stringtranslate.com

Редактирование генома

Различные поколения нуклеаз, используемые для редактирования генома, и пути репарации ДНК, используемые для модификации целевой ДНК.

Редактирование генома , или геномная инженерия , или редактирование генов — это вид генной инженерии , при котором ДНК вставляется, удаляется, модифицируется или заменяется в геноме живого организма. В отличие от ранних методов генной инженерии , которые случайным образом вставляют генетический материал в геном хозяина, редактирование генома нацелено на вставки в определенные места. Основным механизмом генетических манипуляций с помощью программируемых нуклеаз является распознавание целевых геномных локусов и связывание эффекторного ДНК-связывающего домена (DBD), двухцепочечных разрывов (DSB) в целевой ДНК эндонуклеазами рестрикции ( FokI и Cas ) и восстановление DSB посредством рекомбинации, направленной на гомологию (HDR) или негомологичного соединения концов (NHEJ). [1] [2]

История

Редактирование генома было впервые реализовано в 1990-х годах [3] до появления распространенных в настоящее время платформ редактирования генов на основе нуклеаз, но его использование было ограничено из-за низкой эффективности редактирования. Редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз, то есть всех трех основных классов этих ферментов — нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN) и сконструированных мегануклеаз, — было выбрано Nature Methods в качестве метода 2011 года. [4] Система CRISPR-Cas была выбрана журналом Science как «Прорыв года 2015». [5]

По состоянию на 2015 год использовались четыре семейства сконструированных нуклеаз: мегануклеазы , нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), и система кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками ( CRISPR / Cas9 ). [6] [7] [8] [9] По состоянию на 2017 год было доступно девять редакторов генома . [10]

В 2018 году в качестве распространенных методов такого редактирования использовались сконструированные нуклеазы или «молекулярные ножницы». Эти нуклеазы создают сайт-специфические двухцепочечные разрывы (DSB) в нужных местах генома. Индуцированные двухцепочечные разрывы восстанавливаются посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR), что приводит к целевым мутациям («редактированию»).

В мае 2019 года юристы в Китае сообщили, что в свете предполагаемого создания китайским ученым Хэ Цзянькуем первых людей с отредактированными генами (см. спор Лулу и Наны ) о разработке правил, согласно которым любой манипулирует геномом человека с помощью методов редактирования генов. , как и CRISPR , будет нести ответственность за любые связанные с этим неблагоприятные последствия. [11] Недавно обсуждался предостерегающий взгляд на возможные «слепые пятна» и риски CRISPR и связанных с ним биотехнологий, [12] основное внимание уделялось стохастической природе процессов клеточного контроля.

Институт Рослина Эдинбургского университета создал свиней, устойчивых к вирусу, вызывающему репродуктивный и респираторный синдром свиней , который обходится свиноводам США и Европы в 2,6 миллиарда долларов в год. [13]

В феврале 2020 года исследование в США благополучно показало редактирование генов CRISPR на 3 больных раком. [14] В 2020 году помидор Sicilian Rouge High GABA, в котором содержится больше аминокислот, способствующих расслаблению, был одобрен для продажи в Японии. [13]

В 2021 году Англия (а не остальная часть Великобритании) планировала снять ограничения на генетически отредактированные растения и животных, перейдя от регулирования, соответствующего требованиям Европейского Союза, к правилам, более близким к правилам США и некоторых других стран. В отчете Европейской комиссии за апрель 2021 года были обнаружены «веские признаки» того, что нынешний режим регулирования не подходит для редактирования генов. [13] Позже в 2021 году исследователи объявили об альтернативе CRISPR, помеченной белками, управляемыми облигатными мобильными элементами (OMEGA), включая IscB, IsrB и TnpB, как эндонуклеазы, обнаруживаемые в транспозонах и управляемые небольшими ωРНК. [15] [16]

Фон

Генная инженерия как метод внедрения в организм новых генетических элементов существует с 1970-х годов. Одним из недостатков этой технологии является случайный характер, с которым ДНК вставляется в геном хозяина , что может повредить или изменить другие гены в организме. Тем не менее, было обнаружено несколько методов, которые нацеливают вставленные гены на определенные участки генома организма. [3] Это также позволило редактировать определенные последовательности в геноме, а также уменьшить нецелевые эффекты. Это можно использовать в исследовательских целях, путем нацеливания мутаций на определенные гены, а также в генной терапии . Вставив функциональный ген в организм и направив его на замену дефектного, можно будет вылечить определенные генетические заболевания .

Нацеливание на гены

Гомологичная рекомбинация

Ранние методы нацеливания генов на определенные участки генома организма (называемые нацеливанием на гены ) основывались на гомологичной рекомбинации (HR). [17] Создавая конструкции ДНК, содержащие матрицу, соответствующую целевой последовательности генома, возможно, что процессы HR внутри клетки вставят конструкцию в нужное место. Использование этого метода на эмбриональных стволовых клетках привело к созданию трансгенных мышей с нокаутом целевых генов . Также стало возможным вмешиваться в гены или изменять закономерности экспрессии генов . [18] В знак признания открытия того, как гомологичная рекомбинация может быть использована для введения генетических модификаций у мышей посредством эмбриональных стволовых клеток, Марио Капечки , Мартин Эванс и Оливер Смитис были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине 2007 года . [19]

Условный таргетинг

Если жизненно важный ген выбит, это может оказаться смертельным для организма. Для изучения функции этих генов использовали сайт-специфические рекомбиназы (SSR). Двумя наиболее распространенными типами являются системы Cre-LoxP и Flp-FRT . Cre-рекомбиназа — это фермент, который удаляет ДНК путем гомологичной рекомбинации между связывающими последовательностями, известными как сайты Lox-P. Система Flip-FRT работает аналогичным образом: рекомбиназа Flip распознает последовательности FRT. Скрещивая организм, содержащий сайты рекомбиназы, фланкирующие интересующий ген, с организмом, который экспрессирует SSR под контролем тканеспецифичных промоторов , можно нокаутировать или включать гены только в определенных клетках. Эти методы также использовались для удаления маркерных генов у трансгенных животных. Дальнейшие модификации этих систем позволили исследователям вызывать рекомбинацию только при определенных условиях, позволяя генам выключаться или экспрессироваться в желаемое время или на желаемых стадиях развития . [18]

Процесс

Ремонт двухцепочечного разрыва

Пути репарации разрывов дцДНК и редактирование генома с использованием нуклеаз CRISPR-Cas

Распространенная форма редактирования генома основана на концепции механики восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Существует два основных пути восстановления DSB; негомологическое соединение концов (NHEJ) и репарация, направленная на гомологию (HDR). NHEJ использует различные ферменты для непосредственного соединения концов ДНК, в то время как более точный HDR использует гомологичную последовательность в качестве матрицы для регенерации недостающих последовательностей ДНК в точке разрыва. Это можно использовать путем создания вектора с желаемыми генетическими элементами внутри последовательности, гомологичной фланкирующим последовательностям DSB. Это приведет к вставке желаемого изменения на сайт DSB. Хотя редактирование генов на основе HDR похоже на нацеливание на гены на основе гомологичной рекомбинации, скорость рекомбинации увеличивается как минимум на три порядка. [20]

Инженерные нуклеазы

Группы сконструированных нуклеаз. Совпадающие цвета обозначают закономерности распознавания ДНК.

Ключом к редактированию генома является создание DSB в определенной точке генома. Обычно используемые ферменты рестрикции эффективны при разрезании ДНК, но обычно распознают и разрезают несколько участков. Чтобы преодолеть эту проблему и создать сайт-специфический DSB, на сегодняшний день были открыты и биоинженерно созданы три различных класса нуклеаз. Это нуклеазы цинковых пальцев ( ZFN ), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции ( TALEN ), мегануклеазы и система кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками ( CRISPR /Cas9).

Мегануклеазы

Мегануклеазы , открытые в конце 1980-х годов, представляют собой ферменты семейства эндонуклеаз , которые характеризуются способностью распознавать и разрезать большие последовательности ДНК (от 14 до 40 пар оснований). [21] Наиболее распространенными и наиболее известными мегануклеазами являются белки семейства LAGLIDADG, которые получили свое название благодаря консервативной аминокислотной последовательности .

