Полимеразная цепная реакция

Лабораторная техника для размножения образца ДНК для исследования

Полоска из восьми ПЦР-пробирок, каждая из которых содержит 100 мкл реакционной смеси.

Помещение полоски из восьми ПЦР-пробирок в термоциклер

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) — это метод, широко используемый для быстрого создания миллионов или миллиардов копий определенного образца ДНК , позволяющий ученым амплифицировать очень маленький образец ДНК (или его часть) в достаточной степени, чтобы провести детальное исследование. ПЦР была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Маллисом в Cetus Corporation . Маллис и биохимик Майкл Смит , которые разработали другие важные способы манипулирования ДНК, были совместно удостоены Нобелевской премии по химии в 1993 году. ^[1]

ПЦР имеет основополагающее значение для многих процедур, используемых в генетическом тестировании и исследовании, включая анализ древних образцов ДНК и идентификацию инфекционных агентов. Используя ПЦР, копии очень малых количеств последовательностей ДНК экспоненциально амплифицируются в серии циклов изменения температуры. ПЦР в настоящее время является распространенной и часто незаменимой техникой, используемой в медицинских лабораторных исследованиях для широкого спектра приложений, включая биомедицинские исследования и судебную экспертизу . ^{[2] [3]}

Большинство методов ПЦР основаны на термическом циклировании . Термическое циклирование подвергает реагенты повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, чтобы обеспечить различные температурно-зависимые реакции, в частности, плавление ДНК и ферментативную репликацию ДНК . В ПЦР используются два основных реагента — праймеры (которые представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды , которые являются комплементарной последовательностью к целевой области ДНК) и термостабильная ДНК-полимераза . На первом этапе ПЦР две цепи двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурацией нуклеиновой кислоты . На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Затем две цепи ДНК становятся матрицами для ДНК-полимеразы для ферментативной сборки новой цепи ДНК из свободных нуклеотидов , строительных блоков ДНК. По мере продвижения ПЦР полученная ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, запуская цепную реакцию , в которой исходная матрица ДНК экспоненциально амплифицируется.

Почти все приложения ПЦР используют термостабильную ДНК-полимеразу , такую ​​как Taq -полимераза , фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus . Если бы используемая полимераза была термочувствительной, она бы денатурировала при высоких температурах на этапе денатурации. До использования Taq -полимеразы ДНК-полимеразу приходилось вручную добавлять в каждом цикле, что было утомительным и дорогостоящим процессом. ^[4]

Применение этого метода включает клонирование ДНК для секвенирования , клонирование и манипуляцию генами, мутагенез генов; построение филогений на основе ДНК или функциональный анализ генов ; диагностику и мониторинг генетических нарушений ; амплификацию древней ДНК; ^[5] анализ генетических отпечатков для профилирования ДНК (например, в судебной медицине и тестировании на родство ); и обнаружение патогенов в тестах нуклеиновых кислот для диагностики инфекционных заболеваний .

Принципы

Старый трехтемпературный термоциклер для ПЦР

ПЦР амплифицирует определенный участок цепи ДНК (целевую ДНК). Большинство методов ПЦР амплифицируют фрагменты ДНК длиной от 0,1 до 10 килопар оснований (кбн), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты до 40 кбн. ^[6] Количество амплифицированного продукта определяется доступными субстратами в реакции, что становится ограничивающим по мере ее развития. ^[7]

Для базовой установки ПЦР требуется несколько компонентов и реагентов, ^[8] в том числе:

• ДНК-матрица , содержащая целевую область ДНК для амплификации
• ДНК -полимераза ; фермент, который полимеризует новые цепи ДНК; термостойкая полимераза Taq особенно распространена ^[9] , поскольку она с большей вероятностью останется неповрежденной в процессе высокотемпературной денатурации ДНК
• два праймера ДНК , которые комплементарны 3 ' (трем праймерам) концам каждой смысловой и антисмысловой нити целевой ДНК (ДНК-полимераза может связываться и удлиняться только с двухцепочечной областью ДНК; без праймеров нет двухцепочечной инициирующей площадки, с которой может связываться полимераза); ^[10] определенные праймеры, которые комплементарны целевой области ДНК, выбираются заранее и часто изготавливаются на заказ в лаборатории или приобретаются у коммерческих поставщиков биохимических реагентов
• дезоксинуклеозидтрифосфаты , или dNTP (иногда называемые «дезоксинуклеотидтрифосфатами»; нуклеотиды , содержащие трифосфатные группы), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК
• буферный раствор, обеспечивающий подходящую химическую среду для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы
• двухвалентные катионы , обычно ионы магния (Mg) или марганца (Mn); Mg ²⁺ является наиболее распространенным, но Mn ²⁺ может использоваться для ПЦР-опосредованного мутагенеза ДНК , поскольку более высокая концентрация Mn ²⁺ увеличивает частоту ошибок во время синтеза ДНК; ^[11] и одновалентные катионы , обычно ионы калия (K) ^{[ необходим лучший источник ]}

Реакция обычно проводится в объеме 10–200  мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0,2–0,5 мл) в термоциклере . Термоциклер нагревает и охлаждает реакционные пробирки для достижения температур, требуемых на каждом этапе реакции (см. ниже). Многие современные термоциклеры используют устройство Пельтье , которое позволяет как нагревать, так и охлаждать блок, удерживающий ПЦР-пробирки, просто изменяя полярность электрического тока устройства. Тонкостенные реакционные пробирки обеспечивают благоприятную теплопроводность , что позволяет быстро достичь теплового равновесия. Большинство термоциклеров имеют нагреваемые крышки для предотвращения конденсации в верхней части реакционной пробирки. Старые термоциклеры, не имеющие нагреваемой крышки, требуют слоя масла поверх реакционной смеси или шарика воска внутри пробирки. ^{[ необходима цитата ]}

Процедура

Обычно ПЦР состоит из серии из 20–40 повторяющихся изменений температуры, называемых термическими циклами, причем каждый цикл обычно состоит из двух или трех дискретных температурных шагов (см. рисунок ниже). Циклу часто предшествует один температурный шаг при очень высокой температуре (>90 °C (194 °F)), а затем следует одно удержание в конце для окончательного расширения продукта или кратковременного хранения. Используемые температуры и продолжительность времени, в течение которого они применяются в каждом цикле, зависят от различных параметров, включая фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и dNTP в реакции, а также температуру плавления ( T _m ) праймеров. ^[12] Отдельные шаги, общие для большинства методов ПЦР, следующие:

• Инициализация : этот шаг требуется только для ДНК-полимераз, которым требуется активация нагреванием с помощью ПЦР с горячим стартом . ^[13] Он состоит из нагрева реакционной камеры до температуры 94–96 °C (201–205 °F) или 98 °C (208 °F), если используются чрезвычайно термостабильные полимеразы, которая затем выдерживается в течение 1–10 минут. ^{[ необходима цитата ]}
• Денатурация : этот шаг является первым регулярным циклическим событием и состоит из нагрева реакционной камеры до 94–98 °C (201–208 °F) в течение 20–30 секунд. Это вызывает плавление ДНК или денатурацию двухцепочечной ДНК-матрицы путем разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, что дает две одноцепочечные молекулы ДНК.
• Отжиг : на следующем этапе температура реакции понижается до 50–65 °C (122–149 °F) на 20–40 секунд, что позволяет отжигать праймеры к каждой из одноцепочечных ДНК-матриц. Обычно в реакционную смесь включают два разных праймера: по одному для каждого из двух одноцепочечных комплементов, содержащих целевую область. Праймеры сами по себе являются одноцепочечными последовательностями, но они намного короче длины целевой области, дополняя только очень короткие последовательности на 3'-конце каждой нити. ^{[ необходима цитата ]}

Крайне важно определить правильную температуру для этапа отжига, поскольку эффективность и специфичность сильно зависят от температуры отжига. Эта температура должна быть достаточно низкой, чтобы обеспечить гибридизацию праймера с цепью, но достаточно высокой, чтобы гибридизация была специфичной, т. е. праймер должен связываться только с идеально комплементарной частью цепи и больше нигде. Если температура слишком низкая, праймер может связываться несовершенно. Если она слишком высокая, праймер может вообще не связываться. Типичная температура отжига примерно на 3–5 °C ниже T _m используемых праймеров. Стабильные водородные связи между комплементарными основаниями образуются только тогда, когда последовательность праймера очень близко соответствует последовательности шаблона. На этом этапе полимераза связывается с гибридом праймер-шаблон и начинает образование ДНК. ^{[ необходима цитата ]}

• Расширение/удлинение : Температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; оптимальная температура активности для термостабильной ДНК-полимеразы Taq- полимеразы составляет приблизительно 75–80 °C (167–176 °F), ^{[14] [15],} хотя температура 72 °C (162 °F) обычно используется с этим ферментом. На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы, добавляя свободные dNTP из реакционной смеси, которая комплементарна матрице в направлении 5'-к-3' , конденсируя 5'- фосфатную группу dNTP с 3'- гидроксигруппой на конце зарождающейся (удлиняющейся) цепи ДНК. Точное время, необходимое для удлинения, зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и от длины целевой области ДНК для амплификации. Как правило, при оптимальной температуре большинство ДНК-полимераз полимеризуют тысячу оснований в минуту. При оптимальных условиях (т. е. если нет ограничений из-за ограничивающих субстратов или реагентов) на каждом этапе расширения/элонгации число целевых последовательностей ДНК удваивается. С каждым последующим циклом исходные нити шаблона плюс все вновь созданные нити становятся нитями шаблона для следующего раунда элонгации, что приводит к экспоненциальной (геометрической) амплификации конкретной целевой области ДНК. ^{[ необходима цитата ]}

Процессы денатурации, отжига и удлинения составляют один цикл. Для амплификации целевой ДНК до миллионов копий требуется несколько циклов. Формула, используемая для расчета количества копий ДНК, образованных после заданного количества циклов, равна 2 ⁿ , где n — количество циклов. Таким образом, набор реакций для 30 циклов дает 2 ³⁰ , или 1 073 741 824 копий исходной двухцепочечной целевой области ДНК.

• Окончательное удлинение : этот отдельный этап необязателен, но выполняется при температуре 70–74 °C (158–165 °F) (температурный диапазон, необходимый для оптимальной активности большинства полимераз, используемых в ПЦР) в течение 5–15 минут после последнего цикла ПЦР, чтобы гарантировать, что вся оставшаяся одноцепочечная ДНК полностью удлинена.
• Окончательное хранение : на последнем этапе реакционная камера охлаждается до 4–15 °C (39–59 °F) в течение неопределенного времени и может использоваться для краткосрочного хранения продуктов ПЦР.

Схематическое изображение полного цикла ПЦР

Окрашенные бромистым этидием продукты ПЦР после гель-электрофореза . Для амплификации целевой последовательности из трех различных образцов тканей использовались два набора праймеров. В образце № 1 амплификация отсутствует; полосы ДНК в образцах № 2 и № 3 указывают на успешную амплификацию целевой последовательности. Гель также показывает положительный контроль и лестницу ДНК, содержащую фрагменты ДНК определенной длины для определения размера полос в экспериментальных ПЦР.

Чтобы проверить, успешно ли ПЦР сгенерировала ожидаемую целевую область ДНК (иногда также называемую амплимером или ампликоном ), можно использовать электрофорез в агарозном геле для разделения по размеру продуктов ПЦР. Размер продуктов ПЦР определяется путем сравнения с ДНК-лестницей , маркером молекулярной массы, который содержит фрагменты ДНК известных размеров, которые проходят по гелю вместе с продуктами ПЦР.

ПЦР Такера

Этапы

Экспоненциальное усиление

Как и в случае с другими химическими реакциями, скорость реакции и эффективность ПЦР зависят от ограничивающих факторов. Таким образом, весь процесс ПЦР можно разделить на три этапа в зависимости от хода реакции:

• Экспоненциальная амплификация : в каждом цикле количество продукта удваивается (предполагая 100% эффективность реакции). После 30 циклов одну копию ДНК можно увеличить до 1 000 000 000 (одного миллиарда) копий. В некотором смысле, репликация дискретной нити ДНК манипулируется в пробирке в контролируемых условиях. ^[16] Реакция очень чувствительна: должны присутствовать только мельчайшие количества ДНК.
• Стадия выравнивания : реакция замедляется, поскольку ДНК-полимераза теряет активность, а потребление реагентов, таких как dNTP и праймеры, приводит к их ограничению.
• Плато : продукт больше не накапливается из-за истощения реагентов и фермента.

