Репарация оснований эксцизией ( BER ) — это клеточный механизм, изучаемый в области биохимии и генетики , который восстанавливает поврежденную ДНК на протяжении всего клеточного цикла. Он отвечает в первую очередь за удаление небольших, не искажающих спираль повреждений оснований из генома. Связанный с этим путь репарации нуклеотидов эксцизией восстанавливает объемные искажающие спираль повреждения. BER важен для удаления поврежденных оснований, которые в противном случае могли бы вызвать мутации из-за неправильного спаривания или привести к разрывам ДНК во время репликации. BER инициируется ДНК-гликозилазами , которые распознают и удаляют определенные поврежденные или неподходящие основания, образуя сайты AP . Затем они расщепляются эндонуклеазой AP . Полученный одноцепочечный разрыв затем может быть обработан либо коротким патчем (где заменяется один нуклеотид), либо длинным патчем BER (где синтезируется 2–10 новых нуклеотидов). [1]
Отдельные основания в ДНК могут быть химически повреждены различными механизмами, наиболее распространенными из которых являются дезаминирование, окисление и алкилирование. Эти модификации могут повлиять на способность основания образовывать водородные связи, что приведет к неправильному спариванию оснований и, как следствие, к мутациям в ДНК. Например, включение аденина напротив 8 -оксогуанина (справа) во время репликации ДНК приводит к мутации пары оснований G:C в T:A. Другие примеры повреждений оснований, исправленных BER, включают:
Помимо повреждений оснований, последующие этапы BER также используются для восстановления одноцепочечных разрывов.
В настоящее время изучается выбор между репарацией с короткими и длинными заплатками. Считается, что на это решение влияют различные факторы, включая тип повреждения, стадию клеточного цикла и то, является ли клетка терминально дифференцированной или активно делящейся. [3] Некоторые повреждения, такие как окисленные или восстановленные сайты AP, устойчивы к активности pol β-лиазы и, следовательно, должны обрабатываться с помощью BER с длинными заплатками.
Предпочтение пути может также различаться у разных организмов. В то время как человеческие клетки используют как короткие, так и длинные BER, долгое время считалось, что у дрожжей Saccharomyces cerevisiae отсутствует путь коротких заплаток, поскольку у них нет гомологов нескольких белков коротких заплаток млекопитающих, включая pol β, ДНК-лигазу III, XRCC1 и домен киназы PNKP . Недавнее открытие того, что поли-A-полимераза Trf4 обладает 5'-dRP-лиазной активностью, поставило под сомнение эту точку зрения. [4]
ДНК-гликозилазы отвечают за первоначальное распознавание повреждения. Они выворачивают поврежденное основание из двойной спирали, как показано на рисунке, и расщепляют N-гликозидную связь поврежденного основания, оставляя сайт AP . Существует две категории гликозилаз: монофункциональные и бифункциональные. Монофункциональные гликозилазы обладают только гликозилазной активностью, тогда как бифункциональные гликозилазы также обладают AP-лиазной активностью. Поэтому бифункциональные гликозилазы могут преобразовывать повреждение основания в одноцепочечный разрыв без необходимости в AP-эндонуклеазе . β-Элиминирование сайта AP гликозилазой-лиазой дает 3' α,β-ненасыщенный альдегид, смежный с 5' фосфатом, который отличается от продукта расщепления AP-эндонуклеазой. [5] Некоторые гликозилазы-лиазы могут далее выполнять δ-элиминирование, которое преобразует 3' альдегид в 3' фосфат. Большое разнообразие гликозилаз эволюционировало для распознавания различных поврежденных оснований. Примерами ДНК-гликозилаз являются Ogg1 , который распознает 8-оксогуанин, MPG , который распознает 3-метиладенин, и UNG , который удаляет урацил из ДНК.
Эндонуклеазы AP расщепляют сайт AP , образуя 3'-гидроксил, смежный с 5'-дезоксирибозофосфатом (dRP). Эндонуклеазы AP делятся на два семейства на основе их гомологии с предковыми бактериальными эндонуклеазами AP: эндонуклеазой IV и экзонуклеазой III . [6] Многие эукариоты имеют членов обоих семейств, включая дрожжи Saccharomyces cerevisiae , в которых Apn1 является гомологом EndoIV, а Apn2 связан с ExoIII. У людей были идентифицированы две эндонуклеазы AP: APE1 и APE2. [7] Она является членом семейства ExoIII.