Мегануклеазы, обычно встречающиеся у видов микробов, обладают уникальным свойством иметь очень длинные последовательности распознавания (> 14 пар оснований), что делает их естественно очень специфичными. [22] [23] Однако практически нет шансов найти точную мегануклеазу, необходимую для воздействия на выбранную специфическую последовательность ДНК. Чтобы преодолеть эту проблему, были использованы методы мутагенеза и высокопроизводительного скрининга для создания вариантов мегануклеазы, которые распознают уникальные последовательности. [23] [24] Другие смогли объединить различные мегануклеазы и создать гибридные ферменты, которые распознают новую последовательность. [25] [26] Третьи пытались изменить ДНК-взаимодействующие аминокислоты мегануклеазы, чтобы создать последовательность специфичных мегануклеаз с помощью метода, названного рационально разработанной мегануклеазой. [27] Другой подход предполагает использование компьютерных моделей, чтобы попытаться как можно точнее предсказать активность модифицированных мегануклеаз и специфичность распознаваемой нуклеиновой последовательности. [28]

Создан крупный банк, содержащий несколько десятков тысяч белковых единиц. Эти единицы можно объединить для получения химерных мегануклеаз, распознающих целевой сайт, тем самым предоставляя инструменты для исследований и разработок, отвечающие широкому кругу потребностей (фундаментальные исследования, здравоохранение, сельское хозяйство, промышленность, энергетика и т. д.). К ним относятся производство в промышленных масштабах. двух мегануклеаз, способных расщеплять ген XPC человека; мутации в этом гене приводят к пигментной ксеродерма , тяжелому моногенному заболеванию, которое предрасполагает пациентов к раку кожи и ожогам всякий раз, когда их кожа подвергается воздействию ультрафиолетовых лучей. [29]

Преимущество мегануклеаз заключается в том, что они вызывают меньшую токсичность в клетках, чем такие методы, как нуклеаза цинковых пальцев (ZFN), вероятно, из-за более строгого распознавания последовательности ДНК; [23] однако создание последовательно-специфичных ферментов для всех возможных последовательностей является дорогостоящим и трудоемким, поскольку не используются комбинаторные возможности, которые используют такие методы, как ZFN и слияния на основе TALEN.

Нуклеазы цинковых пальцев

В отличие от мегануклеаз, концепция ZFN и технологии TALEN основана на неспецифическом каталитическом домене, разрезающем ДНК, который затем может быть связан со специфической последовательностью ДНК, распознающей пептиды, такие как цинковые пальцы и эффекторы, подобные активаторам транскрипции (TALE). [30] Первым шагом к этому был поиск эндонуклеазы, у которой сайт узнавания ДНК и сайт расщепления были отделены друг от друга, что не является наиболее распространенной ситуацией среди ферментов рестрикции. [30] Как только этот фермент будет найден, его расщепляющую часть можно будет отделить, что будет очень неспецифично, поскольку у него не будет способности к распознаванию. Затем эту часть можно было бы связать с пептидами, распознающими последовательность, что могло бы привести к очень высокой специфичности.

Мотивы цинковых пальцев встречаются в нескольких факторах транскрипции . Ион цинка, содержащийся в 8% всех белков человека, играет важную роль в организации их трехмерной структуры. В факторах транскрипции он чаще всего располагается в местах взаимодействия белок-ДНК, где стабилизирует мотив. С-концевая часть каждого пальца отвечает за специфическое распознавание последовательности ДНК.

Распознанные последовательности короткие, состоят примерно из 3 пар оснований, но объединив от 6 до 8 цинковых пальцев, сайты узнавания которых были охарактеризованы, можно получить специфические белки для последовательностей длиной около 20 пар оснований. Следовательно, можно контролировать экспрессию определенного гена. Было продемонстрировано, что эту стратегию можно использовать для стимулирования процесса ангиогенеза у животных. [31] Также возможно объединить сконструированный таким образом белок с каталитическим доменом эндонуклеазы, чтобы вызвать целевой разрыв ДНК и, следовательно, использовать эти белки в качестве инструментов геномной инженерии. [32]

Обычно используемый для этого метод включает связывание двух ДНК-связывающих белков, каждый из которых содержит от 3 до 6 специально выбранных цинковых пальцев, с каталитическим доменом эндонуклеазы FokI, который должен димеризоваться для расщепления двухцепочечной ДНК. Эти два белка распознают две последовательности ДНК, которые находятся на расстоянии нескольких нуклеотидов друг от друга. Связывание двух белков «цинковых пальцев» с их соответствующими последовательностями сближает два домена FokI. FokI требует димеризации, чтобы иметь нуклеазную активность, а это означает, что специфичность резко возрастает, поскольку каждый партнер нуклеазы будет распознавать уникальную последовательность ДНК. Чтобы усилить этот эффект, были созданы нуклеазы FokI , которые могут функционировать только как гетеродимеры. [33]

Для создания специфических нуклеаз с цинковыми пальцами для выбранных последовательностей используется несколько подходов. Наиболее распространенный вариант – комбинирование элементов с цинковыми пальцами известных особенностей (модульная сборка). Различные методы селекции с использованием бактерий, дрожжей или клеток млекопитающих были разработаны для определения комбинаций, которые обеспечивают наилучшую специфичность и лучшую клеточную толерантность. Хотя о прямой полногеномной характеристике активности нуклеазы цинковых пальцев не сообщалось, анализ, измеряющий общее количество двухцепочечных разрывов ДНК в клетках, показал, что только один-два таких разрыва происходят выше фона в клетках, обработанных нуклеазами цинковых пальцев. со сложным сайтом узнавания длиной 24 п.н. и облигатными гетеродимерными доменами нуклеазы FokI . [33]

Нуклеазы, функционирующие гетеродимером, позволят избежать возможности нежелательной активности гомодимера и, таким образом, повысить специфичность DSB. Хотя нуклеазные части конструкций ZFN и TALEN имеют сходные свойства, разница между этими сконструированными нуклеазами заключается в их пептиде распознавания ДНК. ZFN опираются на цинковые пальцы Cys2-His2, а конструкции TALEN на TALE. Оба этих домена пептидов, распознающих ДНК, имеют ту особенность, что они естественным образом встречаются в комбинациях в своих белках. Cys2-His2 «Цинковые пальцы» обычно встречаются в повторах, которые находятся на расстоянии 3 п.н. друг от друга и встречаются в различных комбинациях в различных белках, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, таких как факторы транскрипции . Каждый палец домена цинкового пальца полностью независим, и на связывающую способность одного пальца влияет его сосед. С другой стороны, TALE обнаруживаются в повторах с соотношением узнавания один к одному между аминокислотами и распознаваемыми парами нуклеотидов. Поскольку и цинковые пальцы, и TALE встречаются по повторяющимся паттернам, можно попробовать различные комбинации для создания широкого спектра специфичностей последовательностей. [22] «Цинковые пальцы» более устоялись в этих терминах и подходах, таких как модульная сборка (когда цинковые пальцы, коррелирующие с триплетной последовательностью, присоединяются в ряд, чтобы охватить необходимую последовательность), OPEN (отбор пептидных доменов с низкой строгостью по сравнению с триплетные нуклеотиды с последующим строгим отбором комбинации пептидов по сравнению с конечной мишенью в бактериальных системах) и бактериальный одногибридный скрининг библиотек цинковых пальцев среди других методов использовались для создания сайт-специфических нуклеаз.

Нуклеазы цинковых пальцев — это инструменты исследований и разработок, которые уже использовались для модификации ряда геномов, в частности, в лабораториях Консорциума цинковых пальцев. Американская компания Sangamo BioSciences использует нуклеазы с цинковыми пальцами для проведения исследований в области генной инженерии стволовых клеток и модификации иммунных клеток в терапевтических целях. [34] [35] Модифицированные Т-лимфоциты в настоящее время проходят I фазу клинических испытаний для лечения опухоли головного мозга ( глиобластомы ) и борьбы со СПИДом. [33]

ТАЛЕН

Общий обзор процесса TALEN

Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), представляют собой специфические ДНК-связывающие белки, которые содержат массив повторов из 33 или 34 аминокислот. TALEN — это искусственные ферменты рестрикции, созданные путем слияния разрезающего ДНК домена нуклеазы с доменами TALE, которые можно адаптировать для специфического распознавания уникальной последовательности ДНК. Эти слитые белки служат легко нацеливаемыми «ножницами ДНК» для приложений редактирования генов, которые позволяют выполнять целевые модификации генома, такие как вставка, удаление, восстановление и замена последовательностей в живых клетках. [36] ДНК-связывающие домены, которые можно сконструировать для связывания любой желаемой последовательности ДНК, происходят из эффекторов TAL , ДНК-связывающих белков, выделяемых патогенными растениями Xanthomanos app. Эффекторы TAL состоят из повторяющихся доменов, каждый из которых содержит высококонсервативную последовательность из 34 аминокислот и распознают один нуклеотид ДНК в пределах целевого сайта. Нуклеаза может создавать двухцепочечные разрывы в целевом сайте, которые можно исправить с помощью подверженного ошибкам негомологичного соединения концов (NHEJ), что приводит к нарушениям генов за счет введения небольших вставок или делеций. Каждый повтор консервативен, за исключением так называемых повторяющихся вариабельных ди-остатков (RVD) в положениях аминокислот 12 и 13. RVD определяют последовательность ДНК, с которой будет связываться TALE. Это простое взаимно однозначное соответствие между повторами TALE и соответствующей последовательностью ДНК упрощает процесс сборки массивов повторов для распознавания новых последовательностей ДНК. Эти TALE могут быть слиты с каталитическим доменом ДНК-нуклеазы FokI с образованием эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN). Полученные в результате конструкции TALEN сочетают в себе специфичность и активность, эффективно генерируя сконструированные специфичные для последовательностей нуклеазы, которые связывают и расщепляют последовательности ДНК только в заранее выбранных сайтах. Система распознавания целей ТАЛЕН основана на легко прогнозируемом коде. Нуклеазы TAL специфичны по отношению к своей мишени, отчасти благодаря длине их сайта связывания, состоящего из более чем 30 пар оснований. TALEN можно выполнить в диапазоне 6 пар оснований любого отдельного нуклеотида во всем геноме. [37]

Конструкции TALEN используются аналогично сконструированным нуклеазам с цинковыми пальцами и имеют три преимущества при целевом мутагенезе: (1) специфичность связывания ДНК выше, (2) нецелевые эффекты ниже и (3) создание ДНК-связывающей структуры. домены проще.

