Полимеразной цепной реакции

Лабораторный метод размножения образца ДНК для исследования

Стрип из восьми пробирок для ПЦР, каждая из которых содержит 100 мкл реакционной смеси.

Помещение полоски из восьми пробирок для ПЦР в термоциклер

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) — это метод, широко используемый для быстрого создания миллионов и миллиардов копий определенного образца ДНК , позволяющий ученым амплифицировать очень небольшой образец ДНК (или его часть) в достаточной степени для детального изучения. ПЦР была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллисом из Cetus Corporation . Маллис и биохимик Майкл Смит , разработавшие другие важные способы манипулирования ДНК, были совместно удостоены Нобелевской премии по химии в 1993 году ^.

ПЦР имеет основополагающее значение для многих процедур, используемых в генетических тестах и ​​исследованиях, включая анализ древних образцов ДНК и идентификацию инфекционных агентов. С помощью ПЦР копии очень небольших количеств последовательностей ДНК экспоненциально амплифицируются в серии циклов изменения температуры. ПЦР в настоящее время является распространенным и часто незаменимым методом, используемым в медицинских лабораторных исследованиях для самых разных целей, включая биомедицинские исследования и судебную медицину . ^{[2] [3]}

Большинство методов ПЦР основаны на термоциклировании . Термический цикл подвергает реагенты повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, чтобы обеспечить различные температурно-зависимые реакции, в частности, плавление ДНК и репликацию ДНК , управляемую ферментами . В ПЦР используются два основных реагента — праймеры (которые представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды , которые представляют собой комплементарную последовательность целевой области ДНК) и ДНК-полимеразу . На первом этапе ПЦР две цепи двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией нуклеиновой кислоты . На втором этапе температуру понижают и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Две цепи ДНК затем становятся матрицами для ДНК-полимеразы, которая ферментативно собирает новую цепь ДНК из свободных нуклеотидов , строительных блоков ДНК. По мере продвижения ПЦР полученная ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, запуская цепную реакцию , в которой исходная матрица ДНК экспоненциально амплифицируется.

Почти во всех приложениях ПЦР используется термостабильная ДНК-полимераза, такая как Taq -полимераза , фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus . Если бы используемая полимераза была термочувствительной, она денатурировала бы при высоких температурах на стадии денатурации. До использования Taq- полимеразы ДНК-полимеразу приходилось добавлять вручную в каждом цикле, что было утомительным и дорогостоящим процессом. ^[4]

Применения этого метода включают клонирование ДНК для секвенирования , клонирование генов и манипулирование ими, мутагенез генов; построение филогений на основе ДНК или функциональный анализ генов ; диагностика и мониторинг генетических нарушений ; амплификация древней ДНК; ^[5] анализ генетических отпечатков пальцев для составления профиля ДНК (например, в криминалистике и проверке отцовства ); и обнаружение возбудителей в тестах на нуклеиновые кислоты для диагностики инфекционных заболеваний .

Принципы

Старый трехтемпературный термоциклер для ПЦР.

ПЦР амплифицирует определенный участок цепи ДНК (мишень ДНК). Большинство методов ПЦР амплифицируют фрагменты ДНК длиной от 0,1 до 10 тысяч пар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты до 40 кб. ^[6] Количество амплифицированного продукта определяется доступными в реакции субстратами, которые становятся лимитирующими по мере развития реакции. ^[7]

Для базовой установки ПЦР требуется несколько компонентов и реагентов, ^[8] в том числе:

• ДНК -матрица , содержащая целевой участок ДНК для амплификации
• ДНК - полимераза ; фермент, полимеризующий новые цепи ДНК; особенно распространена термостойкая Taq - полимераза ^[9] , поскольку она с большей вероятностью останется неповрежденной во время процесса высокотемпературной денатурации ДНК.
• два ДНК- праймера , которые комплементарны 3'-концам (три штриха) каждой смысловой и антисмысловой цепи ДНК-мишени (ДНК-полимераза может связываться только с двухцепочечной областью ДНК и удлиняться от нее; без праймеров нет двухцепочечного сайта инициации, с которым может связываться полимераза); ^[10] специфические праймеры, которые комплементарны целевой области ДНК, выбираются заранее и часто изготавливаются на заказ в лаборатории или приобретаются у коммерческих поставщиков биохимических препаратов.
• дезоксинуклеозидтрифосфаты , или dNTP (иногда называемые «дезоксинуклеотидтрифосфатами»; нуклеотиды , содержащие трифосфатные группы), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК.
• буферный раствор , обеспечивающий подходящую химическую среду для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы
• двухвалентные катионы , обычноионы магния (Mg) или марганца (Mn); Mg ²⁺ является наиболее распространенным, но Mn ²⁺ можно использовать для мутагенеза ДНК, опосредованного ПЦР , поскольку более высокая концентрация Mn ²⁺ увеличивает частоту ошибок во время синтеза ДНК; ^[11] и одновалентные катионы , обычноионы калия (K) ^{[ нужен лучший источник ]}

Реакцию обычно проводят в объеме 10–200  мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0,2–0,5 мл) в термоциклере . Термоциклер нагревает и охлаждает реакционные трубки для достижения температур, необходимых на каждом этапе реакции (см. ниже). Во многих современных термоциклерах используется устройство Пельтье , которое позволяет как нагревать, так и охлаждать блок, в котором находятся пробирки для ПЦР, просто меняя направление электрического тока устройства. Тонкостенные реакционные трубки обеспечивают хорошую теплопроводность , обеспечивая быстрое тепловое равновесие. Большинство термоциклеров имеют крышки с подогревом, чтобы предотвратить образование конденсата в верхней части реакционной трубки. Для старых термоциклеров без подогреваемой крышки требуется слой масла поверх реакционной смеси или шарик воска внутри трубки.

Процедура

Обычно ПЦР состоит из серии из 20–40 повторяющихся изменений температуры, называемых термическими циклами, причем каждый цикл обычно состоит из двух или трех дискретных температурных этапов (см. рисунок ниже). Циклированию часто предшествует один этап повышения температуры при очень высокой температуре (>90 °C (194 °F)), за которым следует один этап выдержки в конце для выдержки конечного продукта или кратковременного хранения. Используемые температуры и продолжительность их применения в каждом цикле зависят от множества параметров, включая фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и dNTP в реакции, а также температуру плавления ( T _m ) грунтовки. ^[12] Отдельные этапы, общие для большинства методов ПЦР, следующие:

• Инициализация : Этот шаг требуется только для ДНК-полимераз, требующих тепловой активации с помощью ПЦР с горячим стартом . ^[13] Он заключается в нагреве реакционной камеры до температуры 94–96 °C (201–205 °F) или 98 °C (208 °F), если используются чрезвычайно термостабильные полимеразы, которую затем выдерживают в течение 1– 10 минут.
• Денатурация : этот этап является первым регулярным циклическим циклом и состоит из нагревания реакционной камеры до 94–98 °C (201–208 °F) в течение 20–30 секунд. Это вызывает плавление ДНК или денатурацию матрицы двухцепочечной ДНК за счет разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, в результате чего образуются две одноцепочечные молекулы ДНК.
• Отжиг : на следующем этапе температуру реакции снижают до 50–65 ° C (122–149 ° F) на 20–40 секунд, что позволяет выполнить отжиг праймеров к каждой из матриц одноцепочечной ДНК. В реакционную смесь обычно включают два разных праймера: по одному для каждого из двух одноцепочечных комплементов, содержащих целевой участок. Праймеры сами по себе представляют собой одноцепочечные последовательности, но они намного короче длины целевой области и дополняют только очень короткие последовательности на 3'-конце каждой цепи.

Крайне важно определить правильную температуру для этапа отжига, поскольку температура отжига сильно влияет на эффективность и специфичность. Эта температура должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить гибридизацию праймера с цепью, но достаточно высокой, чтобы гибридизация была специфичной, т. е. праймер должен связываться только с идеально комплементарной частью цепи и больше нигде. Если температура слишком низкая, грунтовка может плохо схватиться. Если оно слишком высокое, праймер может вообще не схватиться. Типичная температура отжига примерно на 3–5 ° C ниже T _m используемых праймеров. Стабильные водородные связи между комплементарными основаниями образуются только в том случае, если последовательность праймера очень близко соответствует последовательности матрицы. На этом этапе полимераза связывается с гибридом праймер-матрица и начинает образование ДНК.

• Удлинение/удлинение : температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; оптимальная температура активности термостабильной ДНК-полимеразы Taq- полимеразы составляет примерно 75–80 ° C (167–176 ° F), ^{[14] [15]} , хотя для этого обычно используется температура 72 ° C (162 ° F). фермент. На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи матрицы ДНК, путем добавления свободных dNTP из реакционной смеси, которые комплементарны матрице в направлении 5'-к-3' , конденсируя 5'- фосфатную группу. дНТФ с 3'- гидроксигруппой на конце образующейся (удлиняющейся) цепи ДНК. Точное время, необходимое для элонгации, зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и от длины целевой области ДНК, подлежащей амплификации. Как правило, при оптимальной температуре большинство ДНК-полимераз полимеризуют тысячу оснований в минуту. В оптимальных условиях (т.е. если нет ограничений из-за ограничения количества субстратов или реагентов) на каждом этапе удлинения/элонгации количество целевых последовательностей ДНК удваивается. С каждым последующим циклом исходные цепи матрицы плюс все вновь созданные цепи становятся нитями матрицы для следующего раунда элонгации, что приводит к экспоненциальной (геометрической) амплификации конкретной целевой области ДНК.

Процессы денатурации, отжига и элонгации составляют единый цикл. Для амплификации целевой ДНК до миллионов копий требуется несколько циклов. Формула, используемая для расчета количества копий ДНК, образующихся после заданного количества циклов, равна 2 ⁿ , где n — количество циклов. Таким образом, набор реакций на 30 циклов приводит к получению 2 ³⁰ или 1 073 741 824 копий исходной целевой области двухцепочечной ДНК.