Оптимизация

На практике ПЦР может терпеть неудачу по разным причинам, таким как чувствительность или загрязнение. ^{[17] [18]} Загрязнение посторонней ДНК может привести к появлению ложных продуктов и устраняется с помощью лабораторных протоколов и процедур, которые отделяют смеси до ПЦР от потенциальных загрязняющих ДНК. ^[8] Например, если анализируется ДНК с места преступления, одна молекула ДНК от персонала лаборатории может быть амплифицирована и ввести в заблуждение расследование. Поэтому области установки ПЦР отделены от анализа или очистки других продуктов ПЦР, используется одноразовая пластиковая посуда, а рабочая поверхность между установками реакции должна быть тщательно очищена.

Специфичность можно регулировать экспериментальными условиями, чтобы не генерировать ложные продукты. Методы проектирования праймеров важны для улучшения выхода продуктов ПЦР и предотвращения образования неспецифических продуктов. Использование альтернативных буферных компонентов или ферментов полимеразы может помочь в амплификации длинных или иным образом проблемных участков ДНК. Например, считается, что полимераза Q5 в ~280 раз менее подвержена ошибкам, чем полимераза Taq. ^{[19] [20]} Как рабочие параметры (например, температура и продолжительность циклов), так и добавление реагентов, таких как формамид , могут повысить специфичность и выход ПЦР. ^[21] Компьютерное моделирование теоретических результатов ПЦР ( электронная ПЦР ) может быть выполнено для помощи в проектировании праймеров. ^[22]

Приложения

Селективная изоляция ДНК

ПЦР позволяет изолировать фрагменты ДНК от геномной ДНК путем селективной амплификации определенного региона ДНК. Такое использование ПЦР дополняет множество способов, таких как создание гибридизационных зондов для гибридизации по Саузерну или Северу и клонирования ДНК , которые требуют больших количеств ДНК, представляющих определенный регион ДНК. ПЦР обеспечивает эти методы большими количествами чистой ДНК, что позволяет анализировать образцы ДНК даже из очень малых количеств исходного материала. ^{[ необходима цитата ]}

Другие применения ПЦР включают секвенирование ДНК для определения неизвестных ПЦР-амплифицированных последовательностей, в которых один из праймеров амплификации может быть использован в секвенировании по Сэнгеру , выделение последовательности ДНК для ускорения технологий рекомбинантной ДНК, включающих вставку последовательности ДНК в плазмиду , фаг или космиду (в зависимости от размера) или генетический материал другого организма. Бактериальные колонии (такие как E. coli ) могут быть быстро проверены с помощью ПЦР на предмет корректных векторных конструкций ДНК. ^[23] ПЦР также может быть использована для генетической дактилоскопии ; судебно-медицинской техники, используемой для идентификации человека или организма путем сравнения экспериментальных ДНК с помощью различных методов на основе ПЦР. ^{[ необходима цитата ]}

Электрофорез ПЦР-амплифицированных фрагментов ДНК:

1. Отец
2. Ребенок
3. Мать

Ребенок унаследовал некоторые, но не все, отпечатки пальцев каждого из своих родителей, что дает ему новый, уникальный отпечаток пальца.

Некоторые методы ПЦР-отпечатков пальцев обладают высокой дискриминационной способностью и могут использоваться для определения генетических отношений между людьми, например, родитель-ребенок или между братьями и сестрами, и используются в тестировании отцовства (рис. 4). Этот метод также может использоваться для определения эволюционных отношений между организмами, когда используются определенные молекулярные часы (например, гены 16S рРНК и recA микроорганизмов). ^[24]

Амплификация и количественная оценка ДНК

Поскольку ПЦР амплифицирует области ДНК, на которые она нацелена, ПЦР может использоваться для анализа чрезвычайно малых количеств образца. Это часто имеет решающее значение для судебно-медицинского анализа , когда в качестве доказательства доступно только следовое количество ДНК. ПЦР также может использоваться для анализа древней ДНК , возраст которой составляет десятки тысяч лет. Эти основанные на ПЦР методы успешно применялись на животных, таких как сорокатысячелетний мамонт , а также на человеческой ДНК, в приложениях, варьирующихся от анализа египетских мумий до идентификации русского царя и тела английского короля Ричарда III . ^[25]

Количественная ПЦР или ПЦР в реальном времени (qPCR, ^[26] не путать с ОТ-ПЦР ) методы позволяют оценить количество данной последовательности, присутствующей в образце — метод, часто применяемый для количественного определения уровней экспрессии генов . Количественная ПЦР является признанным инструментом для количественной оценки ДНК, который измеряет накопление продукта ДНК после каждого раунда амплификации ПЦР.

qPCR позволяет количественно определять и обнаруживать определенную последовательность ДНК в режиме реального времени, поскольку он измеряет концентрацию во время процесса синтеза. Существует два метода одновременного обнаружения и количественного определения. Первый метод заключается в использовании флуоресцентных красителей, которые неспецифически удерживаются между двойными цепями. Второй метод включает зонды, которые кодируют определенные последовательности и флуоресцентно маркированы. Обнаружение ДНК с использованием этих методов можно увидеть только после гибридизации зондов с ее комплементарной ДНК (кДНК). Интересной комбинацией методов является ПЦР в реальном времени и обратная транскрипция. Этот сложный метод, называемый ОТ-кПЦР, позволяет количественно определять небольшое количество РНК. С помощью этого комбинированного метода мРНК преобразуется в кДНК, которая далее количественно определяется с помощью кПЦР. Этот метод снижает вероятность ошибки в конечной точке ПЦР, ^[27] увеличивая шансы обнаружения генов, связанных с генетическими заболеваниями, такими как рак. ^[5] Лаборатории используют ОТ-ПЦР в целях чувствительного измерения регуляции генов. Математические основы для надежной количественной оценки ПЦР ^[28] и ОТ-ПЦР ^[29] облегчают реализацию точных процедур подгонки экспериментальных данных в исследовательских, медицинских, диагностических и инфекционных приложениях. ^{[30] [31] [32] [33]}

Медицинские и диагностические приложения

Будущие родители могут быть проверены на предмет генетических носителей , или их дети могут быть проверены на предмет того, что они действительно поражены болезнью . [ ^2] Образцы ДНК для пренатального тестирования могут быть получены с помощью амниоцентеза , биопсии ворсин хориона или даже путем анализа редких фетальных клеток, циркулирующих в кровотоке матери. Анализ ПЦР также необходим для преимплантационной генетической диагностики , когда отдельные клетки развивающегося эмбриона проверяются на наличие мутаций.