КРИСПР

CRISPR (кластеризованные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы) — это генетические элементы, которые бактерии используют как своего рода приобретенный иммунитет для защиты от вирусов. Они состоят из коротких последовательностей, происходящих из вирусных геномов и включенных в бактериальный геном. Cas (белки, ассоциированные с CRISPR) обрабатывают эти последовательности и разрезают соответствующие последовательности вирусной ДНК. Путем введения плазмид, содержащих гены Cas и специально сконструированных CRISPR, в эукариотические клетки можно разрезать эукариотический геном в любом желаемом положении. [38]

Редактирование путем модификации нуклеиновых оснований (Редактирование оснований)

Один из самых ранних методов эффективного редактирования нуклеиновых кислот, использующий ферменты, модифицирующие нуклеиновые основания, управляемые направляющими последовательностями нуклеиновых кислот, был впервые описан в 1990-х годах и в последнее время получил возрождение. [3] [39] [40] [41] Преимущество этого метода заключается в том, что он не требует разрыва нитей геномной ДНК и, таким образом, позволяет избежать случайных вставок и делеций, связанных с разрывом нитей ДНК. Он подходит только для точного редактирования, требующего замены отдельных нуклеотидов, и оказался очень эффективным для этого типа редактирования. [41] [42]

АРКУТ

ARCUT означает искусственный резак ДНК, это метод, разработанный Комиямой. В этом методе используется псевдокомплементарная пептидная нуклеиновая кислота (pcPNA) для идентификации сайта расщепления внутри хромосомы. Как только pcPNA определит сайт, иссечение осуществляется с помощью церия (CE) и ЭДТА (химической смеси), выполняющей функцию сплайсинга. [43]

Точность и эффективность сконструированных нуклеаз

Мегануклеазный метод редактирования генов является наименее эффективным из упомянутых выше методов. Из-за природы ДНК-связывающего элемента и расщепляющего элемента он ограничен распознаванием одной потенциальной мишени на каждые 1000 нуклеотидов. [9] ZFN был разработан для преодоления ограничений мегануклеазы. Число возможных мишеней, которые может распознавать ZFN, было увеличено до одной на каждые 140 нуклеотидов. [9] Однако оба метода непредсказуемы, поскольку их ДНК-связывающие элементы влияют друг на друга. В результате требуются высокие экспертные знания, а также длительные и дорогостоящие процессы проверки.

Нуклеазы TALE, являясь наиболее точным и специфичным методом, дают более высокую эффективность, чем два предыдущих метода. Такая эффективность достигается за счет того, что ДНК-связывающий элемент состоит из массива субъединиц TALE, каждая из которых обладает способностью распознавать определенную нуклеотидную цепь ДНК, независимую от других, что приводит к большему количеству сайтов-мишеней с высокой точностью. Создание новых нуклеаз TALE занимает около одной недели и нескольких сотен долларов при наличии специального опыта в области молекулярной биологии и белковой инженерии. [9]

Нуклеазы CRISPR имеют немного меньшую точность по сравнению с нуклеазами TALE. Это вызвано необходимостью наличия определенного нуклеотида на одном конце для производства направляющей РНК, которую CRISPR использует для восстановления вызванного им двухцепочечного разрыва. Было доказано, что это самый быстрый и дешевый метод, стоящий всего менее двухсот долларов и несколько дней времени. [9] CRISPR также требует наименьших знаний в области молекулярной биологии, поскольку его конструкция основана на направляющей РНК, а не на белках. Одним из основных преимуществ CRISPR перед методами ZFN и TALEN является то, что его можно нацелить на различные последовательности ДНК, используя его sgRNA CRISPR размером ~80 нуклеотидов, в то время как методы ZFN и TALEN требуют конструирования и тестирования белков, созданных для нацеливания на каждую последовательность ДНК. [44]

Поскольку нецелевая активность активной нуклеазы могла бы иметь потенциально опасные последствия на генетическом и организменном уровнях, точность слияний мегануклеаз, ZFN, CRISPR и TALEN была активной областью исследований. Хотя сообщалось о переменных цифрах, ZFN, как правило, обладают большей цитотоксичностью, чем методы TALEN или РНК-ориентированные нуклеазы, в то время как TALEN и РНК-ориентированные подходы имеют тенденцию иметь наибольшую эффективность и меньше нецелевых эффектов. [45] Основываясь на максимальном теоретическом расстоянии между связыванием ДНК и активностью нуклеазы, подходы TALEN обеспечивают наибольшую точность. [9]

Мультиплексная автоматизированная геномная инженерия (MAGE)

Синтетическая ДНК повторно вводится в несколько целевых областей хромосомы и/или локусов, а затем реплицируется, образуя клетки с мутациями или без них.

Методы для ученых и исследователей, желающих изучить геномное разнообразие и все возможные связанные с ним фенотипы, были очень медленными, дорогими и неэффективными. До этой новой революции исследователям приходилось проводить манипуляции с одним геном и корректировать геном по одному небольшому участку за раз, наблюдать за фенотипом и начинать процесс заново с другой манипуляции с одним геном. [46] Поэтому исследователи из Института Висса Гарвардского университета разработали MAGE, мощную технологию, которая улучшает процесс редактирования генома in vivo. Он позволяет быстро и эффективно манипулировать геномом, причем все это происходит в машине, достаточно маленькой, чтобы ее можно было поставить на небольшой кухонный стол. Эти мутации в сочетании с вариациями, которые естественным образом возникают во время митоза клеток, создают миллиарды клеточных мутаций.

Химически комбинированная синтетическая одноцепочечная ДНК (оцДНК) и пул олигионуклеотидов вводятся в целевые области клетки, тем самым создавая генетические модификации. Циклический процесс включает трансформацию оцДНК (путем электропорации ) с последующим ростом, во время которого гомологичные рекомбинационные белки бактериофага опосредуют отжиг оцДНК с их геномными мишенями. Эксперименты, нацеленные на селективные фенотипические маркеры, проверяются и идентифицируются путем посева клеток на дифференциальные среды. В конечном итоге обработка каждого цикла занимает 2,5 часа, плюс дополнительное время требуется для выращивания изогенных культур и характеристики мутаций. Путем итеративного введения библиотек мутагенных оцДНК, нацеленных на несколько сайтов, MAGE может генерировать комбинаторное генетическое разнообразие в популяции клеток. Одновременно может быть внесено до 50 изменений генома, от отдельных пар нуклеотидов до всего генома или генных сетей, и результаты будут получены в течение нескольких дней. [46]

Эксперименты MAGE можно разделить на три класса, характеризующиеся разной степенью масштаба и сложности: (i) множество целевых сайтов, отдельные генетические мутации; (ii) один целевой сайт, множество генетических мутаций; и (iii) множество сайтов-мишеней, множество генетических мутаций. [46] Пример третьего класса был отражен в 2009 году, когда Черч и его коллеги смогли запрограммировать Escherichia coli на выработку в пять раз большего количества ликопина, антиоксиданта, который обычно содержится в семенах томатов и связан с противораковыми свойствами. Они применили MAGE для оптимизации метаболического пути 1-дезокси- D -ксилулозо-5-фосфата (DXP) в Escherichia coli с целью избыточного производства изопреноидного ликопина. Им потребовалось около 3 дней и чуть более 1000 долларов на материалы. Легкость, скорость и экономическая эффективность, с которыми MAGE может изменять геномы, могут изменить подходы к производству важных соединений в биоинженерии, биоэнергетике, биомедицинской инженерии, синтетической биологии, фармацевтике, сельском хозяйстве и химической промышленности.

Приложения

Гены растений, животных и человека, на которые успешно воздействует ZFN, что демонстрирует универсальность этого подхода.

По состоянию на 2012 год эффективное редактирование генома было разработано для широкого спектра экспериментальных систем, от растений до животных, часто выходящее за рамки клинического интереса, и становилось стандартной экспериментальной стратегией в исследовательских лабораториях. [47] Недавнее поколение крыс, рыбок данио , кукурузы и табака , опосредованных ZFN, а также усовершенствования подходов на основе TALEN свидетельствуют о значимости методов, и список быстро расширяется. Редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз, вероятно, внесет вклад во многие области наук о жизни, от изучения функций генов у растений и животных до генной терапии у людей. Например, область синтетической биологии , целью которой является создание клеток и организмов для выполнения новых функций, вероятно, выиграет от способности сконструированной нуклеазы добавлять или удалять геномные элементы и, следовательно, создавать сложные системы. [47] Кроме того, функции генов можно изучать с использованием стволовых клеток с помощью сконструированных нуклеаз.