• Окончательная элонгация : этот единственный этап не является обязательным, но выполняется при температуре 70–74 °C (158–165 °F) (диапазон температур, необходимый для оптимальной активности большинства полимераз, используемых в ПЦР) в течение 5–15 минут после последний цикл ПЦР, чтобы убедиться, что оставшаяся одноцепочечная ДНК полностью удлинена.
• Окончательное выдерживание : на последнем этапе реакционная камера охлаждается до 4–15 °C (39–59 °F) в течение неопределенного времени и может использоваться для кратковременного хранения продуктов ПЦР.

Схематическое изображение полного цикла ПЦР

Продукты ПЦР, окрашенные бромидом этидия, после гель-электрофореза . Два набора праймеров использовали для амплификации целевой последовательности из трех различных образцов тканей. В образце № 1 амплификация отсутствует; Полосы ДНК в образцах № 2 и № 3 указывают на успешную амплификацию целевой последовательности. Гель также демонстрирует положительный контроль и лестницу ДНК, содержащую фрагменты ДНК определенной длины для определения размера полос в экспериментальных ПЦР.

Чтобы проверить, успешно ли ПЦР генерировала ожидаемую целевую область ДНК (также иногда называемую амплимером или ампликоном ), можно использовать электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов ПЦР по размеру. Размер продуктов ПЦР определяется путем сравнения с лестницей ДНК — маркером молекулярной массы, содержащим фрагменты ДНК известных размеров, который перемещается по гелю вместе с продуктами ПЦР.

Такер ПЦР

Этапы

Экспоненциальное усиление

Как и в случае других химических реакций, на скорость реакции и эффективность ПЦР влияют ограничивающие факторы. Таким образом, весь процесс ПЦР можно разделить на три этапа в зависимости от хода реакции:

• Экспоненциальное усиление : в каждом цикле количество продукта удваивается (при условии 100% эффективности реакции). После 30 циклов одна копия ДНК может быть увеличена до 1 000 000 000 (одного миллиарда) копий. В каком-то смысле репликацией дискретной цепи ДНК манипулируют в пробирке в контролируемых условиях. ^[16] Реакция очень чувствительна: должны присутствовать лишь незначительные количества ДНК.
• Выравнивание за пределами стадии : реакция замедляется, поскольку ДНК-полимераза теряет активность, а потребление реагентов, таких как dNTP и праймеры, приводит к их ограничению.
• Плато : продукт больше не накапливается из-за истощения реагентов и ферментов.

Оптимизация

На практике ПЦР может оказаться неудачной по разным причинам, например из-за чувствительности или контаминации. ^{[17] [18]} Загрязнение посторонней ДНК может привести к образованию ложных продуктов и устраняется лабораторными протоколами и процедурами, которые отделяют смеси для пре-ПЦР от потенциальных примесей ДНК. ^[8] Например, если анализируется ДНК с места преступления, одна молекула ДНК персонала лаборатории может быть амплифицирована и ввести расследование в заблуждение. Следовательно, зоны установки ПЦР отделены от анализируемых или очищаемых других продуктов ПЦР, используемой одноразовой пластиковой посуды, а рабочая поверхность между установками реакции должна быть тщательно очищена.

Специфичность можно регулировать с помощью экспериментальных условий, чтобы не образовывалось ложных продуктов. Методы разработки праймеров важны для повышения выхода продуктов ПЦР и предотвращения образования неспецифических продуктов. Использование альтернативных буферных компонентов или ферментов-полимераз может помочь в амплификации длинных или проблемных участков ДНК. Например, считается, что полимераза Q5 в ~ 280 раз менее подвержена ошибкам, чем полимераза Taq. ^{[19] [20]} Как рабочие параметры (например, температура и продолжительность циклов), так и добавление реагентов, таких как формамид , могут повысить специфичность и выход ПЦР. ^[21] Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в разработке праймера. ^[22]

Приложения

Селективное выделение ДНК

ПЦР позволяет выделить фрагменты ДНК из геномной ДНК путем избирательной амплификации определенного участка ДНК. Такое использование ПЦР расширяет возможности многих способов, таких как создание гибридизационных зондов для южной или северной гибридизации и клонирование ДНК , которые требуют большего количества ДНК, представляющей определенную область ДНК. ПЦР обеспечивает эти методы большим количеством чистой ДНК, что позволяет анализировать образцы ДНК даже из очень небольших количеств исходного материала.

Другие применения ПЦР включают секвенирование ДНК для определения неизвестных последовательностей, амплифицированных с помощью ПЦР, в которых один из праймеров амплификации может быть использован при секвенировании по Сэнгеру , выделение последовательности ДНК для ускорения технологий рекомбинантной ДНК, включающих вставку последовательности ДНК в плазмиду , фаг . , или космида (в зависимости от размера), или генетический материал другого организма. Бактериальные колонии (такие как E. coli ) можно быстро проверить с помощью ПЦР на наличие правильных векторных конструкций ДНК. ^[23] ПЦР также может использоваться для снятия генетических отпечатков пальцев ; судебно-медицинский метод, используемый для идентификации человека или организма путем сравнения экспериментальных ДНК с помощью различных методов на основе ПЦР.

Электрофорез ПЦР-амплифицированных фрагментов ДНК:

1. Отец
2. Ребенок
3. Мать

Ребенок унаследовал некоторые, но не все, отпечатки пальцев каждого из своих родителей, что дало ему новый, уникальный отпечаток пальца.

Некоторые методы ПЦР-отпечатков пальцев обладают высокой дискриминационной способностью и могут использоваться для выявления генетических связей между людьми, например, родитель-ребенок или между братьями и сестрами, а также используются при тестировании на отцовство (рис. 4). Этот метод также можно использовать для определения эволюционных взаимоотношений между организмами при использовании определенных молекулярных часов (например, генов 16S рРНК и RecA микроорганизмов). ^[24]

Амплификация и количественная оценка ДНК

Поскольку ПЦР амплифицирует области ДНК, на которые она нацелена, ПЦР можно использовать для анализа очень небольших количеств образца. Это часто имеет решающее значение для судебно-медицинской экспертизы , когда в качестве доказательства доступны лишь следы ДНК. ПЦР также можно использовать для анализа древней ДНК , возраст которой составляет десятки тысяч лет. Эти методы, основанные на ПЦР, были успешно использованы на животных, таких как сорокатысячелетний мамонт , а также на человеческой ДНК, в различных приложениях: от анализа египетских мумий до идентификации русского царя и тела Английский король Ричард III . ^[25]

Методы количественной ПЦР или ПЦР в реальном времени (qPCR, ^[26] не путать с RT-PCR ) позволяют оценить количество заданной последовательности, присутствующей в образце — метод, часто применяемый для количественного определения уровней экспрессии генов . Количественная ПЦР — это признанный инструмент количественного определения ДНК, который измеряет накопление продукта ДНК после каждого раунда амплификации ПЦР.

qPCR позволяет количественно оценить и обнаружить определенную последовательность ДНК в режиме реального времени, поскольку он измеряет концентрацию во время процесса синтеза. Существует два метода одновременного обнаружения и количественного определения. Первый метод заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые неспецифически удерживаются между двойными цепями. Второй метод предполагает использование зондов, которые кодируют определенные последовательности и флуоресцентно мечены. Обнаружение ДНК этими методами можно увидеть только после того, как произойдет гибридизация зондов с комплементарной ей ДНК (кДНК). Интересной комбинацией методов является ПЦР в реальном времени и обратная транскрипция. Этот сложный метод, называемый RT-qPCR, позволяет количественно оценить небольшое количество РНК. С помощью этого комбинированного метода мРНК преобразуется в кДНК, которую дополнительно определяют количественно с помощью кПЦР. Этот метод снижает вероятность ошибки в конечной точке ПЦР, ^[27] увеличивая шансы обнаружения генов, связанных с генетическими заболеваниями, такими как рак. ^[5] Лаборатории используют RT-qPCR с целью точного измерения регуляции генов. Математические основы надежной количественной оценки ПЦР ^[28] и RT-qPCR ^[29] облегчают реализацию процедур точной подгонки экспериментальных данных в исследовательских, медицинских, диагностических и инфекционных приложениях. ^{[30] [31] [32] [33]}

Медицинские и диагностические приложения

Потенциальные родители могут быть проверены на наличие генетического носителя , или их дети могут быть проверены на наличие заболевания . ^[2] Образцы ДНК для пренатального тестирования можно получить с помощью амниоцентеза , отбора проб ворсин хориона или даже путем анализа редких клеток плода, циркулирующих в кровотоке матери. ПЦР-анализ также важен для преимплантационной генетической диагностики , когда отдельные клетки развивающегося эмбриона проверяются на наличие мутаций.

