Ферментные анализы — это лабораторные методы измерения ферментативной активности. Они имеют жизненно важное значение для изучения кинетики ферментов и ингибирования ферментов .
Количество или концентрация фермента может быть выражена в молярных количествах, как и для любого другого химического вещества, или в единицах активности фермента .
Активность фермента является мерой количества присутствующего активного фермента и, таким образом, зависит от различных физических условий, которые следует указать .
Он рассчитывается по следующей формуле:
где
Единицей СИ является катал , 1 катал = 1 моль с −1 (моль в секунду), но это слишком большая единица. Более практичное и часто используемое значение — ферментная единица (U) = 1 мкмоль мин −1 (микромоль в минуту). 1 U соответствует 16,67 нанокатала . [1]
Активность фермента, указанная в катале, обычно относится к активности предполагаемого естественного целевого субстрата фермента. Активность фермента также может быть указана как активность некоторых стандартизированных субстратов, таких как желатин , затем измеренная в единицах переваривания желатина (GDU), или молочных белков, затем измеренная в единицах свертывания молока (MCU). Единицы GDU и MCU основаны на том, как быстро один грамм фермента будет переваривать желатин или молочные белки соответственно. 1 GDU приблизительно равен 1,5 MCU. [2]
Увеличение количества субстрата увеличит скорость реакции с ферментами, однако после достижения определенного уровня скорость реакции стабилизируется, поскольку количество доступных активных центров останется постоянным.
Удельная активность фермента — еще одна распространенная единица. Это активность фермента на миллиграмм общего белка (выраженная в мкмоль мин −1 мг −1 ). Удельная активность дает меру чистоты фермента в смеси. Это микромоли продукта, образованного ферментом за определенное время (минуты) при определенных условиях на миллиграмм общего белка. Удельная активность равна скорости реакции, умноженной на объем реакции, деленной на массу общего белка. Единица СИ — катал/кг, но более практичная единица — мкмоль/(мг*мин).
Удельная активность является мерой ферментативной процессивности (способности фермента к переработке) при определенной (обычно насыщающей) концентрации субстрата и обычно постоянна для чистого фермента.
Процесс титрования активного центра может быть выполнен для устранения ошибок, возникающих из-за различий в партиях культивирования и/или неправильно свернутого фермента и подобных проблем. Это мера количества активного фермента, вычисляемая, например, путем титрования количества присутствующих активных центров с использованием необратимого ингибитора. Удельная активность затем должна быть выражена как мкмоль мин −1 мг −1 активного фермента. Если молекулярная масса фермента известна, число оборотов , или мкмоль продукта в секунду на мкмоль активного фермента, может быть рассчитано из удельной активности. Число оборотов можно визуализировать как количество раз, которое каждая молекула фермента выполняет свой каталитический цикл в секунду.
Скорость реакции — это концентрация исчезающего субстрата (или образующегося продукта) за единицу времени (моль л −1 с −1 ).
Процент чистоты равен 100% × (удельная активность образца фермента / удельная активность чистого фермента). Неочищенный образец имеет более низкую удельную активность, поскольку часть массы на самом деле не является ферментом. Если известна удельная активность 100% чистого фермента, то нечистый образец будет иметь более низкую удельную активность, что позволяет рассчитать чистоту и получить ясный результат.
Все ферментные анализы измеряют либо потребление субстрата, либо производство продукта с течением времени. Существует большое количество различных методов измерения концентраций субстратов и продуктов, и многие ферменты можно анализировать несколькими различными способами. Биохимики обычно изучают ферментно-катализируемые реакции, используя четыре типа экспериментов: [3]
Анализы ферментов можно разделить на две группы в зависимости от метода отбора проб: непрерывные анализы , при которых анализ дает непрерывные показания активности, и прерывистые анализы , при которых отбираются образцы, реакция останавливается, а затем определяется концентрация субстратов/продуктов.
Непрерывные анализы наиболее удобны, так как один анализ дает скорость реакции без необходимости в дальнейшей работе. Существует много различных типов непрерывных анализов.