Ниже перечислены некоторые конкретные задачи, которые может выполнять этот метод:

Направленная модификация генов у животных

Сочетание последних открытий в области генной инженерии, в частности редактирования генов, и последних усовершенствований в технологиях воспроизводства крупного рогатого скота (например, культивирование эмбрионов in vitro ) позволяет редактировать геном непосредственно в оплодотворенных ооцитах с использованием синтетических высокоспецифичных эндонуклеаз. РНК-ориентированные эндонуклеазы: кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами, ассоциированные с Cas9 (CRISPR/Cas9), представляют собой новый инструмент, еще больше расширяющий диапазон доступных методов . В частности, сконструированные CRISPR/Cas9 эндонуклеазы позволяют использовать несколько направляющих РНК для одновременного нокаута (KO) за один этап путем прямой цитоплазматической инъекции (CDI) в зиготы млекопитающих. [48]

Кроме того, редактирование генов можно применять к некоторым видам рыб в аквакультуре, например, к атлантическому лососю. Редактирование генов у рыб в настоящее время находится в стадии эксперимента, но возможные варианты включают рост, устойчивость к болезням, стерильность, контролируемое размножение и окраску. Выбор этих характеристик может обеспечить более устойчивую окружающую среду и лучшее благополучие рыб. [49]

Лосось AquAdvantage — это генетически модифицированный атлантический лосось, разработанный компанией AquaBounty Technologies. Ген, регулирующий гормон роста, у атлантического лосося заменен геном, регулирующим гормон роста, из тихоокеанской чавычи и промоторной последовательностью из океанской чавычи [50]

Благодаря параллельному развитию транскриптомики отдельных клеток, редактированию генома и новым моделям стволовых клеток мы сейчас вступаем в захватывающий с научной точки зрения период, когда функциональная генетика больше не ограничивается моделями животных, а может выполняться непосредственно на образцах человека. Анализ экспрессии генов в отдельных клетках позволил составить транскрипционную дорожную карту развития человека, на основе которой идентифицируются ключевые гены-кандидаты для функциональных исследований. Используя глобальные данные транскриптомики для руководства экспериментами, инструмент редактирования генома на основе CRISPR позволил разрушить или удалить ключевые гены, чтобы выяснить их функции в организме человека. [51]

Направленная модификация генов растений

Обзор рабочего процесса GEEN и возможностей редактирования

Редактирование генома с использованием Мегануклеазы , [52] ZFN и TALEN обеспечивает новую стратегию генетических манипуляций с растениями и, вероятно, поможет в разработке желаемых признаков растений путем модификации эндогенных генов. Например, добавление генов, специфичных для конкретного участка, в основных видах сельскохозяйственных культур может использоваться для «наложения признаков», при котором несколько желаемых признаков физически связаны, чтобы гарантировать их сегрегацию во время процессов селекции. [33] Недавно сообщалось о прогрессе в таких случаях у Arabidopsis thaliana [53] [54] [55] и Zea mays . У Arabidopsis thaliana с использованием нацеливания на гены с помощью ZFN два гена устойчивости к гербицидам (табачная ацетолактатсинтаза SuRA и SuRB) были введены в локусы SuR, в которых до 2% трансформированных клеток имели мутации. [53] У Zea mays разрушение целевого локуса было достигнуто с помощью ZFN-индуцированных DSB и образовавшегося в результате NHEJ. В этом случае ZFN также использовался для доставки кассеты экспрессии генов толерантности к гербицидам (PAT) в целевой эндогенный локус IPK1. [56] Было показано, что такая модификация генома, наблюдаемая у растений-регенерантов, передается по наследству и передается следующему поколению. [56] Потенциально успешный пример применения методов редактирования генома для улучшения урожая можно найти на банане, где ученые использовали редактирование CRISPR/Cas9 для инактивации эндогенного вируса полосатости банана в геноме B банана ( Musa spp. ), чтобы преодолеть серьезная проблема в селекции бананов. [57]

Кроме того, геномная инженерия на основе TALEN была тщательно протестирована и оптимизирована для использования на растениях. [58] Сплавы TALEN также использовались американской компанией по производству пищевых ингредиентов Calyxt [59] для улучшения качества соевых масляных продуктов [60] и увеличения потенциала хранения картофеля [61]

Необходимо провести несколько оптимизаций, чтобы улучшить редактирование геномов растений с использованием нацеливания, опосредованного ZFN. [62] Существует необходимость надежного проектирования и последующего тестирования нуклеаз, отсутствия токсичности нуклеаз, соответствующего выбора растительной ткани для нацеливания, путей индукции активности фермента, отсутствия нецелевого мутагенеза. и надежное обнаружение мутировавших случаев. [62]

Распространенным методом доставки CRISPR/Cas9 в растения является трансформация на основе Agrobacterium . [63] Т-ДНК вводится непосредственно в геном растения по механизму T4SS. Кассеты экспрессии на основе Cas9 и гРНК превращаются в Ti-плазмиды , которые трансформируются в Agrobacterium для применения в растениях. [63] Чтобы улучшить доставку Cas9 в живые растения, вирусы используют более эффективную доставку трансгена. [63]

Исследовать

Генная терапия

Идеальная практика генной терапии — это замена дефектного гена нормальным аллелем в его естественном месте. Это преимущество перед геном, доставляемым вирусом, поскольку нет необходимости включать полные кодирующие последовательности и регуляторные последовательности, когда необходимо изменить лишь небольшую часть гена, как это часто бывает. [64] [65] Экспрессия частично замененных генов также более соответствует нормальной клеточной биологии, чем полные гены, переносимые вирусными векторами.

Первое клиническое применение редактирования генома на основе TALEN было при лечении CD19+ острого лимфобластного лейкоза у 11-месячного ребенка в 2015 году. Модифицированные донорские Т-клетки были созданы для атаки на клетки лейкемии, чтобы они были устойчивы к алемтузумабу и уклонялись от лечения. обнаружение иммунной системой хозяина после введения. [66] [67]

Обширные исследования были проведены на клетках и животных с использованием CRISPR-Cas9, чтобы попытаться исправить генетические мутации, которые вызывают генетические заболевания, такие как синдром Дауна, расщелина позвоночника, анэнцефалия и синдромы Тернера и Клайнфельтера. [68]

В феврале 2019 года ученые-медики, работающие с Sangamo Therapeutics со штаб-квартирой в Ричмонде, штат Калифорния , объявили о первой в истории терапии редактирования человеческого гена «в теле» , позволяющей навсегда изменить ДНК — у пациента с синдромом Хантера . [69] Клинические испытания Sangamo, включающие редактирование генов с использованием нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), продолжаются. [70]

Искоренение болезней

Исследователи использовали гены CRISPR-Cas9 для модификации генов, связанных с бесплодием у A. gambiae , переносчика малярии. [71] Этот метод имеет дальнейшее значение в искоренении других трансмиссивных заболеваний, таких как желтая лихорадка, денге и Зика. [72]

Систему CRISPR-Cas9 можно запрограммировать на модуляцию популяции любых видов бактерий путем воздействия на клинические генотипы или эпидемиологические изоляты. Он может выборочно активировать полезные виды бактерий по сравнению с вредными, устраняя патоген, что дает ему преимущество перед антибиотиками широкого спектра действия. [46]

Противовирусные применения для лечения вирусов человека, таких как ВИЧ, герпес и вирус гепатита B, находятся в стадии исследования. CRISPR можно использовать для воздействия на вирус или хозяина, чтобы разрушить гены, кодирующие белки рецепторов вирусной клеточной поверхности. [44] В ноябре 2018 года Хэ Цзянькуй объявил, что он отредактировал два человеческих эмбриона, чтобы попытаться отключить ген CCR5 , который кодирует рецептор, который ВИЧ использует для проникновения в клетки. Он сказал, что девочки-близнецы Лулу и Нана родились несколькими неделями ранее. Он сказал, что девочки все еще имеют функциональные копии CCR5 наряду с отключенными CCR5 ( мозаицизм ) и все еще уязвимы к ВИЧ. Работа была широко осуждена как неэтичная, опасная и преждевременная. [73]

В январе 2019 года ученые в Китае сообщили о создании пяти идентичных клонированных обезьян с отредактированными генами, используя ту же технику клонирования, которая использовалась с Чжун Чжуном и Хуа Хуа – первыми в истории клонированными обезьянами – и овцой Долли , и с тем же геном. редактирование техники Crispr - Cas9 , предположительно использованной Хэ Цзянькуем при создании первых в истории генно-модифицированных человеческих младенцев Лулу и Наны . Клоны обезьян были созданы для изучения ряда медицинских заболеваний. [74] [75]

Перспективы и ограничения

В будущем важной целью исследований по редактированию генома с помощью инженерных нуклеаз должно стать повышение безопасности и специфичности действия нуклеаз. [76] Например, улучшение способности обнаруживать нецелевые события может улучшить нашу способность узнавать о способах их предотвращения. Кроме того, цинковые пальцы, используемые в ZFN, редко бывают полностью специфичными, а некоторые из них могут вызывать токсическую реакцию. Однако сообщалось, что токсичность снижается за счет модификаций домена расщепления ZFN. [65]

Кроме того, исследования Даны Кэрролл по модификации генома с помощью сконструированных нуклеаз показали необходимость лучшего понимания основных механизмов рекомбинации и восстановления ДНК. В будущем возможным методом идентификации вторичных мишеней станет захват сломанных концов клеток, экспрессирующих ZFN, и секвенирование фланкирующей ДНК с использованием высокопроизводительного секвенирования. [65]

Из-за простоты использования и экономической эффективности CRISPR в настоящее время проводятся обширные исследования. Сейчас о CRISPR опубликовано больше, чем о ZFN и TALEN, несмотря на то, что открытие CRISPR произошло недавно. [44] И CRISPR, и TALEN предпочитают использовать в крупномасштабных производствах из-за их точности и эффективности.

