Тестирование чувствительности к антибиотикам или тестирование восприимчивости к антибиотикам — это измерение восприимчивости бактерий к антибиотикам . Он используется, поскольку бактерии могут иметь устойчивость к некоторым антибиотикам. Результаты тестирования чувствительности могут позволить врачу изменить выбор антибиотиков с эмпирической терапии , когда антибиотик выбирается на основе клинического подозрения о месте инфекции и распространенных возбудителях, на направленную терапию , при которой выбор антибиотика основывается на знании организма и его чувствительности. [1]
Тестирование чувствительности обычно проводится в медицинской лаборатории и использует методы культивирования , которые подвергают бактерии воздействию антибиотиков, или генетические методы, которые проверяют, есть ли у бактерий гены, которые обеспечивают устойчивость. Методы культивирования часто включают измерение диаметра областей без роста бактерий, называемых зонами ингибирования, вокруг бумажных дисков, содержащих антибиотики, на чашках с агаровой культурой , которые были равномерно инокулированы бактериями. Минимальную ингибирующую концентрацию , которая является самой низкой концентрацией антибиотика, останавливающего рост бактерий, можно оценить по размеру зоны ингибирования.
Тестирование чувствительности к антибиотикам стало необходимым с момента открытия бета-лактамного антибиотика пенициллина . Первоначальные методы были фенотипическими и включали культивирование или разбавление. Etest , пропитанная антибиотиком полоска, доступна с 1980-х годов, а генетические методы, такие как тестирование полимеразной цепной реакцией (ПЦР), доступны с начала 2000-х годов. Продолжаются исследования по улучшению текущих методов, делая их более быстрыми или точными, а также разрабатывают новые методы тестирования, такие как микрофлюидика .
В клинической медицине антибиотики чаще всего назначаются на основе симптомов человека и медицинских рекомендаций . Этот метод выбора антибиотиков называется эмпирической терапией , [1] и он основан на знании того, какие бактерии вызывают инфекцию, и к каким антибиотикам бактерии могут быть чувствительны или устойчивы. [1] Например, простую инфекцию мочевыводящих путей можно лечить триметопримом/сульфаметоксазолом . [2] Это связано с тем, что Escherichia coli является наиболее вероятной возбудителем и может быть чувствительна к этому комбинированному антибиотику . [2] Однако бактерии могут быть устойчивы к нескольким классам антибиотиков . [2] Эта устойчивость может быть вызвана тем, что тип бактерий имеет внутреннюю устойчивость к некоторым антибиотикам, [2] из-за устойчивости после прошлого воздействия антибиотиков, [2] или потому, что устойчивость может передаваться из других источников, таких как плазмиды . [3] Тестирование чувствительности к антибиотикам дает информацию о том, какие антибиотики с большей вероятностью будут успешными и, следовательно, должны использоваться для лечения инфекции. [1]
В некоторых странах тестирование чувствительности к антибиотикам также проводится на уровне населения в качестве формы скрининга . [4] Это делается для оценки фоновых показателей резистентности к антибиотикам (например, метициллин-резистентного золотистого стафилококка ) и может повлиять на рекомендации и меры общественного здравоохранения . [4]
После того, как бактерия была идентифицирована после микробиологического культивирования , антибиотики выбираются для тестирования на восприимчивость. [5] Методы тестирования на восприимчивость основаны на воздействии антибиотиков на бактерии и наблюдении за эффектом на рост бактерий (фенотипическое тестирование) или на выявлении специфических генетических маркеров ( генетическое тестирование ). [6] Используемые методы могут быть качественными, то есть результат указывает на наличие или отсутствие резистентности; или количественными, использующими минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) для описания концентрации антибиотика, к которой бактерия чувствительна. [6]
Существует множество факторов, которые могут повлиять на результаты тестирования чувствительности к антибиотикам, включая неисправность прибора, температуру, влажность и эффективность антимикробного агента. Тестирование контроля качества (QC) помогает обеспечить точность результатов теста. [7] Такие организации, как Американская коллекция типовых культур и Национальная коллекция типовых культур, предоставляют штаммы бактерий с известными фенотипами устойчивости, которые можно использовать для контроля качества. [8]