• ПЦР также может использоваться как часть чувствительного теста на типирование тканей , что имеет жизненно важное значение для трансплантации органов . С 2008 года ^{[обновлять]}существует даже предложение заменить традиционные тесты на определение группы крови на основе антител тестами на основе ПЦР. ^[34]
• Многие формы рака включают изменения в онкогенах . Используя тесты на основе ПЦР для изучения этих мутаций, схемы терапии иногда можно индивидуально настроить для пациента. ПЦР позволяет на ранней стадии диагностировать злокачественные заболевания, такие как лейкемия и лимфома , что в настоящее время является наиболее развитым методом исследования рака и уже широко используется. ПЦР-анализы можно проводить непосредственно на образцах геномной ДНК для обнаружения транслокационно-специфичных злокачественных клеток с чувствительностью, которая как минимум в 10 000 раз выше, чем у других методов. ^[35] ПЦР очень полезна в области медицины, поскольку позволяет изолировать и амплифицировать супрессоры опухолей. Например, количественную ПЦР можно использовать для количественного определения и анализа отдельных клеток, а также для распознавания подтверждений и комбинаций ДНК, мРНК и белков. ^[27]

Применение при инфекционных заболеваниях

ПЦР позволяет быстро и высокоспецифично диагностировать инфекционные заболевания, в том числе вызванные бактериями или вирусами. ^[36] ПЦР также позволяет идентифицировать некультивируемые или медленно растущие микроорганизмы, такие как микобактерии , анаэробные бактерии или вирусы , на основе анализов тканевых культур и животных моделей . В основе применения ПЦР-диагностики в микробиологии лежит обнаружение инфекционных агентов и отличие непатогенных штаммов от патогенных на основе специфических генов. ^{[36] [37]}

Характеристика и обнаружение возбудителей инфекционных заболеваний были революционизированы с помощью ПЦР следующими способами:

• Вирус иммунодефицита человека (или ВИЧ ) является трудной мишенью для обнаружения и искоренения. Самые ранние тесты на инфекцию основывались на наличии антител к вирусу, циркулирующих в кровотоке. Однако антитела появляются только через много недель после заражения, материнские антитела маскируют инфекцию новорожденного, а терапевтические средства для борьбы с инфекцией не влияют на антитела. Были разработаны ПЦР- тесты , которые позволяют обнаружить всего лишь один вирусный геном среди ДНК более чем 50 000 клеток-хозяев. ^[38] Инфекции можно обнаружить раньше, донорскую кровь можно проверить непосредственно на наличие вируса, новорожденных можно немедленно проверить на наличие инфекции, а эффективность противовирусного лечения можно оценить количественно .
• Некоторые болезнетворные микроорганизмы, например туберкулез , трудно получить от пациентов, и их медленно выращивать в лаборатории. Тесты на основе ПЦР позволили обнаружить небольшое количество болезнетворных организмов (как живых, так и мертвых) в удобных образцах . Подробный генетический анализ также можно использовать для выявления устойчивости к антибиотикам, что позволяет немедленно и эффективно начать лечение. Эффекты терапии также можно оценить сразу.
• Распространение болезнетворного организма среди популяций домашних или диких животных можно отслеживать с помощью ПЦР-тестирования. Во многих случаях появление новых вирулентных подтипов можно обнаружить и отслеживать. Подтипы организма, ответственные за предыдущие эпидемии , также можно определить с помощью ПЦР-анализа.
• Вирусную ДНК можно обнаружить с помощью ПЦР. Используемые праймеры должны быть специфичны для целевых последовательностей ДНК вируса, а ПЦР можно использовать для диагностического анализа или секвенирования ДНК вирусного генома. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаружить вирус вскоре после заражения и даже до начала заболевания. ^[36] Такое раннее выявление может дать врачам значительное время на лечение. Количество вируса (« вирусная нагрузка ») у пациента также можно определить количественно с помощью методов количественного анализа ДНК на основе ПЦР (см. Ниже). Вариант ПЦР ( ОТ-ПЦР ) используется для обнаружения вирусной РНК, а не ДНК: в этом тесте фермент обратная транскриптаза используется для создания последовательности ДНК, которая соответствует вирусной РНК; затем эту ДНК амплифицируют обычным методом ПЦР. RT-PCR широко используется для обнаружения вирусного генома SARS-CoV-2. ^[39]
• Такие заболевания, как коклюш (или коклюш ), вызываются бактериями Bordetella pertussis . Эта бактерия вызывает серьезную острую респираторную инфекцию, которая поражает различных животных и людей и привела к гибели многих детей раннего возраста. Токсин коклюша представляет собой белковый экзотоксин, который связывается с клеточными рецепторами двумя димерами и реагирует с различными типами клеток, такими как Т-лимфоциты, которые играют роль в клеточном иммунитете. ^[40] ПЦР является важным инструментом тестирования, который может обнаружить последовательности в гене коклюшного токсина. Поскольку ПЦР имеет высокую чувствительность к токсину и быстрое время обработки, она очень эффективна для диагностики коклюша по сравнению с посевом. ^[41]

Криминалистические приложения

Разработка протоколов генетического (или ДНК ) снятия отпечатков пальцев на основе ПЦР нашла широкое применение в криминалистике :

• 

  Образцы ДНК часто берутся на месте преступления и анализируются методом ПЦР.

  В своей наиболее разборчивой форме генетическая дактилоскопия может однозначно отличить любого человека от всего населения мира . Мельчайшие образцы ДНК можно выделить с места преступления и сравнить с образцами ДНК подозреваемых или из базы данных ДНК предыдущих улик или осужденных. Более простые версии этих тестов часто используются для быстрого исключения подозреваемых в ходе уголовного расследования. Доказательства преступлений, совершенных десятилетиями, могут быть проверены, подтвердив или оправдав первоначально осужденных людей.
• Судебно-медицинское типирование ДНК стало эффективным способом выявления или оправдания подозреваемых в совершении преступлений благодаря анализу улик, обнаруженных на месте преступления. Геном человека имеет множество повторяющихся участков, которые можно найти в последовательностях генов или в некодирующих участках генома. В частности, до 40% ДНК человека повторяется. ^[5] Существуют две отдельные категории этих повторяющихся некодирующих областей генома. Первая категория называется тандемными повторами с переменным числом (VNTR) и имеет длину 10–100 пар оснований, а вторая категория называется короткими тандемными повторами (STR) и состоит из повторяющихся участков из 2–10 пар оснований. ПЦР используется для амплификации нескольких хорошо известных VNTR и STR с использованием праймеров, фланкирующих каждую из повторяющихся областей. Размеры фрагментов, полученных от любого человека для каждого из STR, будут указывать, какие аллели присутствуют. Анализируя несколько STR отдельного человека, можно обнаружить набор аллелей для каждого человека, который статистически, скорее всего, будет уникальным. ^[5] Исследователи определили полную последовательность человеческого генома. Доступ к этой последовательности можно легко получить через веб-сайт NCBI, и она используется во многих реальных приложениях. Например, ФБР составило набор сайтов-маркеров ДНК, используемых для идентификации, и они называются базой данных ДНК Комбинированной системы индексов ДНК (CODIS). ^[5] Использование этой базы данных позволяет использовать статистический анализ для определения вероятности совпадения образца ДНК. ПЦР — очень мощный и важный аналитический инструмент, который можно использовать для судебно-медицинского типирования ДНК, поскольку исследователям нужно лишь очень небольшое количество целевой ДНК для анализа. Например, один человеческий волос с прикрепленным к нему волосяным фолликулом имеет достаточно ДНК для проведения анализа. Точно так же несколько сперматозоидов, образцы кожи из-под ногтей или небольшое количество крови могут предоставить достаточно ДНК для окончательного анализа. ^[5]
• Менее избирательные формы снятия отпечатков пальцев ДНК могут помочь в тестировании ДНК на отцовство , когда человека сопоставляют с его близкими родственниками. ДНК неопознанных человеческих останков можно протестировать и сравнить с ДНК возможных родителей, братьев, сестер или детей. Аналогичное тестирование можно использовать для подтверждения биологических родителей усыновленного (или похищенного) ребенка. Фактический биологический отец новорожденного также может быть подтвержден (или исключен).
• Было показано, что дизайн ПЦР AMGX/AMGY не только ^{[ необходимы разъяснения ]} способствует амплификации последовательностей ДНК из очень незначительного количества генома. Однако его также можно использовать для определения пола в реальном времени по образцам судебно-медицинской экспертизы костей. Это обеспечивает мощный и эффективный способ определения пола в судебных делах и древних образцах. ^[42]

Исследовательские приложения

ПЦР применяется во многих областях исследований молекулярной генетики:

• ПЦР позволяет быстро получать короткие фрагменты ДНК, даже если известна не более чем последовательность двух праймеров. Эта способность ПЦР дополняет многие методы, такие как создание гибридизационных зондов для Саузерн- или нозерн-блот -гибридизации. ПЦР обеспечивает эти методы большим количеством чистой ДНК, иногда в виде одной цепи, что позволяет проводить анализ даже из очень небольших количеств исходного материала.
• В задаче секвенирования ДНК также может помочь ПЦР. Известные сегменты ДНК можно легко получить от пациента с мутацией генетического заболевания. Модификации метода амплификации могут извлекать сегменты из совершенно неизвестного генома или генерировать только одну цепь интересующей области.
• ПЦР имеет множество применений в более традиционном процессе клонирования ДНК . Он может извлекать сегменты для вставки в вектор из более крупного генома, который может быть доступен только в небольших количествах. Используя один набор «векторных праймеров», он также может анализировать или извлекать фрагменты, которые уже были вставлены в векторы. Некоторые изменения протокола ПЦР могут привести к мутациям (общим или сайт-направленным) вставленного фрагмента.
• Сайты с маркировкой последовательностей — это процесс, в котором ПЦР используется в качестве индикатора присутствия определенного сегмента генома в конкретном клоне. Проект «Геном человека» счел это приложение жизненно важным для картирования космидных клонов, которые они секвенировали, и для координации результатов из разных лабораторий.
• Применением ПЦР является филогенетический анализ ДНК из древних источников , например, найденной в восстановленных костях неандертальцев , в замороженных тканях мамонтов или в мозгу египетских мумий. ^[16] В некоторых случаях сильно деградированная ДНК из этих источников может быть собрана заново на ранних стадиях амплификации.
• Распространенным применением ПЦР является изучение закономерностей экспрессии генов . Ткани (или даже отдельные клетки) можно анализировать на разных стадиях, чтобы увидеть, какие гены стали активными, а какие были выключены. Это приложение также может использовать количественную ПЦР для количественной оценки фактических уровней экспрессии.
• Способность ПЦР одновременно амплифицировать несколько локусов из отдельных сперматозоидов ^[43] значительно расширила более традиционную задачу генетического картирования путем изучения хромосомных кроссинговеров после мейоза . Редкие события кроссинговера между очень близкими локусами наблюдались напрямую при анализе тысяч отдельных сперматозоидов. Аналогичным образом можно анализировать необычные делеции, инсерции, транслокации или инверсии, и все это без необходимости ждать (или платить) за долгие и трудоемкие процессы оплодотворения, эмбриогенеза и т. д.
• Сайт-направленный мутагенез : ПЦР можно использовать для создания мутантных генов с мутациями, выбранными учеными по желанию. Эти мутации можно выбрать, чтобы понять, как белки выполняют свои функции, а также изменить или улучшить функцию белков.