В спектрофотометрических анализах вы отслеживаете ход реакции, измеряя изменение в том, сколько света поглощает анализируемый раствор. Если этот свет находится в видимой области, вы можете фактически увидеть изменение цвета анализа, и это называется колориметрическими анализами . Анализ MTT , окислительно-восстановительный анализ с использованием тетразолиевого красителя в качестве субстрата, является примером колориметрического анализа.
Часто используется ультрафиолетовый свет, поскольку общие коферменты НАДН и НАДФН поглощают ультрафиолетовый свет в своих восстановленных формах, но не в своих окисленных формах. Поэтому оксидоредуктазу , использующую НАДН в качестве субстрата, можно исследовать, отслеживая уменьшение поглощения ультрафиолета на длине волны 340 нм по мере потребления кофермента. [4]
Прямые и сопряженные анализы
Даже когда реакция фермента не приводит к изменению поглощения света, все равно можно использовать спектрофотометрический анализ для фермента, используя сопряженный анализ . Здесь продукт одной реакции используется в качестве субстрата другой, легко обнаруживаемой реакции. Например, на рисунке 1 показан сопряженный анализ для фермента гексокиназы , который можно проанализировать, связав его продукцию глюкозо-6-фосфата с продукцией НАДФН, используя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу .
Флуоресценция — это когда молекула испускает свет одной длины волны после поглощения света другой длины волны. Флуориметрические анализы используют разницу во флуоресценции субстрата и продукта для измерения ферментативной реакции. Эти анализы в целом гораздо более чувствительны, чем спектрофотометрические анализы, но могут страдать от помех, вызванных примесями и нестабильностью многих флуоресцентных соединений при воздействии света.
Примером таких анализов снова является использование нуклеотидных коферментов НАДН и НАДФН. Здесь восстановленные формы флуоресцентны, а окисленные формы нефлуоресцентны. Поэтому реакции окисления могут сопровождаться уменьшением флуоресценции, а реакции восстановления — увеличением. [5] Также доступны синтетические субстраты, которые высвобождают флуоресцентный краситель в реакции, катализируемой ферментом, такие как 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид для анализа β-галактозидазы или 4-метилумбеллиферил-бутират для анализа липазы Candida rugosa . [6]
Калориметрия — это измерение тепла, выделяемого или поглощаемого химическими реакциями. Эти анализы очень общие, поскольку многие реакции подразумевают некоторое изменение тепла, и при использовании микрокалориметра не требуется много фермента или субстрата. Эти анализы можно использовать для измерения реакций, которые невозможно проанализировать каким-либо другим способом. [7]
Хемилюминесценция — это испускание света в результате химической реакции. Некоторые ферментативные реакции производят свет, и его можно измерить, чтобы обнаружить образование продукта. Эти типы анализов могут быть чрезвычайно чувствительными, поскольку произведенный свет может быть зафиксирован фотопленкой в течение нескольких дней или недель, но его может быть трудно количественно оценить, поскольку не весь свет, испускаемый реакцией, будет обнаружен.
Обнаружение пероксидазы хрена методом ферментативной хемилюминесценции (ECL) является распространенным методом обнаружения антител в вестерн-блоттинге . Другим примером является фермент люцифераза , который обнаружен у светлячков и естественным образом производит свет из своего субстрата люциферина.
Статическое рассеяние света измеряет произведение усредненной по весу молярной массы и концентрации макромолекул в растворе. При фиксированной общей концентрации одного или нескольких видов за время измерения сигнал рассеяния является прямой мерой усредненной по весу молярной массы раствора, которая будет меняться по мере образования или диссоциации комплексов. Следовательно, измерение количественно определяет стехиометрию комплексов, а также кинетику. Анализы кинетики белков методом рассеяния света являются очень общей методикой, не требующей фермента.
Микромасштабный термофорез (MST) [8] измеряет размер, заряд и энтропию гидратации молекул/субстратов в равновесии. [9] Термофоретическое движение флуоресцентно меченого субстрата значительно изменяется, поскольку он модифицируется ферментом. Эту ферментативную активность можно измерить с высоким временным разрешением в реальном времени. [10] Расход материала полностью оптического метода MST очень низок, для измерения констант скорости ферментативной активности и ингибирования требуется всего 5 мкл объема образца и 10 нМ концентрации фермента. MST позволяет аналитикам измерять модификацию двух разных субстратов одновременно ( мультиплексирование ), если оба субстрата помечены разными флуорофорами. Таким образом, можно проводить эксперименты по конкуренции субстратов.
