Циркадные часы , или циркадный осциллятор , также известный как внутренний будильник человека, — это биохимический осциллятор , который циклически работает в стабильной фазе и синхронизирован с солнечным временем .
Период таких часов in vivo обязательно составляет почти ровно 24 часа (текущие солнечные сутки Земли ). У большинства живых организмов внутренне синхронизированные циркадные часы позволяют организму предвидеть ежедневные изменения окружающей среды, соответствующие циклу день-ночь, и соответствующим образом корректировать свою биологию и поведение.
Термин «циркадный» происходит от латинского circa (около) dies (день), поскольку, если исключить внешние сигналы (такие как окружающий свет), они не идут ровно 24 часа. Часы у людей в лаборатории при постоянном слабом освещении, например, будут в среднем показывать около 24,2 часов в день, а не ровно 24 часа. [1]
Нормальные биологические часы колеблются с эндогенным периодом ровно 24 часа, они увлекаются , когда получают достаточно ежедневных корректирующих сигналов из окружающей среды, в первую очередь дневного света и темноты. Циркадные часы являются центральными механизмами, которые управляют циркадными ритмами . Они состоят из трех основных компонентов:
Часы переустанавливаются, когда организм воспринимает внешние сигналы времени, из которых основным является свет. Циркадные осцилляторы повсеместно присутствуют в тканях организма, где они синхронизируются как эндогенными , так и внешними сигналами для регулирования транскрипционной активности в течение дня тканеспецифичным образом. [2] Циркадные часы переплетены с большинством клеточных метаболических процессов и на них влияет старение организма. [3] Основные молекулярные механизмы биологических часов были определены у позвоночных , Drosophila melanogaster , растений , грибов , бактерий , [4] [5] и, предположительно, также у архей . [6] [7] [8]
В 2017 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Джеффри С. Холлу , Майклу Росбашу и Майклу У. Янгу «за открытие молекулярных механизмов, контролирующих циркадный ритм» у плодовых мушек. [9]
У позвоночных главные циркадные часы содержатся в супрахиазматическом ядре (SCN), двустороннем нервном скоплении, состоящем примерно из 20 000 нейронов. [10] [11] Само SCN расположено в гипоталамусе , небольшой области мозга, расположенной непосредственно над зрительным перекрестом , где оно получает входные данные от специализированных светочувствительных ганглиозных клеток сетчатки через ретиногипоталамический тракт .
SCN поддерживает контроль над всем телом, синхронизируя «ведомые осцилляторы», которые демонстрируют собственные ритмы, близкие к 24-часовым, и контролируют циркадные явления в локальных тканях. [12] Через межклеточные сигнальные механизмы, такие как вазоактивный кишечный пептид , SCN подает сигналы другим ядрам гипоталамуса и шишковидной железе для модуляции температуры тела и выработки гормонов, таких как кортизол и мелатонин ; эти гормоны попадают в кровеносную систему и вызывают эффекты, управляемые часами, по всему организму.
Однако не ясно, какой именно сигнал (или сигналы) запускает основное взаимодействие со многими биохимическими часами, содержащимися в тканях по всему телу. Более подробную информацию см. в разделе «Регулирование циркадных осцилляторов» ниже.
Доказательства генетической основы циркадных ритмов у высших эукариот начались с открытия локуса period ( per ) у Drosophila melanogaster в ходе генетических скринингов, проведенных Роном Конопкой и Сеймуром Бензером в 1971 году. [13] Благодаря анализу per циркадных мутантов и дополнительных мутаций в генах часов Drosophila была предложена модель, охватывающая положительные и отрицательные ауторегуляторные петли обратной связи транскрипции и трансляции . Основные циркадные «часовые» гены определяются как гены, белковые продукты которых являются необходимыми компонентами для генерации и регуляции циркадных ритмов. Аналогичные модели были предложены для млекопитающих и других организмов. [14] [15]
Однако исследования цианобактерий изменили наш взгляд на механизм часов, поскольку Кондо и его коллеги обнаружили, что эти одноклеточные организмы могут поддерживать точный 24-часовой ход времени при отсутствии транскрипции, т. е. не требуется ауторегуляторная петля обратной связи транскрипции-трансляции для ритмов. [16] Более того, эти часы были реконструированы в пробирке (т. е. при отсутствии каких-либо клеточных компонентов), что доказывает, что точные 24-часовые часы могут быть сформированы без необходимости в генетических цепях обратной связи. [17] Однако этот механизм был применим только к цианобактериям, а не к общим.