Преимущества

ПЦР имеет ряд преимуществ. Его довольно просто понять и использовать, и он быстро дает результаты. Этот метод очень чувствителен и позволяет производить миллионы и миллиарды копий конкретного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. qRT-PCR имеет те же преимущества, что и PCR, с дополнительным преимуществом количественного определения синтезированного продукта. Поэтому его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микробах или других болезненных состояниях. ^[27]

ПЦР — очень мощный и практичный инструмент исследования. С помощью ПЦР выясняется секвенирование неизвестной этиологии многих заболеваний. Этот метод может помочь идентифицировать последовательность ранее неизвестных вирусов, связанных с уже известными, и, таким образом, дать нам лучшее понимание самого заболевания. Если процедуру удастся еще больше упростить и разработать чувствительные нерадиометрические системы обнаружения, ПЦР займет видное место в клинической лаборатории на долгие годы вперед. ^[16]

Ограничения

Одним из основных ограничений ПЦР является то, что необходима предварительная информация о целевой последовательности для создания праймеров, которые позволят ее селективную амплификацию. ^[27] Это означает, что, как правило, пользователи ПЦР должны знать точную последовательность(и) выше целевой области на каждой из двух одноцепочечных матриц, чтобы гарантировать, что ДНК-полимераза правильно связывается с гибридами праймер-матрица и впоследствии генерирует всю целевую область во время синтеза ДНК.

Как и все ферменты, ДНК-полимеразы также склонны к ошибкам, что, в свою очередь, вызывает мутации в генерируемых ПЦР-фрагментах. ^[44]

Еще одним ограничением ПЦР является то, что даже самое незначительное количество загрязняющей ДНК может быть амплифицировано, что приводит к вводящим в заблуждение или неоднозначным результатам. Чтобы свести к минимуму вероятность заражения, исследователи должны зарезервировать отдельные помещения для подготовки реагентов, ПЦР и анализа продукта. Реагенты следует расфасовать в одноразовые аликвоты . Следует регулярно использовать пипетки с одноразовыми поршнями и удлиненными наконечниками. ^[16] Кроме того, рекомендуется обеспечить, чтобы лабораторная установка соответствовала однонаправленному рабочему процессу. Никакие материалы или реагенты, используемые в комнатах для ПЦР и анализа, никогда не следует вносить в комнату для подготовки к ПЦР без тщательной дезинфекции. ^[45]

Образцы окружающей среды, содержащие гуминовые кислоты, могут препятствовать амплификации ПЦР и приводить к неточным результатам.