Редактирование генома происходит также как естественный процесс без искусственной генной инженерии. Агентами, способными редактировать генетические коды, являются вирусы или субвирусные РНК-агенты.

Хотя GEEN имеет более высокую эффективность, чем многие другие методы обратной генетики, он все же не очень эффективен; во многих случаях желаемые изменения достигаются менее чем у половины пролеченных групп населения. [53] Например, когда кто-то планирует использовать NHEJ клетки для создания мутации, системы HDR клетки также будут работать, исправляя DSB с более низкой частотой мутаций.

Традиционно мыши были наиболее распространенным выбором исследователей в качестве носителя модели заболевания. CRISPR может помочь преодолеть разрыв между этой моделью и клиническими испытаниями на людях, создавая модели трансгенных заболеваний на более крупных животных, таких как свиньи, собаки и приматы, кроме человека. [77] [78] Используя систему CRISPR-Cas9, запрограммированный белок Cas9 и sgRNA можно напрямую вводить в оплодотворенные зиготы для достижения желаемых модификаций генов при создании трансгенных моделей у грызунов. Это позволяет обойти обычный этап клеточного нацеливания при создании трансгенных линий и, как следствие, сократить время генерации на 90%. [78]

Одним из потенциальных возможностей, которые обеспечивает эффективность CRISPR, является применение ксенотрансплантации. В предыдущих исследовательских испытаниях CRISPR продемонстрировал способность нацеливаться и уничтожать эндогенные ретровирусы, что снижает риск передачи заболеваний и снижает иммунный барьер. [44] Устранение этих проблем улучшает функцию донорских органов, что приближает это применение к реальности.

У растений редактирование генома рассматривается как жизнеспособное решение проблемы сохранения биоразнообразия. Генный драйв является потенциальным инструментом для изменения скорости размножения инвазивных видов , хотя с этим связаны значительные риски. [79]

Улучшение человека

Многие трансгуманисты рассматривают редактирование генома как потенциальный инструмент улучшения человека . [80] [81] [82] Австралийский биолог и профессор генетики Дэвид Эндрю Синклер отмечает, что «новые технологии редактирования генома позволят использовать их на людях (...), чтобы иметь (...) более здоровых детей» – дизайнерские малыши . [83] Согласно отчету Совета Наффилда по биоэтике за сентябрь 2016 года, в будущем можно будет улучшить людей с помощью генов других организмов или полностью синтетических генов, например, для улучшения ночного зрения и обоняния . [84] [85] Джордж Черч составил список потенциальных генетических модификаций для потенциально полезных черт, таких как меньшая потребность во сне , когнитивные изменения, которые защищают от болезни Альцгеймера, устойчивость к болезням и улучшенные способности к обучению , а также некоторые из связанных исследований. и возможные негативные последствия. [86] [87]

Американская национальная академия наук и Национальная медицинская академия в феврале 2017 года опубликовали отчет, в котором содержится квалифицированная поддержка редактирования генома человека. [88] Они рекомендовали, чтобы однажды были разрешены клинические испытания по редактированию генома, как только будут найдены ответы на проблемы безопасности и эффективности, «но только для серьезных состояний при строгом надзоре». [89]

Риски

В заявлении Разведывательного сообщества США по оценке мировых угроз 2016 года директор национальной разведки США Джеймс Р. Клэппер назвал редактирование генома потенциальным оружием массового уничтожения , заявив, что редактирование генома, проводимое странами с нормативными или этическими стандартами, «отличными от Западные страны», вероятно, увеличивает риск создания вредных биологических агентов или продуктов. Согласно заявлению, широкое распространение, низкая стоимость и ускоренные темпы развития этой технологии, ее преднамеренное или непреднамеренное неправильное использование могут привести к далеко идущим последствиям для экономики и национальной безопасности. [90] [91] [92] Например, такие технологии, как CRISPR, можно использовать для создания «комаров-убийц», вызывающих эпидемии, уничтожающие основные сельскохозяйственные культуры. [92]

Согласно отчету Совета Наффилда по биоэтике за сентябрь 2016 года , простота и низкая стоимость инструментов для редактирования генетического кода позволят любителям – или « биохакерам » – проводить свои собственные эксперименты, создавая потенциальный риск из-за выпуска генетически модифицированных продуктов. ошибки. Обзор также показал, что риски и преимущества изменения генома человека – и передачи этих изменений будущим поколениям – настолько сложны, что требуют срочного этического анализа. Такие модификации могут иметь непредвиденные последствия, которые могут нанести вред не только ребенку, но и его будущим детям, поскольку измененный ген будет находиться в их сперме или яйцеклетке. [84] [85] В 2001 году австралийские исследователи Рональд Джексон и Ян Рэмшоу подверглись критике за публикацию в «Журнале вирусологии» статьи, в которой исследовался потенциальный контроль над мышами, основным вредителем в Австралии, путем заражения их измененным вирусом мышиной оспы , который вызвать бесплодие, поскольку предоставленная конфиденциальная информация может привести к изготовлению биологического оружия потенциальными биотеррористами , которые могут использовать эти знания для создания вакциноустойчивых штаммов других вирусов оспы, таких как оспа , которые могут поражать людей. [85] [93] Кроме того, существуют дополнительные опасения по поводу экологических рисков, связанных с высвобождением генных драйвов в дикие популяции. [85] [94] [95]

Нобелевская премия

В 2007 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена Марио Капечки, Мартину Эвансу и Оливеру Смитису «за открытие принципов введения специфических модификаций генов у мышей с помощью эмбриональных стволовых клеток». [19]

