отдельных ферментов: новый взгляд на уравнение Михаэлиса-Ментен». Химическая биология природы . 2 (2): 87–94. дои : 10.1038/nchembio759. PMID  16415859. S2CID  2201882.
58. Лу HP, Сюнь Л, Се XS (декабрь 1998 г.). «Одномолекулярная ферментативная динамика». Наука . 282 (5395): 1877–1882. Бибкод : 1998Sci...282.1877P. дои : 10.1126/science.282.5395.1877. ПМИД  9836635.
59. Сюэ X, Лю Ф, Оу-Ян ZC (сентябрь 2006 г.). «Одномолекулярное уравнение Михаэлиса-Ментен за пределами квазистатического беспорядка». Физический обзор E . 74 (3, часть 1): 030902. arXiv : cond-mat/0604364 . Бибкод : 2006PhRvE..74c0902X. doi : 10.1103/PhysRevE.74.030902. PMID  17025584. S2CID  41674948.
60. Бевц С., Конц Дж., Стоян Дж., Ходошек М., Пенца М., Прапротник М., Янежич Д. (2011). «ENZO: веб-инструмент для построения и оценки кинетических моделей реакций, катализируемых ферментами». ПЛОС ОДИН . 6 (7): e22265. Бибкод : 2011PLoSO...622265B. дои : 10.1371/journal.pone.0022265 . ПМЦ 3139599 . ПМИД  21818304.  ЭНЗО сервер

дальнейшее чтение

Вводный

• Корниш-Боуден А (2012). Основы кинетики ферментов (4-е изд.). Вайнхайм: Уайли-Блэквелл. ISBN 978-3-527-33074-4.
• Стивенс Л., Прайс, Северная Каролина (1999). Основы энзимологии: клеточная и молекулярная биология каталитических белков . Оксфорд [Оксфордшир]: Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-850229-6.
• Багг Т. (2004). Введение в химию ферментов и коферментов . Кембридж, Массачусетс: Издательство Blackwell. ISBN 978-1-4051-1452-3.
• Сигел И.Х. (1993). Кинетика ферментов: поведение и анализ ферментных систем быстрого равновесия и устойчивого состояния . Нью-Йорк: Уайли. ISBN 978-0-471-30309-1.

Передовой

• Фершт А (1999). Структура и механизм в науке о белках: руководство по ферментативному катализу и сворачиванию белков . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6.
• Шнелл С., Майни ПК (2004). «Век кинетики ферментов: надежность оценок K _M и v _max ». Комментарии о нотах Теоретическая биология . 8 (2–3): 169–87. CiteSeerX  10.1.1.493.7178 . дои : 10.1080/08948550302453.
• Уолш С. (1979). Механизмы ферментативных реакций . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-0070-8.
• Клеланд В.В., Кук П. (2007). Кинетика и механизм ферментов . Нью-Йорк: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4140-6.

Внешние ссылки

• Анимация ферментного анализа — показывает эффекты изменения условий анализа.
• MACiE — База данных механизмов ферментативных реакций.
• ENZYME — база данных номенклатуры ферментов Expasy
• ENZO — Веб-приложение для простого построения и быстрого тестирования кинетических моделей реакций, катализируемых ферментами.
• ExCatDB — База данных ферментативных каталитических механизмов.
• БРЕНДА — Полная база данных ферментов, содержащая субстраты, ингибиторы и диаграммы реакций.
• САБИО-РК — База данных кинетики реакций
• Исследовательская группа Джозефа Краута, Калифорнийский университет в Сан-Диего — Анимация некоторых механизмов ферментативных реакций.
• Символизм и терминология в кинетике ферментов. Всестороннее объяснение концепций и терминологии в кинетике ферментов.
• Введение в кинетику ферментов. Доступный набор онлайн-уроков по кинетике ферментов.
• Анимированное руководство по кинетике ферментов — анимированное руководство со звуком.