В 2011 году большой прорыв в понимании произошел в лаборатории Редди в Кембриджском университете . Эта группа обнаружила циркадные ритмы в окислительно-восстановительных белках ( пероксиредоксинах ) в клетках, в которых отсутствовало ядро – человеческих эритроцитах. [18] В этих клетках не было транскрипции или генетических цепей, и, следовательно, не было петли обратной связи. Аналогичные наблюдения были сделаны в морской водоросли [19] и впоследствии в эритроцитах мыши. [20] Что еще более важно, окислительно-восстановительные колебания, продемонстрированные ритмами пероксиредоксина, теперь наблюдаются во многих отдаленных царствах жизни (эукариотах, бактериях и археях), охватывающих эволюционное древо. [6] [21] Таким образом, окислительно-восстановительные часы выглядят как дедушкины часы , а генетические цепи обратной связи – как основные выходные механизмы для управления физиологией и поведением клеток и тканей. [22] [23]
Таким образом, модель часов следует рассматривать как продукт взаимодействия как транскрипционных цепей, так и нетранскрипционных элементов, таких как окислительно-восстановительные колебания и циклы фосфорилирования белков. [24] [25]
Избирательное подавление генов известных компонентов человеческих циркадных часов демонстрирует, что для поддержания функции часов используются как активные компенсаторные механизмы, так и избыточность. [26] [27] [28] [29] Несколько генов часов млекопитающих были идентифицированы и охарактеризованы с помощью экспериментов на животных, несущих естественные, химически индуцированные и целенаправленные мутации, а также с помощью различных сравнительных геномных подходов. [26]
Большинство идентифицированных компонентов часов являются транскрипционными активаторами или репрессорами, которые модулируют стабильность белка и ядерную транслокацию и создают две взаимосвязанные петли обратной связи . [30] В первичной петле обратной связи члены основного семейства факторов транскрипции спираль-петля-спираль (bHLH)-PAS (Period-Arnt-Single-minded), CLOCK и BMAL1 , гетеродимеризуются в цитоплазме, образуя комплекс, который после транслокации в ядро инициирует транскрипцию целевых генов, таких как основные гены часов, гены «периода» ( PER1 , PER2 и PER3 ) и два гена криптохрома ( CRY1 и CRY2 ). Отрицательная обратная связь достигается гетеродимерами PER:CRY, которые транслоцируются обратно в ядро, чтобы подавить свою собственную транскрипцию путем ингибирования активности комплексов CLOCK:BMAL1. [5] Другая регуляторная петля индуцируется, когда гетеродимеры CLOCK:BMAL1 активируют транскрипцию Rev-ErbA и Rora, двух ядерных рецепторов-сирот, связанных с ретиноевой кислотой. REV-ERBa и RORa впоследствии конкурируют за связывание элемента ответа ретиноид-связанного рецептора-сироты | элементов ответа ретиноид-связанного рецептора-сироты (RORE), присутствующих в промоторе Bmal1. Благодаря последующему связыванию RORE, члены ROR и REV-ERB способны регулировать Bmal1 . В то время как ROR активируют транскрипцию Bmal1 , REV-ERB подавляют тот же процесс транскрипции. Следовательно, циркадное колебание Bmal1 регулируется как положительно, так и отрицательно ROR и REV-ERB. [30]
У D. melanogaster генный цикл (CYC) является ортологом BMAL1 у млекопитающих. Таким образом, димеры CLOCK–CYC активируют транскрипцию циркадных генов. Ген timeless (TIM) является ортологом для CRY млекопитающих как ингибитор; CRY у D. melanogaster функционирует как фоторецептор. У мух CLK–CYC связывается с промоторами генов, регулируемых циркадными ритмами, только во время транскрипции. Также существует стабилизирующая петля, где ген vrille (VRI) ингибирует, тогда как белок PAR-домена-1 (PDP1) активирует транскрипцию Clock. [31]
У нитчатого гриба N. crassa часовой механизм аналогичен, но не ортологичен механизму млекопитающих и мух. [32]