В 2020 году Нобелевская премия по химии была присуждена Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна «за разработку метода редактирования генома». [96]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Саураб С. (март 2021 г.). «Редактирование генома: революция в улучшении урожая». Отчет по молекулярной биологии растений . 39 (4): 752–772. дои : 10.1007/s11105-021-01286-7. S2CID  233713026.
  2. ^ Бак, Расмус О.; Гомес-Оспина, Наталья; Портеус, Мэтью Х. (август 2018 г.). «Редактирование генов в центре внимания». Тенденции в генетике . 34 (8): 600–611. doi :10.1016/j.tig.2018.05.004. ISSN  0168-9525. PMID  29908711. S2CID  49269023.
  3. ^ abc Woolf TM (апрель 1998 г.). «Терапевтическая репарация мутированных последовательностей нуклеиновых кислот». Природная биотехнология . 16 (4): 341–4. дои : 10.1038/nbt0498-341. PMID  9555723. S2CID  9210810.
  4. ^ «Метод года 2011». Природные методы . 9 (1): 1 января 2012 г. doi : 10.1038/nmeth.1852 . ПМИД  22312634.
  5. ^ Сотрудники Science News (17 декабря 2015 г.). «Прорыв года: CRISPR делает успех».
  6. ^ Эсвелт К.М., Ван Х.Х. (2013). «Геномная инженерия для систем и синтетической биологии». Молекулярная системная биология . 9 (1): 641. doi :10.1038/msb.2012.66. ПМЦ 3564264 . ПМИД  23340847. 
  7. ^ Тан В.С., Карлсон Д.Ф., Уолтон М.В., Фаренкруг СК, Хакетт П.Б. (2012). «Точное редактирование геномов крупных животных». Достижения генетики . Том. 80. стр. 37–97. дои : 10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8. ISBN 9780124047426. ПМЦ  3683964 . ПМИД  23084873.
  8. ^ Пухта Х, Фаузер Ф (2013). «Нацеливание на гены растений: 25 лет спустя». Международный журнал биологии развития . 57 (6–8): 629–37. дои : 10.1387/ijdb.130194hp . ПМИД  24166445.
  9. ^ abcdef Больоли Э., Ричард М. «Переписывая книгу жизни: новая эра точного редактирования генома» (PDF) . Бостонская консалтинговая группа . Проверено 30 ноября 2015 г.
  10. ^ Церковь G (9 февраля 2017 г.). «Будущее генетических кодов и кодов МОЗГА». YouTube . НИХвкаст . Проверено 10 февраля 2017 г. .
  11. ^ Сираноски Д. (май 2019 г.). «Китай собирается ввести регулирование редактирования генов после фурора вокруг CRISPR». Природа . дои : 10.1038/d41586-019-01580-1. PMID  32424191. S2CID  182604140 . Проверено 20 мая 2019 г.
  12. ^ Чеонг К.Х., Ко Дж.М., Джонс MC (июль 2019 г.). «Черные лебеди CRISPR: стохастичность и сложность генетической регуляции». Биоэссе . 41 (7): e1900032. doi :10.1002/bies.201900032. PMID  31090950. S2CID  155086967.
  13. ^ abc Стокстад, Эрик (26 мая 2021 г.). «Великобритания намерена ослабить правила в отношении генетически отредактированных сельскохозяйственных культур и животных». Наука | АААС . Проверено 27 мая 2021 г.
  14. ^ «Испытание в США показывает, что геномы троих больных раком были безопасно изменены с помощью CRISPR» . НаукаАлерт . 7 февраля 2020 г. Проверено 9 февраля 2020 г.
  15. ^ Алтае-Тран, Хан; Каннан, Сумья; Демирджиоглу, Ф. Эсра; Оширо, Рэйчел; Нети, Сухата П.; Маккей, Люк Дж.; Длакич, Менсур; Инскип, Уильям П.; Макарова Кира С.; Макрэ, Рианнон К.; Кунин, Евгений В. (01 октября 2021 г.). «Распространенное семейство транспозонов IS200/IS605 кодирует разнообразные программируемые РНК-ориентированные эндонуклеазы». Наука . 374 (6563): 57–65. Бибкод : 2021Sci...374...57A. doi : 10.1126/science.abj6856. ISSN  0036-8075. ПМЦ 8929163 . PMID  34591643. S2CID  238237947. 
  16. ^ «Новые программируемые белки редактирования генов, обнаруженные за пределами систем CRISPR» . Броудский институт . 09.09.2021 . Проверено 4 октября 2021 г.
  17. ^ Лодиш Х., Берк А., Зипурски С.Л., Мацудайра П., Балтимор Д., Дарнелл Дж. (2000). «Глава 8.5: Замена генов и трансгенные животные: ДНК переносится в эукариотические клетки различными способами». Молекулярно-клеточная биология (4-е изд.). WH Фриман и компания. ISBN 978-0-7167-3136-8.
  18. ^ ab Роча-Мартинс М., Кавальейру Г.Р., Матос-Родригес Г.Е., Мартинс Р.А. (август 2015 г.). «От нацеливания на гены к редактированию генома: применение трансгенных животных и не только». Анаис да Академия Бразилиа де Сиенсиас . 87 (2 приложения): 1323–48. дои : 10.1590/0001-3765201520140710 . ПМИД  26397828.
  19. ^ ab «Нобелевская премия по физиологии и медицине 2007 г.». Нобелевский фонд . Проверено 15 декабря 2008 г.
  20. ^ Джасин М. (июнь 1996 г.). «Генетические манипуляции геномами с помощью редкорежущих эндонуклеаз». Тенденции в генетике . 12 (6): 224–8. дои : 10.1016/0168-9525(96)10019-6 . ПМИД  8928227.
  21. ^ Стоддард Б.Л. (февраль 2005 г.). «Структура и функция самонаводящейся эндонуклеазы». Ежеквартальные обзоры биофизики . 38 (1): 49–95. дои : 10.1017/s0033583505004063. PMID  16336743. S2CID  27841011.
  22. ^ Аб де Соуза Н (январь 2012 г.). «Букварь: редактирование генома с помощью сконструированных нуклеаз». Природные методы . 9 (1): 27. doi : 10.1038/nmeth.1848 . PMID  22312638. S2CID  26924628.
  23. ^ abc Смит Дж., Гризо С., Арнулд С., Дуклерт А., Эпинат Дж.К., Чеймс П. и др. (2006). «Комбинаторный подход к созданию искусственных хоминг-эндонуклеаз, расщепляющих выбранные последовательности». Исследования нуклеиновых кислот . 34 (22): е149. doi : 10.1093/nar/gkl720. ПМК 1702487 . ПМИД  17130168. 
  24. ^ Селигман Л.М., Чисхолм К.М., Шевалье Б.С., Чедси М.С., Эдвардс С.Т., Сэвидж Дж.Х., Вейлет А.Л. (сентябрь 2002 г.). «Мутации, изменяющие специфичность расщепления самонаводящейся эндонуклеазы». Исследования нуклеиновых кислот . 30 (17): 3870–9. дои : 10.1093/nar/gkf495. ПМК 137417 . ПМИД  12202772. 
  25. ^ Шевалье Б.С., Кортемме Т., Чедси М.С., Бейкер Д., Моннат Р.Дж., Стоддард Б.Л. (октябрь 2002 г.). «Дизайн, активность и структура высокоспецифичной искусственной эндонуклеазы». Молекулярная клетка . 10 (4): 895–905. дои : 10.1016/S1097-2765(02)00690-1 . ПМИД  12419232.
  26. ^ Арну С., Чеймс П., Перес С., Лакруа Э., Дюклерт А., Эпинат Дж. К. и др. (январь 2006 г.). «Разработка большого количества высокоспецифичных самонаводящихся эндонуклеаз, которые индуцируют рекомбинацию на новых мишенях ДНК». Журнал молекулярной биологии . 355 (3): 443–58. дои : 10.1016/j.jmb.2005.10.065. ПМИД  16310802.
  27. ^ Рационально разработанные мегануклеазы с измененной специфичностью последовательности и аффинностью связывания ДНК, 18 октября 2006 г. , получено 11 августа 2018 г.
  28. ^ Эшворт Дж., Тейлор Г.К., Хавранек Дж.Дж., Квадри С.А., Стоддард Б.Л., Бейкер Д. (сентябрь 2010 г.). «Вычислительное перепрограммирование специфичности самонаводящейся эндонуклеазы по нескольким соседним парам оснований». Исследования нуклеиновых кислот . 38 (16): 5601–8. дои : 10.1093/nar/gkq283. ПМЦ 2938204 . ПМИД  20435674. 
  29. ^ Редондо П., Прието Дж., Муньос И.Г., Алибес А., Стричер Ф., Серрано Л. и др. (ноябрь 2008 г.). «Молекулярные основы распознавания ДНК ксеродермы пигментной группы C с помощью инженерных мегануклеаз». Природа . 456 (7218): 107–11. Бибкод : 2008Natur.456..107R. дои : 10.1038/nature07343. PMID  18987743. S2CID  4300643.
  30. ^ аб Бейкер М (январь 2012 г.). «Нуклеазы, редактирующие гены». Природные методы . 9 (1): 23–6. дои : 10.1038/nmeth.1807. PMID  22312637. S2CID  37050234.
  31. ^ Rebar EJ, Huang Y, Hickey R, Nath AK, Meoli D, Nath S и др. (декабрь 2002 г.). «Индукция ангиогенеза на мышиной модели с использованием сконструированных факторов транскрипции». Природная медицина . 8 (12): 1427–32. дои : 10.1038/nm1202-795. PMID  12415262. S2CID  23318821.
  32. ^ Ким Ю.Г., Ча Дж., Чандрасегаран С. (февраль 1996 г.). «Гибридные рестриктазы: слияние цинковых пальцев с доменом расщепления Fok I». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (3): 1156–60. Бибкод : 1996PNAS...93.1156K. дои : 10.1073/pnas.93.3.1156 . ПМК 40048 . ПМИД  8577732. 