Тестирование, основанное на воздействии антибиотиков на бактерии, использует агаровые пластины или разбавление в агаре или бульоне. [9] Выбор антибиотиков будет зависеть от выращиваемого организма и антибиотиков, которые доступны на месте. [5] Чтобы гарантировать точность результатов, концентрация бактерий, добавляемых в агар или бульон (инокулят), должна быть стандартизирована. Это достигается путем сравнения мутности бактерий , взвешенных в физиологическом растворе или бульоне, со стандартами Макфарланда — растворами, мутность которых эквивалентна мутности суспензии, содержащей заданную концентрацию бактерий. После достижения соответствующей концентрации (чаще всего стандарта Макфарланда 0,5) [10] , которую можно определить путем визуального осмотра или фотометрии , инокулят добавляется в питательную среду . [11] [10]
Метод диффузии дисков включает выбор штамма бактерий, размещение его на агаровой пластине и наблюдение за ростом бактерий вблизи дисков, пропитанных антибиотиком. [12] Это также называется методом Кирби-Бауэра , [13] хотя также используются модифицированные методы. [14] В некоторых случаях образцы мочи или положительные образцы культуры крови наносятся непосредственно на тестовую среду, минуя предварительный этап изоляции организма. [15] Если антибиотик подавляет рост микробов, вокруг диска видно четкое кольцо или зону ингибирования. Бактерии классифицируются как чувствительные, промежуточные или устойчивые к антибиотику путем сравнения диаметра зоны ингибирования с определенными пороговыми значениями, которые коррелируют с МИК. [14] [16]
Агар Мюллера-Хинтона часто используется в тесте диско-диффузии. [14] Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI) и Европейский комитет по тестированию чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST) предоставляют стандарты для типа и глубины агара, температуры инкубации и метода анализа результатов. [11] Диско-диффузия считается самым дешевым и простым из методов, используемых для тестирования чувствительности, и легко адаптируется для тестирования новых доступных антибиотиков или формул. [5] Некоторые медленнорастущие и прихотливые бактерии не могут быть точно протестированы этим методом, [5] в то время как другие, такие как виды Streptococcus и Haemophilus influenzae , могут быть протестированы, но требуют специализированных питательных сред и условий инкубации. [17]
Градиентные методы, такие как Etest , используют пластиковую полоску, помещенную на агар. [5] Пластиковая полоска, пропитанная различными концентрациями антибиотиков, помещается на питательную среду, и питательная среда просматривается после периода инкубации. [5] Минимальную ингибирующую концентрацию можно определить на основе пересечения каплевидной зоны ингибирования с маркировкой на полоске. [5] Можно использовать несколько полосок для разных антибиотиков. [5] Этот тип теста считается диффузионным тестом. [18]
В методах разбавления агара и бульона бактерии помещаются в несколько небольших пробирок с различными концентрациями антибиотиков. [14] Чувствительность бактерии определяется визуальным осмотром или автоматическими оптическими методами после периода инкубации. [5] Разбавление бульона считается золотым стандартом для фенотипического тестирования. [14] Самая низкая концентрация антибиотиков, которая подавляет рост, считается МПК. [5]
Существуют автоматизированные системы, которые воспроизводят ручные процессы, например, используя визуализацию и программный анализ для сообщения о зоне ингибирования при диффузионном тестировании или дозировании образцов и определении результатов при тестировании разбавления. [14] Автоматизированные приборы, такие как системы VITEK 2, BD Phoenix и Microscan, являются наиболее распространенной методологией для AST. Характеристики каждого прибора различаются, но основной принцип включает введение бактериальной суспензии в предварительно сформулированные панели антибиотиков. Панели инкубируются, и ингибирование роста бактерий антибиотиком автоматически измеряется с использованием таких методологий, как турбидиметрия , спектрофотометрия или флуоресцентное обнаружение. [19] Экспертная система сопоставляет МИК с результатами восприимчивости, [20] и результаты автоматически передаются в лабораторную информационную систему для проверки и составления отчетов. Хотя такое автоматизированное тестирование менее трудоемко и более стандартизировано, чем ручное тестирование, его точность может быть сравнительно низкой для некоторых организмов и антибиотиков [21] , поэтому диско-диффузионный тест остается полезным в качестве резервного метода. [22]