Вариации

• Аллель-специфическая ПЦР или система устойчивых к амплификации мутаций (ARMS) : метод диагностики или клонирования, основанный на однонуклеотидных вариациях (SNV, не путать с SNP ) (одноосновательные различия у пациента). Эта система может обнаружить любую мутацию, связанную с изменением одного основания. Он требует предварительного знания последовательности ДНК, включая различия между аллелями , и использует праймеры, 3'-концы которых охватывают SNV (буфер пары оснований вокруг SNV обычно включается). ^[46] ПЦР-амплификация в строгих условиях гораздо менее эффективна при наличии несоответствия между матрицей и праймером, поэтому успешная амплификация с SNP-специфичным праймером сигнализирует о наличии специфического SNP или небольших делеций в последовательности. ^[47] Для получения дополнительной информации см. генотипирование SNP .
• Сборочная ПЦР или полимеразная циклическая сборка (PCA) : искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем выполнения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуют смысловые и антисмысловые направления, а перекрывающиеся сегменты определяют порядок ПЦР-фрагментов, тем самым избирательно производя конечный продукт длинной ДНК. ^[48]
• Асимметричная ПЦР : преимущественно амплифицирует одну цепь ДНК в двухцепочечной матрице ДНК. Он используется при секвенировании и гибридизации, где требуется амплификация только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводят как обычно, но с большим избытком праймера для цепи, предназначенной для амплификации. Из-за медленной ( арифметической ) амплификации на более поздних стадиях реакции после того, как лимитирующий праймер был израсходован, требуются дополнительные циклы ПЦР. ^[49] Недавняя модификация этого процесса, известная как линейная _{послеэкспоненциальная} ПЦР ( LATE-PCR), использует ограничивающий праймер с более высокой температурой плавления (Tm ) , чемизбыточный праймер, для поддержанияэффективность реакции, поскольку предельная концентрация праймера снижается в середине реакции. ^[50]
• Конвективная ПЦР : псевдоизотермический способ проведения ПЦР. Вместо многократного нагревания и охлаждения смеси для ПЦР раствор подвергается воздействию температурного градиента. Возникающий в результате термической нестабильности конвективный поток автоматически перемещает реагенты ПЦР из горячих и холодных областей, многократно обеспечивая ПЦР. ^[51] Такие параметры, как температурные граничные условия и геометрия корпуса ПЦР, можно оптимизировать для обеспечения надежной и быстрой ПЦР за счет использования возникновения хаотических полей потока. ^[52] Такая установка ПЦР с конвективным потоком значительно снижает потребляемую мощность устройства и время работы.
• ПЦР по телефонной линии : высокопараллельный метод получения точных молекул ДНК для синтеза генов. Сложная библиотека молекул ДНК модифицируется с помощью уникальных фланкирующих меток перед массовым параллельным секвенированием. Затем тег-ориентированные праймеры позволяют извлекать молекулы с желаемыми последовательностями с помощью ПЦР. ^[53]
• Цифровая ПЦР (дПЦР) : используется для измерения количества целевой последовательности ДНК в образце ДНК. Образец ДНК сильно разбавлен, поэтому после параллельного проведения множества ПЦР некоторые из них не получают ни одной молекулы целевой ДНК. Целевая концентрация ДНК рассчитывается с использованием доли отрицательных результатов. Отсюда и название «цифровая ПЦР».
• Геликазозависимая амплификация : аналогична традиционной ПЦР, но использует постоянную температуру, а не циклически проходит через циклы денатурации и отжига/удлинения. ДНК-геликаза , фермент, раскручивающий ДНК, используется вместо термической денатурации. ^[54]
• ПЦР с горячим стартом : метод, который снижает неспецифическую амплификацию на начальных этапах подготовки ПЦР. Это можно выполнить вручную, нагревая компоненты реакции до температуры денатурации (например, 95 °C) перед добавлением полимеразы. ^[55] Были разработаны специализированные ферментные системы, которые ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды либо за счет связывания антитела [ ^{13] [56]} , либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после стадии высокотемпературной активации. ПЦР с горячим стартом и холодным финишем осуществляется с использованием новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и мгновенно активируются при температуре элонгации.
• ПЦР in silico (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, электронная ПЦР) относится к вычислительным инструментам, используемым для расчета теоретических результатов полимеразной цепной реакции с использованием заданного набора праймеров ( зондов ) для амплификации последовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома . ПЦР in silico была предложена в качестве учебного пособия по молекулярной биологии. ^[57]
• Межпоследовательность-специфическая ПЦР (ISSR): метод ПЦР для снятия отпечатков пальцев ДНК, который амплифицирует области между повторами простых последовательностей для получения уникального отпечатка пальца амплифицированных длин фрагментов. ^[58]
• Обратная ПЦР : обычно используется для идентификации фланкирующих последовательностей вокруг геномных вставок. Он включает в себя серию расщеплений ДНК и самолигирование , в результате чего на обоих концах неизвестной последовательности появляются известные последовательности. ^[59]
• ПЦР, опосредованная лигированием : используются небольшие ДНК-линкеры, лигированные с интересующей ДНК, и несколько праймеров, отжигаемых с ДНК-линкерами; его использовали для секвенирования ДНК , прогулки по геному и определения следов ДНК . ^[60]
• ПЦР, специфичная для метилирования (MSP): разработана Стивеном Бэйлином и Джеймсом Г. Херманом из Медицинской школы Джонса Хопкинса ^[61] и используется для обнаружения метилирования CpG-островков в геномной ДНК. Сначала ДНК обрабатывают бисульфитом натрия, который превращает неметилированные основания цитозина в урацил, который распознается праймерами ПЦР как тимин. Затем проводят две ПЦР на модифицированной ДНК с использованием наборов праймеров, идентичных, за исключением любых CpG-островков в последовательностях праймеров. В этих точках один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для амплификации метилированной ДНК, а другой набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также можно выполнить для получения количественной, а не качественной информации о метилировании.
• ПЦР с мини-праймерами : использует термостабильную полимеразу (S-Tbr), которая может состоять из коротких праймеров («smalligos») длиной всего 9 или 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет нацеливать ПЦР на более мелкие области связывания праймера и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как ген 16S (или эукариотической 18S) рРНК. ^[62]
• Мультиплексная амплификация зонда, зависимая от лигирования ( MLPA ): позволяет амплифицировать несколько мишеней с помощью одной пары праймеров, избегая тем самым ограничений разрешения мультиплексной ПЦР (см. ниже).
• Мультиплексная ПЦР : состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР для получения ампликонов разных размеров, специфичных для разных последовательностей ДНК. Воздействуя одновременно на несколько генов, можно получить дополнительную информацию за один тест, для выполнения которого в противном случае потребовалось бы в несколько раз больше реагентов и больше времени. Температуры отжига для каждого набора праймеров должны быть оптимизированы для правильной работы в рамках одной реакции, а также размеры ампликонов. То есть длина их пар оснований должна быть достаточно разной, чтобы при визуализации с помощью гель-электрофореза образовывались отдельные полосы .
• ПЦР с использованием наночастиц (наноПЦР) : некоторые наночастицы (НЧ) могут повышать эффективность ПЦР (поэтому их называют наноПЦР), а некоторые могут даже превосходить оригинальные усилители ПЦР. Сообщалось, что квантовые точки (КТ) могут улучшить специфичность и эффективность ПЦР. Одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ) и многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) эффективны для усиления амплификации длинной ПЦР. Углеродный нанопорошок (CNP) может повысить эффективность повторной ПЦР и длительной ПЦР, в то время как было обнаружено, что оксид цинка , диоксид титана и наночастицы Ag увеличивают выход ПЦР. Предыдущие данные показали, что неметаллические НЧ сохранили приемлемую точность усиления. Учитывая, что многие НЧ способны повысить эффективность ПЦР, очевидно, что существует большой потенциал для усовершенствования технологии наноПЦР и разработки продуктов. ^{[63] [64]}
• Вложенная ПЦР : повышает специфичность амплификации ДНК за счет снижения фона из-за неспецифической амплификации ДНК. В двух последовательных ПЦР используются два набора праймеров. В первой реакции одна пара праймеров используется для генерации продуктов ДНК, которые помимо намеченной мишени могут еще состоять из неспецифически амплифицированных фрагментов ДНК. Затем продукт(ы) используют во второй ПЦР с набором праймеров, сайты связывания которых полностью или частично отличаются от каждого из праймеров, использованных в первой реакции, и расположены на 3'-конце. Вложенная ПЦР часто более успешна в специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем обычная ПЦР, но требует более детального знания целевых последовательностей.
• ПЦР с перекрытием или сплайсинг путем расширения с перекрытием (SOEing) : метод генной инженерии , который используется для сращивания двух или более фрагментов ДНК, содержащих комплементарные последовательности. Он используется для соединения фрагментов ДНК, содержащих гены, регуляторные последовательности или мутации; этот метод позволяет создавать специфические и длинные конструкции ДНК. Он также может вводить делеции, вставки или точечные мутации в последовательность ДНК. ^{[65] [66]}
• PAN-AC : использует изотермические условия для амплификации и может использоваться в живых клетках. ^{[67] [68]}
• ПАН-ПЦР : вычислительный метод разработки анализов типирования бактерий на основе данных последовательности всего генома. ^[69]
• Количественная ПЦР (кПЦР): используется для измерения количества целевой последовательности (обычно в режиме реального времени). Он количественно измеряет начальное количество ДНК, кДНК или РНК. Количественная ПЦР обычно используется для определения наличия последовательности ДНК в образце и количества ее копий в образце. Количественный ПЦР имеет очень высокую степень точности. В методах количественной ПЦР используются флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, EvaGreen, или содержащие флуорофор зонды ДНК, такие как TaqMan , для измерения количества амплифицированного продукта в реальном времени. Иногда его также сокращают до RT-PCR ( ПЦР в реальном времени ), но эту аббревиатуру следует использовать только для ПЦР с обратной транскрипцией . qPCR — это соответствующие сокращения для количественной ПЦР (ПЦР в реальном времени).
• ПЦР с обратным комплементом (RC-PCR): позволяет независимо добавлять функциональные домены или последовательности по выбору к любому концу созданного ампликона в одной реакции в закрытой пробирке. Этот метод генерирует целевые специфические праймеры в ходе реакции путем взаимодействия универсальных праймеров (которые содержат желаемые последовательности или домены, которые нужно присоединить) и RC-зондов.
• ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР ) : для амплификации ДНК из РНК. Обратная транскриптаза транскрибирует РНК в кДНК , которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. RT-PCR широко используется для определения профиля экспрессии , для определения экспрессии гена или для идентификации последовательности транскрипта РНК, включая сайты начала и терминации транскрипции. Если последовательность геномной ДНК гена известна, RT-PCR можно использовать для картирования расположения экзонов и интронов в гене. 5'-конец гена (соответствующий месту начала транскрипции) обычно идентифицируется с помощью RACE-PCR ( быстрая амплификация концов кДНК ).
• РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР): модификация ПЦР, в которой используются праймеры с 3'-удлиненным блоком, который может быть удален термостабильным ферментом РНКазы HII. Эта система уменьшает количество димеров праймеров и позволяет проводить мультиплексные реакции с большим количеством праймеров. ^[70]
• ПЦР с одним специфическим праймером (SSP-PCR): позволяет амплифицировать двухцепочечную ДНК, даже если информация о последовательности доступна только на одном конце. Этот метод позволяет амплифицировать гены, для которых доступна только частичная информация о последовательностях, и обеспечивает однонаправленное перемещение генома от известных к неизвестным участкам хромосомы. ^[71]
• Твердофазная ПЦР : включает в себя несколько значений, в том числе полярную амплификацию (когда колонии ПЦР получают, например, в гелевой матрице), мостовую ПЦР ^[72] (праймеры ковалентно связаны с поверхностью твердого носителя), традиционную твердофазную ПЦР (где Асимметричная ПЦР применяется в присутствии праймера, несущего твердую подложку с последовательностью, совпадающей с одним из водных праймеров) и улучшенной твердофазной ПЦР ^[73] (где обычная твердофазная ПЦР может быть улучшена за счет использования высокой Tm и вложенного праймера на твердой опоре с дополнительным применением). термического «шага», способствующего грунтованию твердой опоры).
• Суицидная ПЦР : обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где избежание ложноположительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента является наивысшим приоритетом. Первоначально он был описан в исследовании по проверке присутствия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, полученных из могил людей 14 века, предположительно убитых чумой во время средневековой эпидемии Черной смерти . ^[74] Этот метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), что никогда не должно использоваться в какой-либо реакции ПЦР с положительным контролем, и праймеры всегда должны быть нацелены на область генома, которая никогда не амплифицировалась. перед тем, как в лаборатории использовать этот или любой другой набор праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет примеси ДНК из предыдущих реакций ПЦР, что в противном случае могло бы привести к ложноположительным результатам.
• Термическая асимметричная чересстрочная ПЦР (TAIL-PCR) : для выделения неизвестной последовательности, фланкирующей известную последовательность. В рамках известной последовательности в TAIL-PCR используется вложенная пара праймеров с разными температурами отжига; вырожденный праймер используется для амплификации в другом направлении от неизвестной последовательности. ^[75]
• Touchdown PCR ( Step-down PCR ): вариант ПЦР, целью которого является снижение неспецифического фона путем постепенного снижения температуры отжига по мере прохождения цикла ПЦР. Температура отжига на начальных циклах обычно на несколько градусов (3–5 °С) выше Т _m используемых праймеров, тогда как на более поздних циклах она на несколько градусов (3–5 °С) ниже Т праймера. _м . Более высокие температуры обеспечивают большую специфичность связывания праймеров, а более низкие температуры позволяют более эффективно амплифицировать специфические продукты, образующиеся в начальных циклах. ^[76]
• Universal Fast Walking : для обхода генома и снятия генетических отпечатков пальцев с использованием более специфичной «двусторонней» ПЦР, чем традиционные «односторонние» подходы (с использованием только одного ген-специфического праймера и одного общего праймера, что может привести к артефактному «шуму»). ^[77] в силу механизма формирования лариатной структуры. Упрощенными производными UFW являются LaNe RAGE (лариат-зависимая вложенная ПЦР для быстрой амплификации концов геномной ДНК), ^[78] 5'RACE LaNe ^[79] и 3'RACE LaNe. ^[80]

История

Схематическое изображение примера пары праймеров. Использование праймеров в анализах in vitro для синтеза ДНК стало крупным нововведением, позволившим разработать ПЦР.

Термостойкие ферменты, являющиеся ключевым компонентом полимеразной цепной реакции, были открыты в 1960-х годах как продукт микробной формы жизни, обитавшей в перегретых водах Грибного источника Йеллоустона . ^[81]

В статье 1971 года в «Журнале молекулярной биологии», написанной Кьеллом Клеппе и его коллегами из лаборатории Х. Гобинда Кораны, впервые был описан метод использования ферментативного анализа для репликации короткой матрицы ДНК с праймерами in vitro . ^[82] Однако это раннее проявление основного принципа ПЦР в то время не привлекло особого внимания, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году обычно приписывают Кэри Маллису . ^{[83] [ нужна страница ]}

«Baby Blue», прототип машины для проведения ПЦР 1986 года.

Когда Маллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле , штат Калифорния, в Cetus Corporation , одной из первых биотехнологических компаний, где он отвечал за синтез коротких цепочек ДНК. Маллис написал, что идея ПЦР пришла ему в голову, когда однажды ночью он путешествовал по шоссе Тихоокеанского побережья на своей машине. ^[84] Он размышлял над новым способом анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда понял, что вместо этого изобрел метод амплификации любой области ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации, управляемых ДНК-полимеразой. В журнале Scientific American Маллис резюмировал процедуру: «Начав с одной молекулы ДНК генетического материала, ПЦР может генерировать 100 миллиардов подобных молекул за день. Реакцию легко выполнить. Для нее требуется не более чем пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла». ^[85] Впервые дактилоскопия ДНК была использована для установления отцовства в 1988 году. ^[86]

Маллис считает, что использование ЛСД стало неотъемлемой частью его разработки ПЦР: «Изобрел бы я ПЦР, если бы не принимал ЛСД? Я серьезно в этом сомневаюсь. Я мог бы сидеть на молекуле ДНК и наблюдать, как протекают полимеры. Я научился частично на психоделических препаратах». ^[87]

Маллис и биохимик Майкл Смит , разработавшие другие важные способы манипулирования ДНК, ^[1] были совместно удостоены Нобелевской премии по химии в 1993 году, через семь лет после того, как Маллис и его коллеги из Cetus впервые применили свое предложение на практике. ^[88] Статья Маллиса 1985 года совместно с Р.К. Сайки и Х.А. Эрлихом «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» — изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) — была удостоена награды Citation for Chemical. Премия за прорыв от Отдела истории химии Американского химического общества в 2017 году. ^{[89] [2]}

В основе метода ПЦР лежит использование подходящей ДНК-полимеразы , способной выдерживать высокие температуры > 90 ° C (194 ° F), необходимые для разделения двух цепей ДНК в двойной спирали ДНК после каждого цикла репликации . ДНК-полимеразы, первоначально использовавшиеся для экспериментов in vitro , предваряющих ПЦР, не смогли выдержать такие высокие температуры. ^[2] Таким образом, ранние процедуры репликации ДНК были очень неэффективными и трудоемкими и требовали большого количества ДНК-полимеразы и постоянного управления на протяжении всего процесса.