Циркадные часы растений имеют совершенно иные компоненты, чем у животных, грибов или бактерий. Растительные часы имеют концептуальное сходство с животными часами, поскольку они состоят из ряда взаимосвязанных транскрипционных петель обратной связи . Гены, участвующие в часах, показывают свою пиковую экспрессию в фиксированное время суток. Первыми генами, идентифицированными в растительных часах, были TOC1 , CCA1 и LHY . Пиковая экспрессия генов CCA1 и LHY происходит на рассвете, а пиковая экспрессия гена TOC1 происходит примерно в сумерках. Белки CCA1/LHY и TOC1 подавляют экспрессию генов друг друга. Результатом является то, что, когда уровни белка CCA1/LHY начинают снижаться после рассвета, он снимает репрессию с гена TOC1, позволяя экспрессии TOC1 и уровням белка TOC1 увеличиваться. По мере того, как уровни белка TOC1 увеличиваются, он еще больше подавляет экспрессию генов CCA1 и LHY. Противоположность этой последовательности происходит ночью, чтобы восстановить пиковую экспрессию генов CCA1 и LHY на рассвете. В часы встроено гораздо больше сложности, с множественными петлями, включающими гены PRR, вечерний комплекс и светочувствительные белки GIGANTIA и ZEITLUPE.
В бактериальных циркадных ритмах колебания фосфорилирования цианобактериального белка Kai C были воссозданы в бесклеточной системе ( часы in vitro ) путем инкубации KaiC с KaiA , KaiB и АТФ . [17]
Долгое время считалось, что циклы транскрипционной активации/репрессии, управляемые транскрипционными регуляторами, составляющими циркадные часы, являются основной движущей силой циркадной экспрессии генов у млекопитающих. Однако совсем недавно было сообщено, что только 22% генов циклов мРНК управляются транскрипцией de novo. [33] Позднее были описаны посттранскрипционные механизмы на уровне РНК, управляющие ритмической экспрессией белков, такие как динамика полиаденилирования мРНК. [34]
Фюстин [ кто? ] и его коллеги определили метилирование внутренних аденозинов (m 6 A) в мРНК (особенно самих часовых транскриптов) как ключевой регулятор циркадного периода. Ингибирование метилирования m 6 A посредством фармакологического ингибирования клеточных метилирований или, более конкретно, посредством подавления siRNA метилазы m 6 A Mettl3 привело к резкому удлинению циркадного периода. Напротив, сверхэкспрессия Mettl3 in vitro привела к более короткому периоду. Эти наблюдения ясно продемонстрировали важность посттранскрипционной регуляции циркадных часов на уровне РНК и одновременно установили физиологическую роль метилирования РНК (m 6 A). [35]
Авторегуляторные петли обратной связи в часах занимают около 24 часов, чтобы завершить цикл и составить циркадные молекулярные часы. Это поколение ~24-часовых молекулярных часов регулируется посттрансляционными модификациями, такими как фосфорилирование , сумоилирование , ацетилирование и метилирование гистонов и убиквитинирование . [31] Обратимое фосфорилирование регулирует важные процессы, такие как проникновение в ядро, образование белковых комплексов и деградация белков . Каждый из этих процессов вносит значительный вклад в поддержание периода в ~24 часа и придает точность циркадным часам, влияя на стабильность вышеупомянутых основных белков часов. Таким образом, в то время как транскрипционная регуляция генерирует ритмические уровни РНК, регулируемые посттрансляционные модификации контролируют обилие белков, субклеточную локализацию и репрессорную активность PER и CRY. [30]
Белки, ответственные за посттрансляционную модификацию генов часов, включают членов семейства казеинкиназ ( казеинкиназа 1 дельта (CSNK1D) и казеинкиназа 1 эпсилон (CSNK1E) и белок повторов F-box лейцина, богатый лейцином 3 (FBXL3). [31] У млекопитающих CSNK1E и CSNK1D являются критическими факторами, которые регулируют основной оборот циркадных белков. [30] Экспериментальные манипуляции с любым из этих белков приводят к драматическим эффектам на циркадные периоды, таким как изменение активности киназы и вызывают более короткие циркадные периоды, и дополнительно демонстрируют важность посттрансляционной регуляции в основном механизме циркадных часов. [30] Эти мутации стали представлять особый интерес для людей, поскольку они вовлечены в расстройство фазы сна . [31] Небольшая модифицирующая модификация белка BMAL1, связанная с убиквитином, также была предложена в качестве другого уровня посттрансляционной регуляции. [30]