Прерывистые анализы подразумевают отбор проб из ферментативной реакции через определенные интервалы времени и измерение в этих пробах количества произведенного продукта или потребления субстрата.
Радиометрические анализы измеряют включение радиоактивности в субстраты или ее высвобождение из субстратов. Наиболее часто используемые в этих анализах радиоактивные изотопы — 14 C, 32 P, 35 S и 125 I. Поскольку радиоактивные изотопы позволяют специфично маркировать один атом субстрата, эти анализы являются одновременно чрезвычайно чувствительными и специфичными. Они часто используются в биохимии и часто являются единственным способом измерения специфической реакции в сырых экстрактах (сложных смесях ферментов, которые производятся при лизисе клеток).
Радиоактивность в этих процедурах обычно измеряется с помощью сцинтилляционного счетчика .
Хроматографические анализы измеряют образование продукта путем разделения реакционной смеси на ее компоненты с помощью хроматографии . Обычно это делается с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), но также может использоваться более простая техника тонкослойной хроматографии . Хотя этот подход может потребовать много материала, его чувствительность можно повысить, пометив субстраты/продукты радиоактивной или флуоресцентной меткой. Чувствительность анализа также была повышена путем переключения протоколов на улучшенные хроматографические приборы (например, жидкостную хроматографию сверхвысокого давления), которые работают при давлении насоса в несколько раз выше, чем приборы ВЭЖХ (см. Высокоэффективная жидкостная хроматография#Давление насоса ). [11]
На результат анализа влияет ряд факторов, и в недавнем обзоре обобщены различные параметры, которые необходимо контролировать для поддержания эффективности анализа.
Большинство ферментов не переносят чрезвычайно высокие концентрации соли . Ионы мешают слабым ионным связям белков . Типичные ферменты активны при концентрации соли 1-500 мМ. Как обычно, есть исключения, такие как галофильные водоросли и галофильные бактерии .
Все ферменты работают в диапазоне температур, специфичном для организма. Повышение температуры обычно приводит к увеличению скорости реакции. Существует предел увеличения, поскольку более высокие температуры приводят к резкому снижению скорости реакции. Это происходит из-за денатурации (изменения) структуры белка в результате разрушения слабых ионных и водородных связей , которые стабилизируют трехмерную структуру активного центра фермента. [12] «Оптимальная» температура для человеческих ферментов обычно составляет от 35 до 40 °C. Средняя температура для человека составляет 37 °C. Человеческие ферменты начинают быстро денатурировать при температуре выше 40 °C. Ферменты из термофильных архей , обнаруженных в горячих источниках, стабильны до 100 °C. [13] Однако идея «оптимальной» скорости ферментативной реакции вводит в заблуждение, поскольку скорость, наблюдаемая при любой температуре, является произведением двух скоростей: скорости реакции и скорости денатурации. Если бы вы использовали анализ, измеряющий активность в течение одной секунды, он дал бы высокую активность при высоких температурах, однако, если бы вы использовали анализ, измеряющий образование продукта в течение часа, он дал бы вам низкую активность при этих температурах.
Большинство ферментов чувствительны к pH и имеют определенные диапазоны активности. Все они имеют оптимальный pH. pH может остановить активность фермента, денатурируя (изменяя) трехмерную форму фермента путем разрыва ионных и водородных связей . Большинство ферментов функционируют в диапазоне pH от 6 до 8; однако пепсин в желудке лучше всего работает при pH 2, а трипсин — при pH 8.
Увеличение концентрации субстрата увеличивает скорость реакции (активность фермента). Однако насыщение фермента ограничивает скорость реакции. Фермент насыщен, когда активные центры всех молекул заняты большую часть времени. В точке насыщения реакция не ускорится, независимо от того, сколько дополнительного субстрата будет добавлено. График скорости реакции выйдет на плато.
Большое количество макромолекул в растворе изменяет скорости и константы равновесия ферментативных реакций посредством эффекта, называемого макромолекулярным скоплением . [14]
Медиа, связанные с анализами ферментов на Wikimedia Commons