Открытие в 1976 году Taq- полимеразы — ДНК-полимеразы , выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus , которая в природе обитает в горячих (от 50 до 80 °C (122–176 °F)) средах ^[14] , таких как горячие источники, — проложило путь путь к радикальному усовершенствованию метода ПЦР. ДНК-полимераза, выделенная из T. aquaticus, стабильна при высоких температурах, оставаясь активной даже после денатурации ДНК ^[15] , что исключает необходимость добавления новой ДНК-полимеразы после каждого цикла. ^[3] Это позволило автоматизировать процесс амплификации ДНК на основе термоциклера.

Патентные споры

Методика ПЦР была запатентована Кэри Маллисом и передана Cetus Corporation , где Муллис работал, когда изобрел эту технику в 1983 году. Фермент Taq- полимераза также был защищен патентами. Было несколько громких судебных исков, связанных с этой методикой, включая неудачный иск ^[90] , поданный компанией DuPont . Швейцарская фармацевтическая компания Hoffmann-La Roche приобрела права на патенты в 1992 году. Срок действия последнего коммерческого патента на ПЦР истек в 2017 году ^[91].

Соответствующая патентная битва за фермент Taq- полимеразу ^{все еще} продолжается ^{. ]} в нескольких юрисдикциях по всему миру между компаниями Roche и Promega . Юридические аргументы вышли за рамки срока действия первоначальных патентов на ПЦР и Taq- полимеразу, срок действия которых истек 28 марта 2005 г. ^[92]

Смотрите также

• Биологический портал

• Тестирование на COVID-19
• всплеск ДНК
• Петлевая изотермическая амплификация
• Техника выбора
• Термус термофилус
• ДНК-полимераза Pfu