Циркадные осцилляторы — это просто осцилляторы с периодом около 24 часов. В ответ на световой стимул организм взаимодействует с системой и сетью путей, которые работают вместе, чтобы определить биологический день и ночь. Регуляторные сети, участвующие в поддержании точного хода часов, охватывают ряд механизмов посттрансляционной регуляции. Циркадные осцилляторы могут регулироваться фосфорилированием , SUMOylation, убиквитинированием , а также ацетилированием и деацетилированием гистонов , ковалентной модификацией хвоста гистонов, которая контролирует уровень структур хроматина, заставляя ген экспрессироваться более легко. Метилирование структуры белка добавляет метильную группу и регулирует функцию белка или экспрессию гена, а при метилировании гистонов экспрессия гена либо подавляется, либо активируется путем изменения последовательности ДНК. Гистоны проходят через процесс ацетилирования, метилирования и фосфорилирования, но основные структурные и химические изменения происходят, когда ферменты гистонацетилтрансферазы (HAT) и гистондеацетилазы (HDAC) добавляют или удаляют ацетильные группы из гистона, вызывая значительные изменения в экспрессии ДНК. Изменяя экспрессию ДНК, ацетилирование и метилирование гистонов регулируют работу циркадного осциллятора. Фустин и его коллеги представили новый уровень сложности для регуляции циркадного осциллятора у млекопитающих, показав, что метилирование РНК необходимо для эффективного экспорта зрелой мРНК из ядра: ингибирование метилирования РНК вызывало ядерное удержание транскриптов часовых генов, что приводило к более длительному циркадному периоду. [35]
Ключевой особенностью часов является их способность синхронизироваться с внешними стимулами. Наличие клеточно-автономных осцилляторов почти в каждой клетке тела поднимает вопрос о том, как эти осцилляторы временно координируются. Поиск универсальных сигналов синхронизации для периферических часов у млекопитающих дал основные сигналы увлечения, такие как питание, температура и кислород. Было показано, что как ритмы питания, так и температурные циклы синхронизируют периферические часы и даже отсоединяют их от главных часов в мозге (например, ограниченное питание в дневное время). Было также обнаружено, что кислородные ритмы синхронизируют часы в культивируемых клетках. [36]
Современные экспериментальные подходы с использованием системной биологии выявили множество новых компонентов в биологических часах, которые предполагают интегративный взгляд на то, как организмы поддерживают циркадные колебания. [27] [28]
Недавно Баггс и др. разработали новую стратегию под названием «Анализ сети дозировки генов» (GDNA) для описания сетевых особенностей в человеческих циркадных часах, которые способствуют устойчивости организма к генетическим возмущениям. [28] В своем исследовании авторы использовали малые интерферирующие РНК (siRNA) для индукции дозозависимых изменений в экспрессии генов компонентов часов в бессмертных клетках человеческой остеосаркомы U2OS с целью построения сетей ассоциаций генов, соответствующих известным биохимическим ограничениям в циркадных часах млекопитающих. Использование множественных доз siRNA позволило их количественной ПЦР раскрыть несколько сетевых особенностей циркадных часов, включая пропорциональные ответы экспрессии генов, распространение сигнала через взаимодействующие модули и компенсацию посредством изменений экспрессии генов.