• ПЦР также может использоваться как часть чувствительного теста для типирования тканей , что жизненно важно для трансплантации органов . С 2008 года ^{[обновлять]}даже есть предложение заменить традиционные тесты на основе антител для определения группы крови тестами на основе ПЦР. ^[34]
• Многие формы рака подразумевают изменения в онкогенах . Используя тесты на основе ПЦР для изучения этих мутаций, схемы терапии иногда могут быть индивидуально адаптированы для пациента. ПЦР позволяет проводить раннюю диагностику злокачественных заболеваний, таких как лейкемия и лимфомы , что в настоящее время является наиболее развитым методом в исследовании рака и уже используется в повседневной практике. Анализы ПЦР могут проводиться непосредственно на образцах геномной ДНК для обнаружения злокачественных клеток, специфичных для транслокации, с чувствительностью, которая по крайней мере в 10 000 раз выше, чем у других методов. ^[35] ПЦР очень полезна в медицинской сфере, поскольку она позволяет изолировать и амплифицировать супрессоры опухолей. Например, количественную ПЦР можно использовать для количественной оценки и анализа отдельных клеток, а также для распознавания подтверждений и комбинаций ДНК, мРНК и белков. ^[27]

Применение при инфекционных заболеваниях

ПЦР позволяет проводить быструю и высокоспецифичную диагностику инфекционных заболеваний, включая те, которые вызваны бактериями или вирусами. ^[36] ПЦР также позволяет идентифицировать некультивируемые или медленно растущие микроорганизмы, такие как микобактерии , анаэробные бактерии или вирусы , из анализов культуры тканей и животных моделей . Основой диагностических приложений ПЦР в микробиологии является обнаружение инфекционных агентов и различение непатогенных и патогенных штаммов с помощью специфических генов. ^{[36] [37]}

Характеристика и обнаружение возбудителей инфекционных заболеваний были революционизированы с помощью ПЦР следующим образом:

• Вирус иммунодефицита человека (или ВИЧ ) является сложной целью для обнаружения и искоренения. Самые ранние тесты на инфекцию основывались на наличии антител к вирусу, циркулирующих в кровотоке. Однако антитела появляются только через много недель после заражения, материнские антитела маскируют инфекцию новорожденного, а терапевтические средства для борьбы с инфекцией не влияют на антитела. Были разработаны тесты ПЦР , которые могут обнаружить всего один вирусный геном среди ДНК более 50 000 клеток-хозяев. ^[38] Инфекции можно обнаружить раньше, донорскую кровь можно напрямую проверить на вирус, новорожденных можно немедленно проверить на инфекцию, а эффекты противовирусного лечения можно количественно оценить .
• Некоторые болезнетворные организмы, такие как туберкулез , трудно отобрать у пациентов и медленно выращивать в лаборатории. Тесты на основе ПЦР позволили обнаружить небольшое количество болезнетворных организмов (как живых, так и мертвых) в удобных образцах . Подробный генетический анализ также может быть использован для выявления устойчивости к антибиотикам, что позволяет проводить немедленную и эффективную терапию. Эффект терапии также может быть немедленно оценен.
• Распространение болезнетворного организма в популяциях домашних или диких животных можно отслеживать с помощью ПЦР-тестирования. Во многих случаях можно обнаружить и отслеживать появление новых вирулентных подтипов. Подтипы организма, которые были ответственны за более ранние эпидемии, также можно определить с помощью ПЦР-анализа.
• Вирусную ДНК можно обнаружить с помощью ПЦР. Используемые праймеры должны быть специфичны для целевых последовательностей в ДНК вируса, и ПЦР может использоваться для диагностического анализа или секвенирования ДНК вирусного генома. Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаруживать вирус вскоре после заражения и даже до начала заболевания. ^[36] Такое раннее обнаружение может дать врачам значительное время для начала лечения. Количество вируса (« вирусная нагрузка ») у пациента также можно количественно определить с помощью методов количественного определения ДНК на основе ПЦР (см. ниже). Вариант ПЦР ( ОТ-ПЦР ) используется для обнаружения вирусной РНК, а не ДНК: в этом тесте фермент обратная транскриптаза используется для генерации последовательности ДНК, которая соответствует вирусной РНК; затем эта ДНК амплифицируется согласно обычному методу ПЦР. ОТ-ПЦР широко используется для обнаружения вирусного генома SARS-CoV-2. ^[39]
• Такие заболевания, как коклюш (или судорожный кашель ), вызываются бактериями Bordetella pertussis . Эта бактерия вызывает серьезную острую респираторную инфекцию, которая поражает различных животных и людей и приводит к смерти многих маленьких детей. Токсин коклюша представляет собой белковый экзотоксин, который связывается с клеточными рецепторами двумя димерами и реагирует с различными типами клеток, такими как Т-лимфоциты, которые играют роль в клеточном иммунитете. ^[40] ПЦР является важным инструментом тестирования, который может обнаруживать последовательности в гене токсина коклюша. Поскольку ПЦР имеет высокую чувствительность к токсину и быстрое время выполнения, она очень эффективна для диагностики коклюша по сравнению с культурой. ^[41]

Криминалистические приложения

Разработка протоколов генетической (или ДНК ) дактилоскопии на основе ПЦР нашла широкое применение в судебной экспертизе :

• 

  Образцы ДНК часто берутся на месте преступления и анализируются методом ПЦР.