Рекомендации

1. «Нобелевская премия по химии 1993 года». NobelPrize.org .
2. Сайки РК, Шарф С, Фалуна Ф, Муллис КБ, Хорн ГТ, Эрлих ХА, Арнхайм Н (декабрь 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Наука . 230 (4732): 1350–54. Бибкод : 1985Sci...230.1350S. дои : 10.1126/science.2999980. ПМИД  2999980.
3. Сайки Р.К., Гельфанд Д.Х., Стоффель С., Шарф С.Дж., Хигучи Р., Хорн Г.Т. и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Наука . 239 (4839): 487–91. Бибкод : 1988Sci...239..487S. дои : 10.1126/science.239.4839.487. ПМИД  2448875.
4. Эннерс, Эдвард; Порта, Анджела Р. (2012). «Определение температуры отжига для полимеразной цепной реакции». Американский учитель биологии . 74 (4): 256–60. дои : 10.1525/около 2012.74.4.9. S2CID  86708426.
5. Нинфа, Александр; Баллу, Дэвид; Бенор, Мэрили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . США: Уайли. стр. 408–10. ISBN 978-0-470-08766-4.
6. Ченг С., Фоклер С., Барнс В.М., Хигучи Р. (июнь 1994 г.). «Эффективная амплификация длинных мишеней из клонированных вставок и геномной ДНК человека». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 91 (12): 5695–99. Бибкод : 1994PNAS...91.5695C. дои : 10.1073/pnas.91.12.5695 . ПМК 44063 . ПМИД  8202550. 
7. Карр AC, Мур С.Д. (2012). Люсия А. (ред.). «Надежная количественная оценка полимеразных цепных реакций с использованием глобальной подгонки». ПЛОС ОДИН . 7 (5): e37640. Бибкод : 2012PLoSO...737640C. дои : 10.1371/journal.pone.0037640 . ПМЦ 3365123 . ПМИД  22701526. 
8. Джозеф Сэмбрук и Дэвид В. Рассел (2001). Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство (третье изд.). Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор. ISBN 978-0-879-69576-7.Глава 8: Амплификация ДНК in vitro с помощью полимеразной цепной реакции
9. «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)» . Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США.
10. «ПЦР». Учебный центр генетических наук, Университет Юты .
11. Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (май 2004 г.). «Последние разработки в области оптимизации термостабильных ДНК-полимераз для эффективного применения». Тенденции в биотехнологии . 22 (5): 253–60. doi :10.1016/j.tibtech.2004.02.011. ПМИД  15109812.
12. Рычлик В., Спенсер В.Дж., Роудс Р.Э. (ноябрь 1990 г.). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro». Исследования нуклеиновых кислот . 18 (21): 6409–12. дои : 10.1093/нар/18.21.6409. ПМК 332522 . ПМИД  2243783. 
13. Sharkey DJ, Scalice ER, Christy KG, Atwood SM, Daiss JL (май 1994 г.). «Антитела как термолабильные переключатели: запуск полимеразной цепной реакции при высокой температуре». Био/Технологии . 12 (5): 506–09. дои : 10.1038/nbt0594-506. PMID  7764710. S2CID  2885453.
14. Чиен А, Эдгар Д.Б., Трела Дж.М. (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты крайнего термофила Thermus aquaticus». Журнал бактериологии . 127 (3): 1550–57. дои : 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. ПМК 232952 . ПМИД  8432. 
15. Lawyer FC, Стоффель С., Сайки РК, Чанг С.Ю., Ландре П.А., Абрамсон Р.Д., Гельфанд Д.Х. (май 1993 г.). «Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и усеченной формы с дефицитом экзонуклеазной активности от 5' до 3'». Методы и приложения ПЦР . 2 (4): 275–87. дои : 10.1101/гр.2.4.275 . ПМИД  8324500.
16. Шочетман Г., Оу С.И., Джонс В.К. (декабрь 1988 г.). "Полимеразной цепной реакции". Журнал инфекционных болезней . 158 (6): 1154–57. дои : 10.1093/infdis/158.6.1154. JSTOR  30137034. PMID  2461996.
17. Борман, Джон; Шустер, Дэвид; Ли, У-бо; Джесси, Джоэл; Ращян, Аюб (2000). «ПЦР из проблемных шаблонов» (PDF) . Фокус . 22 (1): 10. Архивировано из оригинала (PDF) 7 марта 2017 года.
18. Богетто, Прачи; Уэйдн, Лиза; Андерсон, Холли (2000). «Полезные советы по ПЦР» (PDF) . Фокус . 22 (1): 12. Архивировано из оригинала (PDF) 7 марта 2017 года.
19. Биолаборатории, Новая Англия. «Высококачественная ДНК-полимераза Q5® | NEB». www.neb.com . Проверено 4 декабря 2021 г.
20. Сзе, Марк А.; Шлосс, Патрик Д. (2019). «Влияние ДНК-полимеразы и количества раундов амплификации в ПЦР на данные последовательности гена 16S рРНК». мСфера . 4 (3): e00163–19. doi : 10.1128/mSphere.00163-19. ПМК 6531881 . ПМИД  31118299. 
21. Саркар Г., Капельнер С., Зоммер СС (декабрь 1990 г.). «Формамид может значительно улучшить специфичность ПЦР». Исследования нуклеиновых кислот . 18 (24): 7465. doi :10.1093/nar/18.24.7465. ПМК 332902 . ПМИД  2259646. 
22. «Электронный ПЦР». NCBI – Национальный центр биотехнологической информации . Проверено 13 марта 2012 г.
23. Павлов А.Р., Павлова Н.В., Козявкин С.А., Слесарев А.И. (2006). «Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибрида TopoTaq с другими ферментами». В Келечаве Дж. (ред.). Секвенирование ДНК II: оптимизация подготовки и очистки . Джонс и Бартлетт. стр. 241–57. ISBN 978-0-7637-3383-4.
24. Помбер Дж. Ф., Систек В., Буассино М., Френетт М. (октябрь 2009 г.). «Эволюционные взаимоотношения между стрептококками salivarius, выведенные из мультилокусной филогении на основе последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, RecA, secA и secY». БМК Микробиология . 9 : 232. дои : 10.1186/1471-2180-9-232 . ПМК 2777182 . ПМИД  19878555. 
25. «Химический синтез, секвенирование и амплификация ДНК (заметки по MBB/BIO 343)». Университет штата Аризона. Архивировано из оригинала 9 октября 1997 года . Проверено 29 октября 2007 г.
26. Бустин С.А., Бенеш В., Гарсон Дж.А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж., Кубиста М. и др. (апрель 2009 г.). «Руководство MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» (PDF) . Клиническая химия . 55 (4): 611–22. дои : 10.1373/clinchem.2008.112797 . ПМИД  19246619.
27. Гарибян Л., Авашиа Н. (март 2013 г.). "Полимеразной цепной реакции". Журнал исследовательской дерматологии . 133 (3): 1–4. дои : 10.1038/jid.2013.1. ПМК 4102308 . ПМИД  23399825. 
28. Шнелл, С.; Мендоса, К. (октябрь 1997 г.). «Теоретическое описание полимеразной цепной реакции». Журнал теоретической биологии . 188 (3): 313–18. Бибкод : 1997JThBi.188..313S. дои : 10.1006/jtbi.1997.0473. ПМИД  9344735.
29. Шнелл, С.; Мендоса, К. (21 февраля 1997 г.). «Энзимологические соображения по теоретическому описанию количественной конкурентной полимеразной цепной реакции (КК-ПЦР)». Журнал теоретической биологии . 184 (4): 433–40. Бибкод : 1997JThBi.184..433S. дои : 10.1006/jtbi.1996.0283. ISSN  0022-5193. ПМИД  9082073.
30. Беккер, Свен; Бёгер, Питер; Ольманн, Ральф; Эрнст, Аннелизе (1 ноября 2000 г.). «Смещение ПЦР в экологическом анализе: пример количественного анализа нуклеазы Taq в анализе микробных сообществ». Прикладная и экологическая микробиология . 66 (11): 4945–53. Бибкод : 2000ApEnM..66.4945B. дои : 10.1128/АЕМ.66.11.4945-4953.2000. ISSN  1098-5336. ПМК 92404 . ПМИД  11055948. 
31. Соломон, Энтони В.; Пилинг, Розанна В.; Фостер, Аллен; Мэби, Дэвид К.В. (1 октября 2004 г.). «Диагностика и оценка трахомы». Обзоры клинической микробиологии . 17 (4): 982–1011. doi :10.1128/CMR.17.4.982-1011.2004. ISSN  0893-8512. ПМК 523557 . ПМИД  15489358. 
32. Рамзи, Реда MR (апрель 2002 г.). «Последние достижения в области молекулярных методов диагностики лимфатического филяриоза человека и их использование в эпидемиологических исследованиях». Труды Королевского общества тропической медицины и гигиены . 96 : С225–29. дои : 10.1016/S0035-9203(02)90080-5. ПМИД  12055843.
33. Саксе, Конрад (2003). «Специфичность и эффективность диагностических ПЦР-анализов». В Саксе, Конрад; Фрей, Иоахим (ред.). ПЦР-обнаружение микробных возбудителей . Методы молекулярной биологии. Том. 216. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр. 3–29. дои : 10.1385/1-59259-344-5:03. ISBN 978-1-59259-344-6. ПМИД  12512353.
34. Quill E (март 2008 г.). «Медицина. Сопоставление крови становится генетическим». Наука . 319 (5869): 1478–79. дои : 10.1126/science.319.5869.1478. PMID  18339916. S2CID  36945291.
35. Томар, Рукам (2010). Молекулярные маркеры и биотехнология растений . Питман Пура, Нью-Дели: Издательское агентство Новой Индии. п. 188. ИСБН 978-93-80235-25-7.
36. Cai HY, Касвелл Дж.Л., Прескотт Дж.Ф. (март 2014 г.). «Некультуральные молекулярные методы диагностики бактериальных заболеваний у животных: диагностическая лабораторная перспектива». Ветеринарная патология . 51 (2): 341–50. дои : 10.1177/0300985813511132 . ПМИД  24569613.
37. Салис А.Д. (2009). «Приложения в клинической микробиологии». ПЦР в реальном времени: современные технологии и приложения . Кайстер Академик Пресс. ISBN 978-1-904455-39-4.
38. Квок С., Мак Д.Х., Муллис К.Б., Поес Б., Эрлих Г., Блэр Д. и др. (май 1987 г.). «Идентификация последовательностей вируса иммунодефицита человека с использованием ферментативной амплификации in vitro и обнаружения расщепления олигомеров». Журнал вирусологии . 61 (5): 1690–94. дои : 10.1128/jvi.61.5.1690-1694.1987. ПМК 254157 . ПМИД  2437321. 
39. «Коронавирус: тест il viaggio dei» . Istituto Superiore di Sanità .
40. Палец, Хорст; фон Кениг, Карл Хайнц Вирсинг (1996). Барон, Сэмюэл (ред.). Медицинская микробиология (4-е изд.). Галвестон, Техас: Медицинское отделение Техасского университета в Галвестоне. ISBN 978-0-9631172-1-2. ПМИД  21413270.
41. Да, Сильвия Х.; Минк, КрисАнна М. (2012). «Bordetella pertussis и коклюш (коклюш)». Инфекционные болезни Неттера . стр. 11–14. дои : 10.1016/B978-1-4377-0126-5.00003-3. ISBN 978-1-4377-0126-5.
42. Алонсо А., Мартин П., Альбарран С., Гарсия П., Гарсия О., де Симон Л.Ф. и др. (январь 2004 г.). «Схемы ПЦР в реальном времени для оценки количества копий ядерной и митохондриальной ДНК в судебно-медицинской экспертизе и исследованиях древней ДНК». Международная судебно-медицинская экспертиза . 139 (2–3): 141–49. doi : 10.1016/j.forsciint.2003.10.008. ПМИД  15040907.
43. Бёнке М., Арнхайм Н., Ли Х., Коллинз Ф.С. (июль 1989 г.). «Генетическое картирование тонкой структуры хромосом человека с использованием полимеразной цепной реакции на одиночном сперматозоиде: соображения планирования эксперимента». Американский журнал генетики человека . 45 (1): 21–32. ПМЦ 1683385 . ПМИД  2568090. 
44. Чжоу Ю.Х., Чжан Х.П., Эбрайт Р.Х. (ноябрь 1991 г.). «Случайный мутагенез молекул ДНК размером с ген с использованием ПЦР с ДНК-полимеразой Taq». Исследования нуклеиновых кислот . 19 (21): 6052. doi :10.1093/nar/19.21.6052. ПМК 329070 . ПМИД  1658751. 
45. Стурсберг, Стефани (2021). «Создание ПЦР-лаборатории с нуля». ИНТЕГРА Бионауки .
46. Булдук, Б.К. и др. (март 2020 г.). «Новая стратегия амплификации-резистентной мутации и ПЦР для скрининга патогенных вариантов MT-TL1 в хранилищах пациентов». Биомаркеры Genet Test Mol . 24 (3): 165–170. дои : 10.1089/gtmb.2019.0079. PMID  32167396. S2CID  212693790.
47. Ньютон С.Р., Грэм А., Гептинсталл Л.Е., Пауэлл С.Дж., Саммерс С., Калшекер Н. и др. (апрель 1989 г.). «Анализ любой точечной мутации в ДНК. Система устойчивых к амплификации мутаций (ARMS)». Исследования нуклеиновых кислот . 17 (7): 2503–16. дои : 10.1093/нар/17.7.2503. ПМК 317639 . ПМИД  2785681. 