Для того чтобы произошло лигирование, разрыв цепи ДНК должен иметь гидроксил на 3'-конце и фосфат на 5'-конце . У людей полинуклеотидкиназа-фосфатаза ( PNKP ) способствует образованию этих концов во время BER. Этот белок имеет домен киназы, который фосфорилирует 5'-гидроксильные концы, и домен фосфатазы, который удаляет фосфаты с 3'-концов. Вместе эти активности подготавливают одноцепочечные разрывы с поврежденными концами к лигированию. Эндонуклеазы AP также участвуют в обработке 3'-конца. Помимо открытия участков AP, они обладают 3'-фосфодиэстеразной активностью и могут удалять различные 3'-повреждения, включая фосфаты, фосфогликоляты и альдегиды. 3'-обработка должна произойти до того, как синтез ДНК может начаться, поскольку ДНК-полимеразы требуют 3'-гидроксила для удлинения.
Pol β является основной полимеразой человека, которая катализирует BER с короткими заплатками, а pol λ способна компенсировать ее отсутствие. [8] Эти полимеразы являются членами семейства Pol X и обычно вставляют только один нуклеотид. В дополнение к полимеразной активности эти ферменты имеют лиазный домен, который удаляет 5' dRP, оставленный после расщепления эндонуклеазой AP. Считается, что во время BER с длинными заплатками синтез ДНК опосредуется pol δ и pol ε вместе с фактором процессивности PCNA , теми же полимеразами, которые осуществляют репликацию ДНК . Эти полимеразы выполняют вытесняющий синтез, что означает, что нисходящий 5' конец ДНК «смещается», образуя лоскут (см. схему выше). Pol β также может выполнять вытесняющий синтез с длинными заплатками и, следовательно, может участвовать в любом пути BER. [9] Синтез с длинными заплатками обычно вставляет 2-10 новых нуклеотидов.
FEN1 удаляет 5'-лоскут, образующийся во время длинной заплатки BER. Эта эндонуклеаза проявляет сильное предпочтение к длинной 5'-лоскутке, прилегающей к 1-нуклеотидной 3'-лоскутке. [10] Дрожжевой гомолог FEN1 — RAD27 . В дополнение к своей роли в длинной заплатке BER, FEN1 расщепляет лоскуты с похожей структурой во время обработки фрагмента Оказаки , важного шага в репликации отстающей цепи ДНК .
ДНК-лигаза III вместе со своим кофактором XRCC1 катализирует этап запечатывания разрыва в короткозаплаточном BER у людей. [11] [12] ДНК-лигаза I лигирует разрыв в длиннозаплаточном BER. [13]
Дефекты в различных путях репарации ДНК приводят к предрасположенности к раку, и BER, по-видимому, следует этой схеме. Было показано, что делеционные мутации в генах BER приводят к более высокой частоте мутаций у различных организмов, что подразумевает, что потеря BER может способствовать развитию рака. Действительно, соматические мутации в Pol β были обнаружены в 30% случаев рака у человека, и некоторые из этих мутаций приводят к трансформации при экспрессии в клетках мышей. [14] Мутации в ДНК-гликозилазе MYH также, как известно, увеличивают восприимчивость к раку толстой кишки . [15]
Эпигенетические изменения (эпимутации) в генах эксцизионной репарации оснований только недавно начали оцениваться при некоторых видах рака по сравнению с многочисленными предыдущими исследованиями эпимутаций в генах, действующих в других путях репарации ДНК (таких как MLH1 при репарации несоответствий и MGMT при прямом обращении). [ необходима цитата ] Ниже приведены некоторые примеры эпимутаций в генах эксцизионной репарации оснований, которые встречаются при раке.
MBD4 (белок 4 домена связывания метил-CpG) — это гликозилаза, используемая на начальном этапе репарации эксцизионных оснований. Белок MBD4 связывается преимущественно с полностью метилированными сайтами CpG и с измененными основаниями ДНК на этих сайтах. Эти измененные основания возникают из-за частого гидролиза цитозина в урацил (см. изображение) и гидролиза 5-метилцитозина в тимин, в результате чего образуются пары оснований G:U и G:T. [16] Если неправильные урацилы или тимины в этих парах оснований не удаляются до репликации ДНК, они вызывают мутации перехода . MBD4 специфически катализирует удаление T и U в паре с гуанином (G) в сайтах CpG. [17] Это важная функция восстановления, поскольку около 1/3 всех внутригенных мутаций одиночных пар оснований при раке человека происходят в динуклеотидах CpG и являются результатом переходов G:C в A:T. [17] [18] Эти переходы включают в себя наиболее частые мутации при раке человека. Например, около 50% соматических мутаций гена-супрессора опухолей p53 при колоректальном раке представляют собой переходы G:C в A:T в пределах участков CpG. [17] Таким образом, снижение экспрессии MBD4 может привести к увеличению канцерогенных мутаций.