  В своей наиболее дискриминационной форме генетическая дактилоскопия может однозначно отличать любого человека от всего населения мира . Небольшие образцы ДНК могут быть выделены с места преступления и сравнены с образцами ДНК подозреваемых или с базой данных ДНК более ранних доказательств или осужденных. Более простые версии этих тестов часто используются для быстрого исключения подозреваемых во время уголовного расследования. Доказательства преступлений десятилетней давности могут быть проверены, подтверждая или оправдывая первоначально осужденных людей.
• Судебное ДНК-типирование стало эффективным способом идентификации или оправдания подозреваемых в совершении преступлений благодаря анализу улик, обнаруженных на месте преступления. Геном человека имеет множество повторяющихся областей, которые можно найти в последовательностях генов или в некодирующих областях генома. В частности, до 40% ДНК человека повторяется. ^[5] Существуют две различные категории для этих повторяющихся, некодирующих областей в геноме. Первая категория называется тандемными повторами переменного числа (VNTR), которые имеют длину 10–100 пар оснований, а вторая категория называется короткими тандемными повторами (STR), и они состоят из повторяющихся участков из 2–10 пар оснований. ПЦР используется для амплификации нескольких известных VNTR и STR с использованием праймеров, которые фланкируют каждую из повторяющихся областей. Размеры фрагментов, полученных от любого человека для каждой из STR, укажут, какие аллели присутствуют. Анализируя несколько STR для отдельного человека, будет найден набор аллелей для каждого человека, который статистически, вероятно, будет уникальным. ^[5] Исследователи определили полную последовательность генома человека. Эта последовательность может быть легко доступна через веб-сайт NCBI и используется во многих реальных приложениях. Например, ФБР составило набор участков ДНК-маркеров, используемых для идентификации, и они называются базой данных ДНК комбинированной системы индексации ДНК (CODIS). ^[5] Использование этой базы данных позволяет использовать статистический анализ для определения вероятности того, что образец ДНК будет соответствовать. ПЦР является очень мощным и важным аналитическим инструментом для использования в судебно-медицинском ДНК-типировании, поскольку исследователям нужно только очень небольшое количество целевой ДНК для использования в анализе. Например, один человеческий волос с прикрепленным волосяным фолликулом имеет достаточно ДНК для проведения анализа. Аналогично, несколько сперматозоидов, образцов кожи из-под ногтей или небольшое количество крови могут предоставить достаточно ДНК для окончательного анализа. ^[5]
• Менее дискриминационные формы ДНК-дактилоскопии могут помочь в ДНК-тестировании отцовства , когда человек сопоставляется с его близкими родственниками. ДНК неопознанных человеческих останков может быть проверена и сравнена с ДНК возможных родителей, братьев и сестер или детей. Аналогичное тестирование может быть использовано для подтверждения биологических родителей усыновленного (или похищенного) ребенка. Фактический биологический отец новорожденного также может быть подтвержден (или исключен).
• Было показано, что дизайн ПЦР AMGX/AMGY не только ^{[ требуется разъяснение ]} облегчает амплификацию последовательностей ДНК из очень небольшого количества генома. Однако его также можно использовать для определения пола в реальном времени по образцам костей, полученным в ходе судебно-медицинской экспертизы. Это обеспечивает мощный и эффективный способ определения пола в судебно-медицинских случаях и на древних образцах. ^[42]

Исследовательские приложения

ПЦР применяется во многих областях исследований молекулярной генетики:

• ПЦР позволяет быстро производить короткие фрагменты ДНК, даже если известна не более чем последовательность двух праймеров. Эта способность ПЦР дополняет многие методы, такие как создание гибридизационных зондов для гибридизации Саузерн- или Нозерн-блоттинга . ПЦР обеспечивает эти методы большими объемами чистой ДНК, иногда в виде одной цепи, что позволяет проводить анализ даже из очень малых количеств исходного материала.
• Задача секвенирования ДНК также может быть решена с помощью ПЦР. Известные сегменты ДНК могут быть легко получены от пациента с мутацией генетического заболевания. Модификации метода амплификации могут извлекать сегменты из совершенно неизвестного генома или генерировать только одну нить интересующей области.
• ПЦР имеет многочисленные приложения к более традиционному процессу клонирования ДНК . Она может извлекать сегменты для вставки в вектор из большего генома, который может быть доступен только в небольших количествах. Используя один набор «векторных праймеров», она также может анализировать или извлекать фрагменты, которые уже были вставлены в векторы. Некоторые изменения в протоколе ПЦР могут генерировать мутации (общие или сайт-направленные) вставленного фрагмента.
• Сайты с пометкой последовательности — это процесс, в котором ПЦР используется как индикатор того, что определенный сегмент генома присутствует в определенном клоне. Проект «Геном человека» посчитал это приложение жизненно важным для картирования космидных клонов, которые они секвенировали, и для координации результатов из разных лабораторий.
• Применение ПЦР — филогенетический анализ ДНК из древних источников , таких как обнаруженные в восстановленных костях неандертальцев , в замороженных тканях мамонтов или в мозге египетских мумий. ^[16] В некоторых случаях сильно деградированная ДНК из этих источников может быть повторно собрана на ранних стадиях амплификации.
• Распространенным применением ПЦР является изучение закономерностей экспрессии генов . Ткани (или даже отдельные клетки) можно анализировать на разных стадиях, чтобы увидеть, какие гены стали активными, а какие были выключены. Это приложение также может использовать количественную ПЦР для количественной оценки фактических уровней экспрессии.
• Способность ПЦР одновременно амплифицировать несколько локусов из отдельных сперматозоидов ^[43] значительно улучшила более традиционную задачу генетического картирования путем изучения хромосомных кроссоверов после мейоза . Редкие события кроссинговера между очень близкими локусами были непосредственно обнаружены путем анализа тысяч отдельных сперматозоидов. Аналогичным образом можно анализировать необычные делеции, вставки, транслокации или инверсии, и все это без необходимости ждать (или платить) за длительные и трудоемкие процессы оплодотворения, эмбриогенеза и т. д.
• Сайт-направленный мутагенез : ПЦР может использоваться для создания мутантных генов с мутациями, выбранными учеными по желанию. Эти мутации могут быть выбраны для того, чтобы понять, как белки выполняют свои функции, и изменить или улучшить функцию белка.