48. Стеммер В.П., Крамери А., Ха К.Д., Бреннан Т.М., Хейнекер Х.Л. (октябрь 1995 г.). «Одноэтапная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Джин . 164 (1): 49–53. дои : 10.1016/0378-1119(95)00511-4. ПМИД  7590320.
49. Иннис М.А., Мьямбо К.Б., Гельфанд Д.Х., Броу М.А. (декабрь 1988 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и прямое секвенирование ДНК, амплифицированной полимеразной цепной реакцией». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (24): 9436–40. Бибкод : 1988PNAS...85.9436I. дои : 10.1073/pnas.85.24.9436 . ПМК 282767 . ПМИД  3200828. 
50. Пирс К.Е., Ван LJ (2007). «Линейная послеэкспоненциальная полимеразная цепная реакция и родственные технологии». Одноклеточная диагностика . Методы молекулярной медицины. Том. 132. С. 65–85. дои : 10.1007/978-1-59745-298-4_7. ISBN 978-1-58829-578-1. ПМИД  17876077.
51. Кришнан М. , Угаз В.М., Бернс М.А. (октябрь 2002 г.). «ПЦР в конвекционной ячейке Рэлея-Бенара». Наука . 298 (5594): 793. doi :10.1126/science.298.5594.793. ПМИД  12399582.
52. Прие А, Хасан Я., Угаз В.М. (ноябрь 2013 г.). «Микромасштабная хаотическая адвекция обеспечивает надежную конвективную репликацию ДНК». Аналитическая химия . 85 (21): 10536–41. дои : 10.1021/ac402611s. ПМИД  24083802.
53. Шварц Дж. Дж., Ли С., Шендюр Дж. (сентябрь 2012 г.). «Точный синтез генов с помощью меток-направленного поиска молекул ДНК с проверенной последовательностью». Природные методы . 9 (9): 913–15. дои : 10.1038/nmeth.2137. ПМЦ 3433648 . ПМИД  22886093. 
54. Винсент М., Сюй Ю, Конг Х (август 2004 г.). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК». Отчеты ЭМБО . 5 (8): 795–800. дои : 10.1038/sj.embor.7400200. ПМЦ 1249482 . ПМИД  15247927. 
55. Чоу К., Рассел М., Берч Д.Э., Раймонд Дж., Блох В. (апрель 1992 г.). «Предотвращение неправильного прайминга перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификацию с низким числом копий». Исследования нуклеиновых кислот . 20 (7): 1717–23. дои : 10.1093/нар/20.7.1717. ПМК 312262 . ПМИД  1579465. 
56. Келлог Д.Э., Рыбалкин И., Чен С., Мухамедова Н., Власик Т., Зиберт П.Д., Ченчик А. (июнь 1994 г.). «Антитела TaqStart: ПЦР с «горячим стартом», облегченная нейтрализующим моноклональным антителом, направленным против ДНК-полимеразы Taq». БиоТехники . 16 (6): 1134–37. ПМИД  8074881.
57. Сан-Мильян РМ, Мартинес-Баллестерос I, Рементерия А, Гарайсар Дж, Биканди Дж (декабрь 2013 г.). «Онлайн-упражнение по разработке и моделированию экспериментов ПЦР и ПЦР-ПДРФ». Исследовательские заметки BMC . 6 : 513. дои : 10.1186/1756-0500-6-513 . ПМК 4029544 . ПМИД  24314313. 
58. Зиткевич Э, Рафальски А, Лабуда Д (март 1994 г.). «Отпечатки пальцев генома путем амплификации полимеразной цепной реакции, заякоренной в простых повторах последовательностей (SSR)». Геномика . 20 (2): 176–83. дои : 10.1006/geno.1994.1151. PMID  8020964. S2CID  41802285.
59. Охман Х., Гербер А.С., Хартл Д.Л. (ноябрь 1988 г.). «Генетическое применение обратной полимеразной цепной реакции». Генетика . 120 (3): 621–23. дои : 10.1093/генетика/120.3.621. ПМЦ 1203539 . ПМИД  2852134. 
60. Мюллер PR, Уолд Б. (ноябрь 1989 г.). «Отпечаток специфического для мышц усилителя in vivo с помощью ПЦР, опосредованной лигированием». Наука . 246 (4931): 780–86. Бибкод : 1989Sci...246..780M. дои : 10.1126/science.2814500. ПМИД  2814500.
61. Герман Дж.Г. , Графф Дж.Р., Мёханен С., Нелькин Б.Д., Байлин С.Б. (сентябрь 1996 г.). «ПЦР, специфичная для метилирования: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (18): 9821–26. Бибкод : 1996PNAS...93.9821H. дои : 10.1073/pnas.93.18.9821 . ПМЦ 38513 . ПМИД  8790415. 
62. Айзенбаргер Т.А., Финни М., Риос-Веласкес С., Хандельсман Дж., Рувкун Г. (февраль 2008 г.). «Минипраймер ПЦР, новая линза для наблюдения за миром микробов». Прикладная и экологическая микробиология . 74 (3): 840–49. Бибкод : 2008ApEnM..74..840I. дои :10.1128/АЕМ.01933-07. ПМК 2227730 . ПМИД  18083877. 
63. Шен С., Ян В., Цзи Ц, Маки Х., Донг А., Чжан Цз. (ноябрь 2009 г.). «НаноПЦР-наблюдение: различные уровни точности репликации ДНК в полимеразных цепных реакциях, усиленных наночастицами». Нанотехнологии . 20 (45): 455103. Бибкод : 2009Nanot..20S5103S. дои : 10.1088/0957-4484/20/45/455103. PMID  19822925. S2CID  3393115.
64. Шен, Сенчао (2013). «Обзор технологии полимеразной цепной реакции с использованием наночастиц». Био-Нанотехнологии . США: Wiley-Blackwell Publishing Ltd., стр. 97–106. дои : 10.1002/9781118451915.ch5. ISBN 978-1-118-45191-5.
65. Хортон Р.М., Хант Х.Д., Хо С.Н., Пуллен Дж.К., Пиз Л.Р. (апрель 1989 г.). «Инженерия гибридных генов без использования ферментов рестрикции: сплайсинг генов путем расширения перекрытия». Джин . 77 (1): 61–68. дои : 10.1016/0378-1119(89)90359-4. ПМИД  2744488.
66. Моллер, Саймон (2006). ПЦР: основы . США: Группа Тейлор и Фрэнсис. п. 144. ИСБН 978-0-415-35547-6.
67. Дэвид Ф., Терлотт Э (ноябрь 1998 г.). «[Метод изотермической амплификации генов]» [Метод изотермической амплификации]. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, Série III . 321 (11): 909–14. Бибкод : 1998CRASG.321..909D. дои : 10.1016/S0764-4469(99)80005-5. ПМИД  9879470.
68. Фабрис Давид (сентябрь – октябрь 2002 г.). «Использование топологических топологий ВОПОГ: новое оружие против патогенных агентов» (PDF) . Слияние. Архивировано из оригинала (PDF) 28 ноября 2007 года.(На французском)
69. Ян, Джой Ю.; Брукс, Шелис; Мейер, Дженнифер А.; Блейксли, Роберт Р.; Желязны, Адриан М.; Сегре, Джулия А.; Сниткин, Эван С. (2013). «Пан-ПЦР, вычислительный метод для разработки анализов типирования бактерий на основе данных полногеномной последовательности». Журнал клинической микробиологии . 51 (3): 752–758. дои : 10.1128/jcm.02671-12 . ПМК 3592046 . ПМИД  23254127. 
70. Добоси-младший, Роуз С.Д., Бельц К.Р., Рупп С.М., Пауэрс К.М., Белке М.А., Уолдер Дж.А. (август 2011 г.). «РНКаза H-зависимая ПЦР (рчПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием блокированных расщепляемых праймеров». БМК Биотехнология . 11:80 . дои : 10.1186/1472-6750-11-80 . ПМЦ 3224242 . ПМИД  21831278. 
71. Шьямала, В.; Ферро-Луцци, Эймс Г. (1993). «Полимеразная цепная реакция с одним специфическим праймером (SSP-PCR) и прогулка по геному». Протоколы ПЦР . Методы молекулярной биологии. Том. 15. С. 339–48. дои : 10.1385/0-89603-244-2:339. ISBN 978-0-89603-244-6. ПМИД  21400290.
72. Бинг Д.Х., Болес С., Рехман Ф.Н., Оде М., Белмарш М., Келли Б., Адамс С.П. (1996). «Мостовая амплификация: система твердофазной ПЦР для амплификации и обнаружения аллельных различий в одиночных копиях генов». Материалы конференции по генетической идентичности, Седьмой международный симпозиум по идентификации человека . Архивировано из оригинала 7 мая 2001 года.
73. Хан З., Поэттер К., Park DJ (апрель 2008 г.). «Усиленная твердофазная ПЦР: механизмы увеличения прайминга с помощью праймеров на твердой опоре». Аналитическая биохимия . 375 (2): 391–93. дои : 10.1016/j.ab.2008.01.021. ПМИД  18267099.
74. Рауль Д., Абудхарам Г., Крубези Э., Ларруи Г., Людес Б., Дранкур М. (ноябрь 2000 г.). «Молекулярная идентификация с помощью «самоубийственной ПЦР» Yersinia pestis как возбудителя средневековой черной смерти». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 97 (23): 12800–03. Бибкод : 2000PNAS...9712800R. дои : 10.1073/pnas.220225197 . ЧВК 18844 . ПМИД  11058154. 
75. Лю Ю.Г., Уиттиер РФ (февраль 1995 г.). «Термальная асимметричная чересстрочная ПЦР: автоматическая амплификация и секвенирование концевых фрагментов вставки из клонов P1 и YAC для ходьбы по хромосоме». Геномика . 25 (3): 674–81. дои : 10.1016/0888-7543(95)80010-J. ПМИД  7759102.
76. Дон Р.Х., Кокс П.Т., Уэйнрайт Б.Дж., Бейкер К., Мэттик Дж.С. (июль 1991 г.). «ПЦР« Touchdown »для предотвращения ложного прайминга во время амплификации гена». Исследования нуклеиновых кислот . 19 (14): 4008. doi :10.1093/nar/19.14.4008. ПМК 328507 . ПМИД  1861999. 
77. Мирик К.В., Гелбарт В.М. (февраль 2002 г.). «Универсальная быстрая ходьба для прямого и универсального определения последовательности обхода». Джин . 284 (1–2): 125–31. дои : 10.1016/S0378-1119(02)00384-0. ПМИД  11891053.
78. «Полный текст - LaNe RAGE: новый инструмент для определения фланкирующих последовательностей геномной ДНК» . www.ejbiotechnology.info .
79. Парк DJ (январь 2005 г.). «Новый 5'-концевой экзон мышиной GAPDH, идентифицированный с помощью 5'RACE LaNe». Молекулярная биотехнология . 29 (1): 39–46. дои : 10.1385/МБ: 29:1:39. PMID  15668518. S2CID  45702164.
80. Парк DJ (апрель 2004 г.). «3' RACE LaNe: простой и быстрый метод полностью гнездовой ПЦР для определения 3'-концевой последовательности кДНК». БиоТехники . 36 (4): 586–88, 590. doi : 10.2144/04364BM04 . ПМИД  15088375.
81. «Ключевой ингредиент тестов на коронавирус добывается из озер Йеллоустона» . Наука . 31 марта 2020 года. Архивировано из оригинала 31 марта 2020 года . Проверено 13 мая 2020 г.
82. Клеппе К, Оцука Э, Клеппе Р, Молино I, Корана Х.Г. (март 1971 г.). «Исследования полинуклеотидов. XCVI. Репарация коротких синтетических ДНК, катализируемая ДНК-полимеразами». Журнал молекулярной биологии . 56 (2): 341–61. дои : 10.1016/0022-2836(71)90469-4. ПМИД  4927950.
83. Рабинов, Пол (1996). Создание ПЦР: история биотехнологии . Чикаго: Издательство Чикагского университета. ISBN 978-0-226-70146-2.
84. Муллис, Кэри (1998). Танцуем обнаженной в поле разума . Нью-Йорк: Книги Пантеона. ISBN 978-0-679-44255-4.
85. Муллис КБ (апрель 1990 г.). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Научный американец . 262 (4): 56–61, 64–65. Бибкод : 1990SciAm.262d..56M. doi : 10.1038/scientificamerican0490-56. ПМИД  2315679.
86. Патидар М., Агравал С., Парвин Ф., Харе П. (2015). «Молекулярные данные о слюне в разрешении спора об отцовстве». Журнал судебно-стоматологической науки . 7 (1): 76–79. дои : 10.4103/0975-1475.150325 . ПМК 4330625 . ПМИД  25709326. 
87. Николс Д., Баркер Э. (2016). «Психоделики». Фармакологические обзоры . 68 (2): 264–355. дои :10.1124/пр.115.011478. ПМЦ 4813425 . ПМИД  26841800. 
88. «Нобелевская премия по химии 1993 г.». NobelPrize.org .
89. «Цитаты лауреатов премии Chemical Breakthrough Awards 2017» . Отдел истории химии . Проверено 12 марта 2018 г.
90. «Недавно добавлено».
91. Фор, Дж. Младший; Вичерс, ИК; Кук-Диган, Р. (3 июля 2006 г.). «Влияние деловой практики, лицензирования и интеллектуальной собственности на разработку и распространение полимеразной цепной реакции: практический пример». Журнал биомедицинских открытий и сотрудничества . 1 :7. дои : 10.1186/1747-5333-1-7 . ПМЦ 1523369 . ПМИД  16817955. 
92. «Советы о том, как выжить в войнах Так» . GEN Новости генной инженерии – Канал биобизнеса . 26 (9). 1 мая 2006 г.

Внешние ссылки

• Патент США на ПЦР
• Что такое эффект плато ПЦР? обучающее видео на ютубе
• История полимеразной цепной реакции из архивов Смитсоновского института.