  33. ^ abcd Урнов Ф.Д., Ребар Э.Дж., Холмс MC, Чжан Х.С., Грегори П.Д. (сентябрь 2010 г.). «Редактирование генома с помощью модифицированных нуклеаз с цинковыми пальцами». Обзоры природы. Генетика . 11 (9): 636–46. дои : 10.1038/nrg2842. PMID  20717154. S2CID  205484701.
  34. ^ Рейк А. и др. (2008). «Нуклеазы с цинковыми пальцами, нацеленные на глюкокортикоидный рецептор, позволяют трансгенным ЦТЛ зетакина IL-13 убивать клетки глиобластомы in vivo в присутствии иммуносупрессирующих глюкокортикоидов». Мол. Там . 16 (Дополнение 1): С13–С14. дои : 10.1016/S1525-0016(16)39437-0 .
  35. ^ Холт Н., Ван Дж., Ким К., Фридман Г., Ван Х., Топин В. и др. (август 2010 г.). «Человеческие гемопоэтические стволовые клетки/клетки-предшественники, модифицированные нуклеазами с цинковыми пальцами, нацеленными на контроль CCR5 ВИЧ-1 in vivo». Природная биотехнология . 28 (8): 839–47. дои : 10.1038/nbt.1663. ПМК 3080757 . ПМИД  20601939. 
  36. ^ Гай Т., Герсбах, Калифорния, Барбас CF (июль 2013 г.). «Методы геномной инженерии на основе ZFN, TALEN и CRISPR/Cas». Тенденции в биотехнологии . 31 (7): 397–405. doi :10.1016/j.tibtech.2013.04.004. ПМЦ 3694601 . ПМИД  23664777. 
  37. ^ Перес-Кинтеро А.Л., Родригес-Р.Л.М., Дирипер А., Лопес С., Кебник Р., Сюрек Б., Куннак С. (15 июля 2013 г.). «Усовершенствованный метод предсказания сайтов связывания ДНК эффекторов TAL обнаруживает функциональную конвергенцию в репертуарах TAL штаммов Xanthomonas oryzae». ПЛОС ОДИН . 8 (7): e68464. Бибкод : 2013PLoSO...868464P. дои : 10.1371/journal.pone.0068464 . ПМЦ 3711819 . ПМИД  23869221. 
  38. ^ Янг С. (11 февраля 2014 г.). «Геномная хирургия». Обзор технологий Массачусетского технологического института . Архивировано из оригинала 15 февраля 2014 года . Проверено 2 ноября 2017 г.
  39. ^ Woolf TM, Chase JM, Stinchcomb DT (август 1995 г.). «На пути к терапевтическому редактированию мутированных последовательностей РНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 92 (18): 8298–302. Бибкод : 1995PNAS...92.8298W. дои : 10.1073/pnas.92.18.8298 . ПМК 41144 . ПМИД  7545300. 
  40. ^ Woolf TM, Gurumurthy CB, Boyce F, Kmiec EB (апрель 2017 г.). «Расщеплять или не расщеплять: терапевтическое редактирование генов с программируемыми нуклеазами и без них». Обзоры природы. Открытие наркотиков . 16 (4): 296. doi : 10.1038/nrd.2017.42 . ПМИД  28303022.
  41. ^ ab Komor AC, Ким YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR (май 2016 г.). «Программируемое редактирование целевого основания геномной ДНК без двухцепочечного расщепления ДНК». Природа . 533 (7603): 420–4. Бибкод : 2016Natur.533..420K. дои : 10.1038/nature17946. ПМЦ 4873371 . ПМИД  27096365. SharedIt
  42. ^ Сервантес-Грация К., Грамалла-Шмитц А., Вайшедель Дж., Чахван Р. (2021). «APOBECs организуют геномное и эпигеномное редактирование в отношении здоровья и болезней». Тенденции Жене . 37 (11): 1028–1043. дои : 10.1016/j.tig.2021.07.003 . ISSN  0168-9525. PMID  34353635. S2CID  236934922.
  43. ^ Хан, Сикандар Хаят (07.06.2019). «Технологии редактирования генома: концепция, плюсы и минусы различных методов редактирования генома и биоэтические проблемы для клинического применения». Молекулярная терапия. Нуклеиновые кислоты . 16 . Эльзевир Б.В.: 326–334. doi : 10.1016/j.omtn.2019.02.027. ISSN  2162-2531. ПМК 6454098 . ПМИД  30965277. 
  44. ^ abcd Баррангу Р., Дудна Дж.А. (сентябрь 2016 г.). «Применение технологий CRISPR в исследованиях и за их пределами». Природная биотехнология . 34 (9): 933–941. дои : 10.1038/nbt.3659. PMID  27606440. S2CID  21543486.
  45. ^ Ким Х, Ким Дж.С. (май 2014 г.). «Руководство по генной инженерии с программируемыми нуклеазами». Обзоры природы. Генетика . 15 (5): 321–34. дои : 10.1038/nrg3686. PMID  24690881. S2CID  9373606.
  46. ^ abcd Галлахер Р.Р., Ли З., Льюис А.О., Исаакс Ф.Дж. (октябрь 2014 г.). «Быстрое редактирование и эволюция бактериальных геномов с использованием библиотек синтетической ДНК». Протоколы природы . 9 (10): 2301–16. дои : 10.1038/nprot.2014.082. PMID  25188632. S2CID  16447825.
  47. ^ аб МакМахон М.А., Рахдар М., Портеус М. (декабрь 2011 г.). «Редактирование генов: больше не только для перевода». Природные методы . 9 (1): 28–31. дои : 10.1038/nmeth.1811. PMID  22205513. S2CID  2144013.
  48. ^ Дайно Б.В., Раджпут С., Смит Г.В., Росс П.Дж. (май 2018 г.). «Эмбриональный POU5F1 необходим для формирования расширенных бластоцист крупного рогатого скота». Научные отчеты . 8 (1): 7753. Бибкод : 2018NatSR...8.7753D. дои : 10.1038/s41598-018-25964-x. ПМК 5958112 . ПМИД  29773834. 
  49. ^ Варгелиус, Анна (2019). «Применение редактирования генома водных сельскохозяйственных животных». Трансгенные исследования . 28 (Приложение 2): 101–105. дои : 10.1007/s11248-019-00163-0. PMID  31321691. S2CID  197665984 . Проверено 29 апреля 2021 г.
  50. ^ Ясковяк, Эдвард С.; Ширс, Маргарет А.; Агарвал-Мавал, Алка; Флетчер, Гарт Л. (2006). «Характеристика и стабильность трансгена гормона роста (EO-1α) в нескольких поколениях, ответственного за повышенные темпы роста атлантического лосося». Трансгенные исследования . 15 (4): 465–480. дои : 10.1007/s11248-006-0020-5. PMID  16906447. S2CID  22247493.
  51. ^ Ортега Н.М., Винблад Н., Плаза Рейес А., Ланнер Ф. (октябрь 2018 г.). «Функциональная генетика раннего развития человека». Текущее мнение в области генетики и развития . 52 : 1–6. дои : 10.1016/j.gde.2018.04.005 . ПМИД  29729430.
  52. ^ Арну С., Деленда С., Гризо С., Дессо С., Пакес Ф., Сильва Г.Х., Смит Дж. (январь 2011 г.). «Мегануклеаза I-CreI и ее сконструированные производные: применение от клеточной модификации до генной терапии». Белковая инженерия, проектирование и отбор . 24 (1–2): 27–31. дои : 10.1093/протеин/gzq083 . ПМИД  21047873.
  53. ^ abc Таунсенд Дж.А., Райт Д.А., Уинфри Р.Дж., Фу Ф., Мэдер М.Л., Йонг Дж.К., Войтас Д.Ф. (май 2009 г.). «Высокочастотная модификация генов растений с использованием сконструированных нуклеаз с цинковыми пальцами». Природа . 459 (7245): 442–5. Бибкод : 2009Natur.459..442T. дои : 10.1038/nature07845. ПМЦ 2743854 . ПМИД  19404258. 
  54. ^ Чжан Ф., Мэдер М.Л., Унгер-Уоллес Э., Хошоу Дж.П., Рейон Д., Кристиан М. и др. (июнь 2010 г.). «Высокочастотный целенаправленный мутагенез в Arabidopsis thaliana с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (26): 12028–33. Бибкод : 2010PNAS..10712028Z. дои : 10.1073/pnas.0914991107 . ПМК 2900673 . ПМИД  20508152. 
  55. ^ Осакабе К., Осакабе Ю., Токи С. (июнь 2010 г.). «Сайт-направленный мутагенез у Arabidopsis с использованием специально разработанных нуклеаз с цинковыми пальцами». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (26): 12034–9. Бибкод : 2010PNAS..10712034O. дои : 10.1073/pnas.1000234107 . ПМК 2900650 . ПМИД  20508151. 
  56. ^ аб Шукла В.К., Дойон Ю., Миллер Дж.К., ДеКелвер Р.К., Мёле Э.А., Уорден С.Е. и др. (май 2009 г.). «Точная модификация генома сельскохозяйственных культур Zea mays с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами». Природа . 459 (7245): 437–41. Бибкод : 2009Natur.459..437S. дои : 10.1038/nature07992. PMID  19404259. S2CID  4323298.
  57. ^ Трипати Дж.Н., Нтуи В.О., Рон М., Муирури С.К., Бритт А., Трипати Л. (31 января 2019 г.). «Редактирование CRISPR/Cas9 эндогенного вируса полосатости бананов в геноме B видов Musa позволяет преодолеть серьезную проблему селекции бананов». Коммуникационная биология . 2 (1): 46. дои : 10.1038/s42003-019-0288-7. ПМК 6355771 . ПМИД  30729184. 
  58. ^ Таунсон Дж (01 января 2017 г.). «Последние разработки в области редактирования генома для потенциального использования в растениях». Горизонты бионауки . 10 . doi : 10.1093/bihorizons/hzx016 .