Преимущества

ПЦР имеет ряд преимуществ. Она довольно проста в понимании и использовании и быстро дает результаты. Метод очень чувствителен и может производить миллионы или миллиарды копий определенного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. qRT-PCR имеет те же преимущества, что и ПЦР, с дополнительным преимуществом количественной оценки синтезированного продукта. Поэтому она имеет свои применения для анализа изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микробах или других болезненных состояниях. ^[27]

ПЦР является очень мощным и практичным инструментом исследования. Секвенирование неизвестных этиологий многих заболеваний выясняется с помощью ПЦР. Этот метод может помочь идентифицировать последовательность ранее неизвестных вирусов, связанных с уже известными, и, таким образом, дать нам лучшее понимание самого заболевания. Если процедуру можно будет еще больше упростить и разработать чувствительные нерадиометрические системы обнаружения, ПЦР займет видное место в клинической лаборатории на долгие годы вперед. ^[16]

Ограничения

Одним из основных ограничений ПЦР является то, что для генерации праймеров, которые позволят ее селективную амплификацию, необходима предварительная информация о целевой последовательности. ^[27] Это означает, что, как правило, пользователи ПЦР должны знать точную последовательность(и) выше целевой области на каждой из двух одноцепочечных матриц, чтобы гарантировать, что ДНК-полимераза правильно связывается с гибридами праймер-матрица и впоследствии генерирует всю целевую область во время синтеза ДНК. ^{[ необходима цитата ]}

Как и все ферменты, ДНК-полимеразы также подвержены ошибкам, что, в свою очередь, вызывает мутации в образующихся фрагментах ПЦР. ^[44]

Другим ограничением ПЦР является то, что даже самое маленькое количество загрязняющей ДНК может быть амплифицировано, что приведет к вводящим в заблуждение или неоднозначным результатам. Чтобы свести к минимуму вероятность загрязнения, исследователи должны зарезервировать отдельные комнаты для подготовки реагентов, ПЦР и анализа продукта. Реагенты должны быть распределены по одноразовым аликвотам . Следует регулярно использовать пипетки с одноразовыми поршнями и сверхдлинными наконечниками пипеток. ^[16] Более того, рекомендуется убедиться, что лабораторная установка следует однонаправленному рабочему процессу. Никакие материалы или реагенты, используемые в комнатах ПЦР и анализа, никогда не должны переноситься в комнату подготовки ПЦР без тщательной дезактивации. ^[45]

Образцы окружающей среды, содержащие гуминовые кислоты, могут ингибировать амплификацию ПЦР и приводить к неточным результатам. ^{[ необходима цитата ]}