Генетическое тестирование, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), ДНК-микрочипа и петлевой изотермической амплификации , может использоваться для определения наличия у бактерий генов, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам. [9] [23] Примером является использование ПЦР для определения гена mecA для устойчивого к бета-лактамам Staphylococcus aureus . [9] Другие примеры включают анализы для тестирования генов устойчивости к ванкомицину vanA и vanB у видов Enterococcus и устойчивости к антибиотикам у Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli . [9] Эти тесты имеют то преимущество, что они прямые и быстрые, по сравнению с наблюдаемыми методами, [9] и имеют высокую вероятность обнаружения обнаружения, когда его нужно обнаружить. [24] Однако обнаружение генов устойчивости не всегда соответствует профилю устойчивости, наблюдаемому с помощью фенотипического метода. [9] Тесты также дороги и требуют специально обученного персонала. [25]
Полимеразная цепная реакция — это метод идентификации генов, связанных с восприимчивостью к антибиотикам. [26] В процессе ПЦР ДНК бактерии денатурируется, и две нити двойной спирали разделяются. Праймеры , специфичные для искомого гена, добавляются к раствору, содержащему ДНК, а ДНК-полимераза добавляется вместе со смесью, содержащей молекулы, которые понадобятся (например, нуклеотиды и ионы ). [25] Если соответствующий ген присутствует, каждый раз, когда этот процесс запускается, количество целевого гена будет удваиваться. [25] После этого процесса присутствие генов демонстрируется с помощью различных методов, включая электрофорез , саузерн-блоттинг и другие методы анализа последовательности ДНК . [25]
ДНК-микрочипы и чипы используют связывание комплементарной ДНК с целевым геном или последовательностью нуклеиновой кислоты. [9] Преимущество этого заключается в том, что можно одновременно оценивать несколько генов. [9]
В исследовании, опубликованном в сентябре 2024 года, с помощью магнитных наночастиц, содержащих пептид бета-2-гликопротеина I, имитирующий белок плазмы, можно выборочно извлекать микробные патогены из образцов крови в течение нескольких часов. Магниты используются для извлечения пептидно-бактериального комплекса с последующим генетическим тестированием. [27]
Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией с матрицей (MALDI-TOF MS) — еще один метод тестирования восприимчивости. [6] Это разновидность масс-спектрометрии с времяпролетом , в которой молекулы бактерии подвергаются матрично-активированной лазерной десорбции . [26] Затем ионизированные частицы ускоряются, и спектральные пики регистрируются, создавая профиль экспрессии, который способен дифференцировать определенные бактериальные штаммы после сравнения с известными профилями. [26] Это включает в себя, в контексте тестирования восприимчивости к антибиотикам, такие штаммы, как E. coli, продуцирующие бета-лактамазу . [9] MALDI-TOF — быстрый и автоматизированный метод. [9] Однако существуют ограничения для тестирования в этом формате; результаты могут не совпадать с результатами фенотипического тестирования, [9] а приобретение и обслуживание обходятся дорого. [25]