Экспрессия MBD4 снижена почти во всех колоректальных новообразованиях из-за метилирования промоторной области MBD4. [19] Также дефицит MBD4 наблюдается из-за мутации примерно в 4% случаев колоректального рака. [ 20]
Большинство гистологически нормальных полей, окружающих неопластические новообразования (аденомы и рак толстой кишки) в толстой кишке, также показывают сниженную экспрессию мРНК MBD4 ( дефект поля ) по сравнению с гистологически нормальной тканью людей, у которых никогда не было новообразований толстой кишки. [19] Это открытие предполагает, что эпигенетическое подавление MBD4 является ранним этапом колоректального канцерогенеза .
В китайской популяции, которая была оценена, полиморфизм MBD4 Glu346Lys был связан с примерно 50% снижением риска рака шейки матки, что позволяет предположить, что изменения в MBD4 могут быть важны при раке. [21]
NEIL1 распознает (нацеливается) и удаляет определенные окислительно -поврежденные основания, а затем разрезает абазический сайт посредством β, δ-элиминации, оставляя 3′ и 5′ фосфатные концы. NEIL1 распознает окисленные пиримидины , формамидопиримидины, остатки тимина, окисленные по метильной группе, и оба стереоизомера тимингликоля . [22] Лучшими субстратами для человеческого NEIL1, по-видимому, являются повреждения гидантоина , гуанидиногидантоин и спироиминодигидантоин, которые являются дальнейшими продуктами окисления 8-oxoG . NEIL1 также способен удалять повреждения из одноцепочечной ДНК, а также из пузырьковых и разветвленных структур ДНК. Дефицит NEIL1 вызывает повышенный мутагенез в сайте пары 8-oxo-Gua:C, при этом большинство мутаций представляют собой трансверсии G:C в T:A. [23]
Исследование, проведенное в 2004 году, показало, что 46% первичных раков желудка имели сниженную экспрессию мРНК NEIL1 , хотя механизм снижения не был известен. [24] Это исследование также показало, что 4% раков желудка имели мутации в NEIL1. Авторы предположили, что низкая активность NEIL1, возникающая из-за сниженной экспрессии и/или мутации в NEIL1, часто участвует в канцерогенезе желудка.
Скрининг 145 генов репарации ДНК на предмет аберрантного метилирования промотора был проведен на тканях плоскоклеточного рака головы и шеи (HNSCC) у 20 пациентов и на образцах слизистой оболочки головы и шеи у 5 неонкологических пациентов. [25] Этот скрининг показал, что NEIL1 с существенно повышенным гиперметилированием имел наиболее существенно отличающуюся частоту метилирования. Кроме того, гиперметилирование соответствовало снижению экспрессии мРНК NEIL1. Дальнейшая работа со 135 опухолевыми и 38 нормальными тканями также показала, что 71% образцов тканей HNSCC имели повышенное метилирование промотора NEIL1. [25]
Когда 8 генов репарации ДНК были оценены в опухолях немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), 42% были гиперметилированы в области промотора NEIL1. [26] Это была самая частая аномалия репарации ДНК, обнаруженная среди 8 протестированных генов репарации ДНК. NEIL1 также был одним из шести генов репарации ДНК, которые были обнаружены гиперметилированными в своих областях промотора при колоректальном раке . [27]
Активное метилирование и деметилирование ДНК необходимо для когнитивного процесса формирования и поддержания памяти . [29] У крыс контекстное условное рефлексообразование может запустить пожизненную память о событии с помощью одной попытки, а изменения метилирования, по-видимому, коррелируют с запуском особенно долгоживущих воспоминаний. [29] При контекстном условном рефлексообразовании страха через 24 часа ДНК, выделенная из области гиппокампа мозга крысы, имела 2097 дифференциально метилированных генов, часть из которых была деметилирована. [29] Как было рассмотрено Байрактаром и Крейтцем, [28] деметилирование ДНК зависит от репарации эксцизионных оснований (см. рисунок).
Физические упражнения оказывают хорошо известные полезные эффекты на обучение и память (см. Нейробиологические эффекты физических упражнений ). BDNF является особенно важным регулятором обучения и памяти. [30] Как было рассмотрено Фернандесом и др., [31] у крыс, упражнения усиливают экспрессию гена Bdnf в гиппокампе , который играет важную роль в формировании памяти. Усиление экспрессии Bdnf происходит посредством деметилирования его промотора CpG-острова в экзоне IV [31] , а деметилирование зависит от репарации эксцизии оснований (см. рисунок). [28]
Активность ДНК-гликозилазы , которая удаляет метилированные основания в лейкоцитах человека, снижается с возрастом. [32] Снижение удаления метилированных оснований из ДНК предполагает возрастное снижение активности 3-метиладенин-ДНК-гликозилазы , фермента BER, ответственного за удаление алкилированных оснований. [32]
Молодые крысы (в возрасте от 4 до 5 месяцев), но не старые крысы (в возрасте от 24 до 28 месяцев), обладают способностью индуцировать ДНК-полимеразу бета и эндонуклеазу AP в ответ на окислительное повреждение. [33]