Вариации

• Аллель-специфическая ПЦР или система мутаций, рефрактерных к амплификации (ARMS) : диагностический или клонирующий метод, основанный на однонуклеотидных вариациях (SNV, не путать с SNP ) (различия в одном основании у пациента). Любая мутация, включающая изменение одного основания, может быть обнаружена этой системой. Она требует предварительного знания последовательности ДНК, включая различия между аллелями , и использует праймеры, 3'-концы которых охватывают SNV (буфер пар оснований вокруг SNV, обычно включенный). ^[46] ПЦР-амплификация в строгих условиях гораздо менее эффективна при наличии несоответствия между шаблоном и праймером, поэтому успешная амплификация с праймером, специфичным для SNP, сигнализирует о наличии определенного SNP или небольших делеций в последовательности. ^[47] См. Генотипирование SNP для получения дополнительной информации.
• Сборка ПЦР или полимеразная циклическая сборка (ПЦС) : искусственный синтез длинных последовательностей ДНК путем проведения ПЦР на пуле длинных олигонуклеотидов с короткими перекрывающимися сегментами. Олигонуклеотиды чередуются между смысловыми и антисмысловыми направлениями, а перекрывающиеся сегменты определяют порядок фрагментов ПЦР, тем самым селективно производя конечный длинный продукт ДНК. ^[48]
• Асимметричная ПЦР : предпочтительно амплифицирует одну цепь ДНК в двухцепочечной ДНК-матрице. Используется при секвенировании и гибридизации зондирования, где требуется амплификация только одной из двух комплементарных цепей. ПЦР проводится как обычно, но с большим избытком праймера для цепи, предназначенной для амплификации. Из-за медленной ( арифметической ) амплификации позже в реакции после того, как лимитирующий праймер был израсходован, требуются дополнительные циклы ПЦР. ^[49] Недавняя модификация этого процесса, известная как Линейная -После - Т - Экспоненциальная-ПЦР (LATE-PCR), использует лимитирующий праймер с более высокой температурой плавления ( Tm ) , чем избыточный праймер, для поддержания эффективности реакции, поскольку концентрация лимитирующего праймера уменьшается в середине реакции. ^[50]
• Конвективная ПЦР : псевдоизотермический способ проведения ПЦР. Вместо многократного нагревания и охлаждения смеси ПЦР раствор подвергается воздействию температурного градиента. Результирующий конвективный поток, вызванный тепловой нестабильностью, автоматически перемешивает реагенты ПЦР из горячих и холодных областей, многократно обеспечивая ПЦР. ^[51] Такие параметры, как тепловые граничные условия и геометрия корпуса ПЦР, могут быть оптимизированы для получения надежной и быстрой ПЦР путем использования возникновения хаотических полей потока. ^[52] Такая настройка конвективного потока ПЦР значительно снижает потребляемую мощность устройства и время работы.
• Dial-out PCR : высокопараллельный метод извлечения точных молекул ДНК для синтеза генов. Сложная библиотека молекул ДНК модифицируется уникальными фланкирующими тегами перед массивным параллельным секвенированием. Затем направленные на теги праймеры позволяют извлекать молекулы с желаемыми последовательностями с помощью ПЦР. ^[53]
• Цифровая ПЦР (dPCR) : используется для измерения количества целевой последовательности ДНК в образце ДНК. Образец ДНК сильно разбавлен, так что после проведения множества параллельных ПЦР некоторые из них не получают ни одной молекулы целевой ДНК. Концентрация целевой ДНК рассчитывается с использованием доли отрицательных результатов. Отсюда и название «цифровая ПЦР».
• Хеликаза-зависимая амплификация : похожа на традиционную ПЦР, но использует постоянную температуру, а не циклы денатурации и отжига/расширения. ДНК-хеликаза , фермент, который раскручивает ДНК, используется вместо термической денатурации. ^[54]
• Hot start PCR : метод, который снижает неспецифическую амплификацию на начальных этапах настройки ПЦР. Его можно выполнять вручную, нагревая компоненты реакции до температуры денатурации (например, 95 °C) перед добавлением полимеразы. ^[55] Разработаны специализированные ферментные системы, которые ингибируют активность полимеразы при температуре окружающей среды, либо путем связывания антитела [ ^{13] [56]} , либо за счет присутствия ковалентно связанных ингибиторов, которые диссоциируют только после этапа активации при высокой температуре. Hot-start/cold-finish PCR достигается с помощью новых гибридных полимераз, которые неактивны при температуре окружающей среды и мгновенно активируются при температуре удлинения.
• In silico PCR (цифровая ПЦР, виртуальная ПЦР, электронная ПЦР, e-PCR) относится к вычислительным инструментам, используемым для расчета теоретических результатов полимеразной цепной реакции с использованием заданного набора праймеров ( зондов ) для амплификации последовательностей ДНК из секвенированного генома или транскриптома . In silico PCR была предложена в качестве образовательного инструмента для молекулярной биологии. ^[57]
• Межпоследовательно-специфическая ПЦР (ISSR): метод ПЦР для ДНК-фингерпринтинга, который амплифицирует области между простыми повторами последовательностей для получения уникального отпечатка длин амплифицированных фрагментов. ^[58]
• Обратная ПЦР : обычно используется для идентификации фланкирующих последовательностей вокруг геномных вставок. Она включает в себя ряд переваривания ДНК и самолигирования , что приводит к известным последовательностям на обоих концах неизвестной последовательности. ^[59]
• ПЦР с лигированием : использует небольшие линкеры ДНК, лигированные с интересующей ДНК, и множественные праймеры, отжигающиеся с линкерами ДНК; она использовалась для секвенирования ДНК , геномной прогулки и футпринтинга ДНК . ^[60]
• Methylation-specific PCR (MSP): разработан Стивеном Бейлином и Джеймсом Г. Германом в Медицинской школе Джонса Хопкинса ^[61] и используется для обнаружения метилирования CpG-островков в геномной ДНК. ДНК сначала обрабатывается бисульфитом натрия, который преобразует неметилированные цитозиновые основания в урацил, который распознается праймерами ПЦР как тимин. Затем проводятся две ПЦР на модифицированной ДНК с использованием наборов праймеров, идентичных за исключением любых CpG-островков в последовательностях праймеров. В этих точках один набор праймеров распознает ДНК с цитозинами для амплификации метилированной ДНК, а другой набор распознает ДНК с урацилом или тимином для амплификации неметилированной ДНК. MSP с использованием qPCR также может быть выполнена для получения количественной, а не качественной информации о метилировании.
• Минипраймерная ПЦР : использует термостабильную полимеразу (S-Tbr), которая может удлиняться от коротких праймеров («smalligos») длиной до 9 или 10 нуклеотидов. Этот метод позволяет нацеливать ПЦР на более мелкие области связывания праймеров и используется для амплификации консервативных последовательностей ДНК, таких как ген 16S (или эукариотический 18S) рРНК. ^[62]
• Мультиплексная амплификация зондов, зависимая от лигирования ( MLPA ): позволяет амплифицировать несколько целей с помощью одной пары праймеров, что позволяет избежать ограничений разрешения мультиплексной ПЦР (см. ниже).
• Мультиплексная ПЦР : состоит из нескольких наборов праймеров в одной смеси ПЦР для получения ампликонов разных размеров, специфичных для разных последовательностей ДНК. Нацеливаясь на несколько генов одновременно, можно получить дополнительную информацию из одного тестового запуска, который в противном случае потребовал бы в несколько раз больше реагентов и больше времени для выполнения. Температуры отжига для каждого из наборов праймеров должны быть оптимизированы для правильной работы в рамках одной реакции, а также размеры ампликонов. То есть длина их пар оснований должна быть достаточно разной, чтобы формировать отдельные полосы при визуализации с помощью гель-электрофореза .
• ПЦР с использованием наночастиц (наноПЦР) : некоторые наночастицы (NP) могут повышать эффективность ПЦР (поэтому их называют наноПЦР), а некоторые могут даже превосходить оригинальные усилители ПЦР. Сообщалось, что квантовые точки (КТ) могут повышать специфичность и эффективность ПЦР. Однослойные углеродные нанотрубки (SWCNT) и многослойные углеродные нанотрубки (MWCNT) эффективны в повышении амплификации длинной ПЦР. Углеродный нанопорошок (CNP) может повышать эффективность повторной ПЦР и длинной ПЦР, в то время как оксид цинка , диоксид титана и Ag NP, как было обнаружено, увеличивают выход ПЦР. Предыдущие данные показали, что неметаллические NP сохраняют приемлемую точность амплификации. Учитывая, что многие NP способны повышать эффективность ПЦР, очевидно, что, вероятно, существует большой потенциал для усовершенствования технологии наноПЦР и разработки продукта. ^{[63] [64]}