Бактерии помечаются как чувствительные, резистентные или имеющие промежуточную устойчивость к антибиотику на основе минимальной ингибирующей концентрации (МИК), которая является самой низкой концентрацией антибиотика, останавливающей рост бактерий. МИК сравнивается со стандартными пороговыми значениями (называемыми «пограничными значениями») для данной бактерии и антибиотика. [28] Пограничные значения для одного и того же организма и антибиотика могут различаться в зависимости от места заражения: [29] например, CLSI обычно определяет Streptococcus pneumoniae как чувствительный к внутривенному пенициллину, если МИК составляют ≤0,06 мкг/мл, промежуточный, если МИК составляют 0,12–1 мкг/мл, и резистентный, если МИК составляют ≥2 мкг/мл, но в случаях менингита пограничные значения значительно ниже. [30] Иногда то, помечен ли антибиотик как резистентный, также основано на бактериальных характеристиках, которые связаны с известными методами устойчивости, такими как потенциальная возможность выработки бета-лактамаз . [28] [20] Могут быть отмечены конкретные закономерности лекарственной устойчивости или множественной лекарственной устойчивости , такие как наличие бета-лактамазы расширенного спектра . [28] Такая информация может быть полезна для врача, который может изменить эмпирическое лечение на индивидуальное лечение, направленное только на причинную бактерию. [1] [9] Результаты тестов на чувствительность к антимикробным препаратам, проведенных в течение определенного периода времени, могут быть объединены, обычно в форме таблицы, для формирования антибиотикограммы. [31] [32] Антибиограммы помогают врачу выбрать лучшую эмпирическую антимикробную терапию на основе местных закономерностей резистентности до тех пор, пока не будут получены результаты лабораторных тестов. [32]
Идеальная антибактериальная терапия основана на определении возбудителя и его чувствительности к антибиотикам. Эмпирическое лечение часто начинается до того, как будут доступны лабораторные микробиологические отчеты. Это может быть для распространенных или относительно незначительных инфекций на основе клинических рекомендаций (например, внебольничная пневмония ), или для серьезных инфекций, таких как сепсис или бактериальный менингит , при которых отсроченное лечение несет существенные риски. [1] Эффективность отдельных антибиотиков варьируется в зависимости от анатомического места инфекции, способности антибиотика достигать места инфекции и способности бактерий противостоять или инактивировать антибиотик. [34]
Образцы для тестирования чувствительности к антибиотикам в идеале собираются до начала лечения. [1] Образец может быть взят из места предполагаемой инфекции; например, образец культуры крови , когда есть подозрение на присутствие бактерий в кровотоке ( бактериемия ), образец мокроты в случае пневмонии или образец мочи в случае инфекции мочевыводящих путей . Иногда может быть взято несколько образцов, если источник инфекции не ясен. [1] Эти образцы передаются в микробиологическую лабораторию , где их добавляют в питательную среду , в которой или на которой бактерии растут до тех пор, пока они не будут присутствовать в достаточном количестве для проведения идентификации и тестирования чувствительности. [35] [28]
Когда тестирование чувствительности к антибиотикам завершено, оно сообщит о микроорганизмах, присутствующих в образце, и о том, к каким антибиотикам они восприимчивы. [28] Хотя тестирование чувствительности к антибиотикам проводится в лаборатории ( in vitro ), предоставленная об этом информация часто клинически актуальна для антибиотиков у человека ( in vivo ). [36] Иногда необходимо принять решение относительно некоторых бактерий относительно того, являются ли они причиной инфекции или просто комменсальными бактериями или загрязнителями, [28] такими как Staphylococcus epidermidis [37] и другими оппортунистическими инфекциями . На выбор антибиотиков могут влиять и другие соображения, включая необходимость проникновения в инфицированный участок (например, абсцесс ) или подозрение, что одна или несколько причин инфекции не были обнаружены в образце. [1]
С момента открытия бета-лактамного антибиотика пенициллина показатели устойчивости к противомикробным препаратам возросли. [38] Со временем методы тестирования чувствительности бактерий к антибиотикам развивались и менялись. [25]
Александр Флеминг в 1920-х годах разработал первый метод тестирования восприимчивости. «Метод желоба», который он разработал, был методом диффузии, включающим антибиотик, который диффундировал через желоб, сделанный из агара. [25] В 1940-х годах несколько исследователей, включая Поупа, Фостера и Вудраффа, Винсента и Винсента, использовали вместо этого бумажные диски. [25] Все эти методы включают тестирование только восприимчивости к пенициллину. [25] Результаты было трудно интерпретировать, и они были ненадежными из-за неточных результатов, которые не были стандартизированы между лабораториями. [25]