  59. ^ Регаладо А (19 декабря 2017 г.). «Это не ГМО твоего отца». Обзор технологий Массачусетского технологического института . Проверено 16 апреля 2018 г.
  60. ^ Хаун В., Коффман А., Класен Б.М., Деморест З.Л., Лоуи А., Рэй Э. и др. (сентябрь 2014 г.). «Улучшение качества соевого масла за счет целевого мутагенеза семейства генов десатуразы 2 жирных кислот». Журнал биотехнологии растений . 12 (7): 934–40. дои : 10.1111/pbi.12201 . ПМИД  24851712.
  61. ^ Класен Б.М., Стоддард Т.Дж., Луо С., Деморест З.Л., Ли Дж., Седроне Ф. и др. (январь 2016 г.). «Улучшение характеристик холодного хранения и переработки картофеля посредством целенаправленного нокаута генов». Журнал биотехнологии растений . 14 (1): 169–76. дои : 10.1111/pbi.12370 . ПМИД  25846201.
  62. ^ аб Пухта Х, Хон Б (июнь 2010 г.). «Последние новости: растения мутируют точно в цель». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (26): 11657–8. Бибкод : 2010PNAS..10711657P. дои : 10.1073/pnas.1006364107 . ПМК 2900667 . ПМИД  20554917. 
  63. ^ abc Пол JW, Ци Ю (июль 2016 г.). «CRISPR/Cas9 для редактирования генома растений: достижения, проблемы и перспективы». Отчеты о растительных клетках . 35 (7): 1417–27. doi : 10.1007/s00299-016-1985-z. PMID  27114166. S2CID  8035222.
  64. ^ Монга, Иша; Куреши, Абид; Тхакур, Нишант; Гупта, Амит Кумар; Кумар, Манодж (сентябрь 2017 г.). «ASPsiRNA: ресурс ASP-siRNA, обладающий терапевтическим потенциалом в отношении генетических нарушений человека, и алгоритм прогнозирования их ингибирующей эффективности». Г3 . 7 (9): 2931–2943. дои : 10.1534/g3.117.044024 . ПМК 5592921 . ПМИД  28696921. 
  65. ^ abc Кэрролл D (ноябрь 2008 г.). «Прогресс и перспективы: нуклеазы с цинковыми пальцами как агенты генной терапии». Генная терапия . 15 (22): 1463–8. дои : 10.1038/gt.2008.145. ПМЦ 2747807 . ПМИД  18784746. 
  66. ^ Поллак А (05.11.2015). «Клеточная терапия, непроверенная на людях, спасает ребенка от рака». Нью-Йорк Таймс . ISSN  0362-4331 . Проверено 30 ноября 2015 г.
  67. ^ Кузен-Франкель Дж. (ноябрь 2015 г.). «ИММУНОТЕРАПИЯ РАКА. Лейкемия у ребенка отступает после новой клеточной терапии». Наука . 350 (6262): 731. doi :10.1126/science.350.6262.731. ПМИД  26564829.
  68. ^ Mentis AF (декабрь 2016 г.). «Эпигеномная инженерия синдрома Дауна». Неврологические и биоповеденческие обзоры . 71 : 323–327. doi :10.1016/j.neubiorev.2016.09.012. PMID  27646312. S2CID  24192441.
  69. ↑ Маркионе М (7 февраля 2019 г.). «Испытания показывают, что ученые впервые осуществили редактирование генов «в организме». АП Новости . Проверено 7 февраля 2019 г.
  70. ^ Персонал (2 февраля 2019 г.). «Исследование возрастающей дозы редактирования генома с помощью терапевтической нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) SB-913 у субъектов с МПС II». ClinicalTrials.gov . Национальная медицинская библиотека США . Проверено 7 февраля 2019 г.
  71. ^ Хаммонд А., Гализи Р., Киру К., Симони А., Синискальчи С., Кацанос Д. и др. (январь 2016 г.). «Система генного драйва CRISPR-Cas9, направленная на воспроизводство самок у малярийных комаров-переносчиков Anopheles gambiae». Природная биотехнология . 34 (1): 78–83. дои : 10.1038/nbt.3439. ПМЦ 4913862 . ПМИД  26641531. 
  72. ^ Флетчер М (11 августа 2018 г.). «Комары-мутанты: может ли редактирование генов убить малярию?». Телеграф . ISSN  0307-1235 . Проверено 12 августа 2018 г.
  73. ↑ Бегли С. (28 ноября 2018 г.). «На фоне возмущения китайский ученый защищает создание детей с отредактированными генами – STAT». СТАТ .
  74. ^ Science China Press (23 января 2019 г.). «Обезьяны с отредактированными генами, клонированные в Китае». ЭврекАлерт! . Проверено 24 января 2019 г.
  75. ↑ Мандельбаум РФ (23 января 2019 г.). «Последний китайский эксперимент с клонированными обезьянами представляет собой этический беспорядок». Гизмодо . Проверено 24 января 2019 г.
  76. ^ Тебул Л., Эро Ю., Уэллс С., Касим В., Павлович Г. (июнь 2020 г.). «Вариабельность результатов редактирования генома: проблемы воспроизводимости исследований и клинической безопасности». Молекулярная терапия . 28 (6): 1422–1431. дои : 10.1016/j.ymthe.2020.03.015. ПМЦ 7264426 . ПМИД  32243835. 
  77. ^ Им В., Мун Дж., Ким М. (сентябрь 2016 г.). «Применение CRISPR/Cas9 для редактирования генов при наследственных двигательных расстройствах». Журнал двигательных расстройств . 9 (3): 136–43. дои : 10.14802/jmd.16029. ПМК 5035944 . ПМИД  27667185. 
  78. ^ Аб Сюй П.Д., Ландер Э.С., Чжан Ф (июнь 2014 г.). «Разработка и применение CRISPR-Cas9 для геномной инженерии». Клетка . 157 (6): 1262–1278. дои : 10.1016/j.cell.2014.05.010. ПМЦ 4343198 . ПМИД  24906146. 
  79. ^ Джонсон Дж.А., Альтвегг Р., Эванс Д.М., Юэн Дж.Г., Гордон И.Дж., Петторелли Н., Янг Дж.К. (01.04.2016). «Есть ли будущее у технологий редактирования генома в консервации?». Охрана животных . 19 (2): 97–101. Бибкод : 2016AnCon..19...97J. дои : 10.1111/acv.12273. ISSN  1469-1795. S2CID  27633404.
  80. ^ Перлман А (3 декабря 2015 г.). «Генетики обеспокоены тем, что трансгуманисты будут использовать CRISPR на себе». Вице-материнская плата . Проверено 26 декабря 2016 г.
  81. ^ Йоргенсен Э. «Как биохакеры, занимающиеся своими руками, меняют разговоры о генной инженерии». Вашингтон Пост . Проверено 26 декабря 2016 г.
  82. ^ «Совершенствование человека». Исследовательский центр Пью. 26 июля 2016 г. Проверено 26 декабря 2016 г.
  83. ^ Регаладо А. «Разработка идеального ребенка». Обзор технологий Массачусетского технологического института . Проверено 26 декабря 2016 г.
  84. ^ ab Образец I (30 сентября 2016 г.). «Эксперты предупреждают, что домашние наборы для редактирования генов представляют опасность для общества». Хранитель . Проверено 26 декабря 2016 г.
  85. ^ abcd «Редактирование генома: этический обзор» (PDF) . Совет Наффилда по биоэтике. Сентябрь 2016 г. Архивировано из оригинала (PDF) 14 ноября 2016 г. . Проверено 27 декабря 2016 г.
  86. ^ «Джордж Чёрч рассказал нам, почему он перечисляет «сверхчеловеческие» генные хаки» . Футуризм . Проверено 25 июля 2021 г.
  87. ^ «Защитные аллели». arep.med.harvard.edu . Проверено 25 июля 2021 г.
  88. ^ Хармон А (14 февраля 2017 г.). «Редактирование гена человека получает поддержку научной группы». Нью-Йорк Таймс . ISSN  0362-4331 . Проверено 17 февраля 2017 г.
  89. ^ «Ученые ОК, генно-инженерные младенцы» . Нью-Йорк Пост . Рейтер. 14 февраля 2017 г. Проверено 17 февраля 2017 г.
  90. ^ Клэппер-младший (9 февраля 2016 г.). «Оценка мировых угроз разведывательного сообщества США» (PDF) . Проверено 26 декабря 2016 г.
  91. ^ Warmflash D (6 сентября 2016 г.). «Редактирование генома: угроза национальной безопасности?» . Проверено 26 декабря 2016 г.
  92. ^ ab Регаладо А. «Высший чиновник разведки США называет редактирование генов угрозой ОМП». Обзор технологий Массачусетского технологического института . Проверено 26 декабря 2016 г.
  93. ^ Джексон Р., Рамшоу I (январь 2010 г.). «Опыт мышиной оспы. Интервью с Рональдом Джексоном и Яном Рэмшоу об исследованиях двойного назначения. Интервью Майкла Дж. Селгелида и Лорны Вейр». Отчеты ЭМБО . 11 (1): 18–24. дои : 10.1038/embor.2009.270. ПМЦ 2816623 . ПМИД  20010799. 
  94. ^ Broad WJ (23 января 2001 г.). «Австралийцы создают смертельный мышиный вирус». Нью-Йорк Таймс . Проверено 27 декабря 2016 г.
  95. ^ Рэдфорд Т. (10 января 2001 г.). «Лаборатория случайно создала вирус-убийцу». Хранитель . Проверено 27 декабря 2016 г.
  96. ^ «Нобелевская премия по химии 2020». Нобелевский фонд. Архивировано из оригинала 7 октября 2020 года . Проверено 7 октября 2020 г.

«ВОЗ запускает глобальный реестр по редактированию генома человека». PharmaBiz, 31 августа 2019 г. Gale General OneFile, по состоянию на 27 апреля 2020 г.

дальнейшее чтение