Пропорциональные ответы в экспрессии генов ниже по течению после возмущения, вызванного siRNA, выявили уровни экспрессии, которые активно изменялись по отношению к выключаемому гену. Например, когда Bmal1 выключался дозозависимым образом, уровни мРНК Rev-ErbA alpha и Rev-ErbA beta снижались линейно и пропорционально. Это подтвердило предыдущие выводы о том, что Bmal1 напрямую активирует гены Rev-erb, и далее предполагает, что Bmal1 вносит значительный вклад в экспрессию Rev-erb.
Кроме того, метод GDNA предоставил основу для изучения биологических релейных механизмов в циркадных сетях, посредством которых модули сообщают об изменениях в экспрессии генов. [28] Авторы наблюдали распространение сигнала посредством взаимодействия между активаторами и репрессорами и обнаружили однонаправленную паралогическую компенсацию среди нескольких репрессоров часовых генов — например, когда истощается PER1 , происходит увеличение Rev-erbs, что, в свою очередь, распространяет сигнал к снижению экспрессии в BMAL1 , цели репрессоров Rev-erb.
Исследуя нокдаун нескольких транскрипционных репрессоров, GDNA также выявила компенсацию паралогов, где паралоги генов были активированы посредством активного механизма, посредством которого функция гена заменяется после нокдауна неизбыточным образом — то есть одного компонента достаточно для поддержания функции. Эти результаты далее предполагают, что часовая сеть использует активные компенсаторные механизмы, а не простую избыточность, чтобы придать надежность и поддерживать функцию. По сути, авторы предположили, что наблюдаемые сетевые особенности действуют согласованно как генетическая буферная система для поддержания функции часов перед лицом генетических и экологических возмущений. [28] Следуя этой логике, мы можем использовать геномику для изучения сетевых особенностей в циркадном осцилляторе.
Другое исследование, проведенное Чжаном и др., также использовало скрининг малых интерферирующих РНК по всему геному в клеточной линии U2OS для идентификации дополнительных часовых генов и модификаторов с использованием экспрессии репортерного гена люциферазы. [27] Нокдаун почти 1000 генов снизил амплитуду ритма. Авторы обнаружили и подтвердили сотни мощных эффектов на длину периода или увеличение амплитуды во вторичных скринингах. Характеристика подмножества этих генов продемонстрировала дозозависимый эффект на функцию осциллятора . Анализ сети взаимодействия белков показал, что десятки продуктов генов были напрямую или косвенно связаны с известными компонентами часов. Анализ путей показал, что эти гены чрезмерно представлены для компонентов сигнального пути инсулина и hedgehog , клеточного цикла и метаболизма фолиевой кислоты. В сочетании с данными, демонстрирующими, что многие из этих путей регулируются часами, Чжан и др. постулировали, что часы взаимосвязаны со многими аспектами клеточной функции.
Системный биологический подход может связать циркадные ритмы с клеточными явлениями, которые изначально не считались регуляторами циркадных колебаний. Например, на семинаре 2014 года [37] в NHLBI были оценены новые открытия в области циркадной геномики и обсуждалось взаимодействие между биологическими часами и многими различными клеточными процессами.
Хотя точные 24-часовые циркадные часы обнаружены во многих организмах, они не универсальны. Организмы, живущие в высоких широтах Арктики или Антарктики, не испытывают солнечного времени во все времена года, хотя считается, что большинство из них поддерживают циркадный ритм, близкий к 24 часам, например, медведи во время оцепенения. [38] Большая часть биомассы Земли находится в темной биосфере, и хотя эти организмы могут демонстрировать ритмическую физиологию, для них доминирующий ритм вряд ли будет циркадным. [39] Для мигрирующих с востока на запад организмов — и особенно тех организмов, которые совершают кругосветное плавание — абсолютная 24-часовая фаза может отклоняться в течение месяцев, сезонов или лет.
Некоторые пауки демонстрируют необычно длинные или короткие циркадные часы. Например, некоторые пауки-кругопряды имеют 18,5-часовые циркадные часы, но все еще способны подстраиваться под 24-часовой цикл. Эта адаптация может помочь паукам избегать хищников, позволяя им быть наиболее активными перед восходом солнца. [40] Часы черных вдов аритмичные, возможно, из-за их предпочтения темной среды. [41]