Разбавление использовалось как метод выращивания и идентификации бактерий с 1870-х годов, а как метод проверки восприимчивости бактерий к антибиотикам с 1929 года, также Александром Флемингом. [25] Способ определения восприимчивости изменился от того, насколько мутным был раствор, к pH (в 1942 году), к оптическим приборам. [25] Использование более крупных пробирок на основе тестирования «макроразбавления» было заменено меньшими наборами «микроразбавления». [5]
В 1966 году Всемирная организация здравоохранения подтвердила метод Кирби-Бауэра в качестве стандартного метода тестирования чувствительности; он прост, экономически эффективен и может тестировать несколько антибиотиков. [25]
Etest был разработан в 1980 году Больмстрёмом и Эрикссоном, а MALDI-TOF — в 2000-х годах. [25] С 1980-х годов и после него был разработан ряд автоматизированных систем. [25] ПЦР была первым доступным генетическим тестом и впервые опубликована как метод определения чувствительности к антибиотикам в 2001 году. [25]
Тестирование в месте оказания медицинской помощи разрабатывается для ускорения времени тестирования и для того, чтобы помочь врачам избежать назначения ненужных антибиотиков в стиле прецизионной медицины . [39] Традиционные методы обычно занимают от 12 до 48 часов, [6] хотя это может занять до пяти дней. [28] Напротив, быстрое тестирование с использованием молекулярной диагностики определяется как «выполнимое в течение 8-часовой (нашей) рабочей смены». [6] Прогресс был медленным из-за ряда причин, включая стоимость и регулирование. [40]
Дополнительные исследования сосредоточены на недостатках текущих методов тестирования. Помимо длительности, необходимой для сообщения фенотипических методов, они трудоемки, их трудно переносить и использовать в условиях ограниченных ресурсов, а также существует вероятность перекрестного заражения. [25]
По состоянию на 2017 год диагностика резистентности в месте оказания медицинской помощи была доступна для метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA), рифампицин -резистентного микобактерия туберкулеза (ТБ) и ванкомицин-резистентного энтерококка (ВРЭ) с помощью GeneXpert от молекулярной диагностической компании Cepheid . [41]
Количественная ПЦР, с целью определения процента обнаруженных бактерий, обладающих геном резистентности, изучается. [9] Также изучается секвенирование всего генома изолированных бактерий, и, вероятно, станет более доступным, поскольку затраты со временем уменьшатся, а скорость увеличится. [9]
Дополнительные изученные методы включают микрофлюидику , которая использует небольшое количество жидкости и различные методы тестирования, такие как оптические, электрохимические и магнитные. [9] Такие анализы не требуют большого количества жидкости для тестирования, являются быстрыми и портативными. [9]
Было изучено использование флуоресцентных красителей. [9] Они включают меченые белки, нацеленные на биомаркеры , последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие в клетках, которые обнаруживаются, когда бактерия устойчива к антибиотику. [9] Изолят бактерий фиксируется в определенном положении, а затем растворяется. Затем изолят подвергается воздействию флуоресцентного красителя, который будет люминесцировать при просмотре. [9]
Также изучаются усовершенствования существующих платформ, включая усовершенствования систем визуализации, которые способны быстрее определять МИК в фенотипических образцах; или использование биолюминесцентных ферментов, которые выявляют рост бактерий, чтобы сделать изменения более заметными. [25]
После того, как результаты микробиологии помогли идентифицировать этиологический патоген и/или данные о восприимчивости к антимикробным препаратам, следует предпринять все возможные попытки сузить спектр антибиотиков. Это критически важный компонент антибиотикотерапии, поскольку он может снизить стоимость и токсичность и предотвратить возникновение устойчивости к антимикробным препаратам в обществе
Наиболее распространенными методами являются метод определения восприимчивости с помощью диско-диффузионного метода (также известный как метод Кирби-Бауэра)