• Вложенная ПЦР : повышает специфичность амплификации ДНК за счет снижения фона из-за неспецифической амплификации ДНК. Два набора праймеров используются в двух последовательных ПЦР. В первой реакции одна пара праймеров используется для генерации продуктов ДНК, которые помимо предполагаемой цели могут все еще состоять из неспецифически амплифицированных фрагментов ДНК. Затем продукт(ы) используются во второй ПЦР с набором праймеров, сайты связывания которых полностью или частично отличаются от и расположены на 3' каждого из праймеров, используемых в первой реакции. Вложенная ПЦР часто более успешна в специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем обычная ПЦР, но она требует более детального знания целевых последовательностей.
• ПЦР с перекрытием и расширением или сплайсинг с перекрытием и расширением (SOEing) : метод генной инженерии , который используется для сращивания двух или более фрагментов ДНК, содержащих комплементарные последовательности. Он используется для соединения фрагментов ДНК, содержащих гены, регуляторные последовательности или мутации; метод позволяет создавать специфические и длинные конструкции ДНК. Он также может вводить делеции, вставки или точечные мутации в последовательность ДНК. ^{[65] [66]}
• PAN-AC : использует изотермические условия для амплификации и может использоваться в живых клетках. ^{[67] [68]}
• PAN-PCR : вычислительный метод для разработки анализов типирования бактерий на основе данных о последовательности всего генома. ^[69]
• Количественная ПЦР (кПЦР): используется для измерения количества целевой последовательности (обычно в режиме реального времени). Она количественно измеряет начальные количества ДНК, кДНК или РНК. Количественная ПЦР обычно используется для определения наличия последовательности ДНК в образце и количества ее копий в образце. Количественная ПЦР имеет очень высокую степень точности. Методы количественной ПЦР используют флуоресцентные красители, такие как Sybr Green, EvaGreen или ДНК-зонды, содержащие флуорофор , такие как TaqMan , для измерения количества амплифицированного продукта в режиме реального времени. Иногда ее также сокращают до ОТ-ПЦР ( ПЦР в реальном времени ), но эту аббревиатуру следует использовать только для ПЦР с обратной транскрипцией . кПЦР является подходящим сокращением для количественной ПЦР (ПЦР в реальном времени).
• Обратная комплементарная ПЦР (RC-PCR): позволяет добавлять функциональные домены или последовательности по выбору независимо к любому концу сгенерированного ампликона в одной реакции в закрытой пробирке. Этот метод генерирует целевые специфические праймеры в реакции путем взаимодействия универсальных праймеров (содержащих желаемые последовательности или домены для присоединения) и зондов RC.
• Обратная транскрипция ПЦР ( ОТ-ПЦР ) : для амплификации ДНК из РНК. Обратная транскриптаза осуществляет обратную транскрипцию РНК в кДНК , которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. ОТ-ПЦР широко используется в профилировании экспрессии , для определения экспрессии гена или для идентификации последовательности транскрипта РНК, включая сайты начала и окончания транскрипции. Если известна геномная последовательность ДНК гена, ОТ-ПЦР можно использовать для картирования расположения экзонов и интронов в гене. 5'-конец гена (соответствующий сайту начала транскрипции) обычно идентифицируется с помощью RACE-PCR ( быстрая амплификация концов кДНК ).
• РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR): модификация ПЦР, которая использует праймеры с 3'-блоком расширения, который может быть удален термостабильным ферментом РНКаза HII. Эта система уменьшает количество димеров праймеров и позволяет проводить мультиплексные реакции с большим количеством праймеров. ^[70]
• Односпецифическая праймерная ПЦР (SSP-PCR): позволяет амплификацию двухцепочечной ДНК, даже если информация о последовательности доступна только на одном конце. Этот метод позволяет амплификацию генов, для которых доступна только частичная информация о последовательности, и позволяет однонаправленный геномный переход из известных в неизвестные области хромосомы. ^[71]
• Твердофазная ПЦР : охватывает несколько значений, включая амплификацию полониев (где колонии ПЦР получаются, например, в гелевой матрице), мостовую ПЦР ^[72] (праймеры ковалентно связаны с поверхностью твердой подложки), традиционную твердофазную ПЦР (где асимметричная ПЦР применяется в присутствии твердой подложки, несущей праймер с последовательностью, соответствующей одному из водных праймеров) и улучшенную твердофазную ПЦР ^[73] (где традиционную твердофазную ПЦР можно улучшить, используя высокую Tm и вложенный твердый носитель с дополнительным применением термического «шага» для содействия праймированию твердой подложки).
• Suicide PCR : обычно используется в палеогенетике или других исследованиях, где первостепенное значение имеет избежание ложных положительных результатов и обеспечение специфичности амплифицированного фрагмента. Первоначально он был описан в исследовании для проверки наличия микроба Yersinia pestis в образцах зубов, полученных из могил 14 века людей, предположительно убитых чумой во время средневековой эпидемии Черной смерти . ^[74] Метод предписывает использование любой комбинации праймеров только один раз в ПЦР (отсюда и термин «самоубийство»), которая никогда не должна была использоваться в любой положительной контрольной реакции ПЦР, и праймеры всегда должны быть нацелены на геномную область, никогда ранее не амплифицировавшуюся в лаборатории с использованием этого или любого другого набора праймеров. Это гарантирует, что в лаборатории не будет загрязняющей ДНК из предыдущих реакций ПЦР, которая в противном случае могла бы генерировать ложные положительные результаты.
• Термическая асимметричная перемежающаяся ПЦР (TAIL-PCR) : для изоляции неизвестной последовательности, фланкирующей известную последовательность. В пределах известной последовательности TAIL-PCR использует вложенную пару праймеров с различными температурами отжига; вырожденный праймер используется для амплификации в другом направлении от неизвестной последовательности. ^[75]
• Touchdown PCR ( Step-down PCR ): вариант ПЦР, направленный на снижение неспецифического фона путем постепенного снижения температуры отжига по мере прохождения цикла ПЦР. Температура отжига на начальных циклах обычно на несколько градусов (3–5 °C) выше T _m используемых праймеров, тогда как на более поздних циклах она на несколько градусов (3–5 °C) ниже T _m праймера . Более высокие температуры обеспечивают большую специфичность связывания праймера, а более низкие температуры позволяют более эффективную амплификацию из специфических продуктов, образованных во время начальных циклов. ^[76]
• Universal Fast Walking : для геномной прогулки и генетической дактилоскопии с использованием более специфической «двусторонней» ПЦР, чем обычные «односторонние» подходы (использующие только один ген-специфический праймер и один общий праймер, что может привести к артефактному «шуму») ^[77] в силу механизма, включающего формирование структуры лариата. Оптимизированные производные UFW — это LaNe RAGE (зависимая от лариата вложенная ПЦР для быстрой амплификации концов геномной ДНК), ^[78] 5'RACE LaNe ^[79] и 3'RACE LaNe. ^[80]

История

Схематическое изображение примера пары праймеров. Использование праймеров в анализе in vitro для синтеза ДНК стало важным нововведением, позволившим разработать ПЦР.

Термостойкие ферменты, которые являются ключевым компонентом полимеразной цепной реакции, были обнаружены в 1960-х годах как продукт микробной формы жизни, обитавшей в перегретых водах источника Машрум-Спрингс в Йеллоустоуне . ^[81]

В статье 1971 года в журнале « Journal of Molecular Biology» Кьелла Клеппе и его коллег из лаборатории Х. Гобинда Кораны впервые был описан метод использования ферментативного анализа для репликации короткой ДНК-матрицы с праймерами in vitro . ^[82] Однако это раннее проявление основного принципа ПЦР не привлекло особого внимания в то время, и изобретение полимеразной цепной реакции в 1983 году обычно приписывают Кэри Маллису . ^{[83] [ нужна страница ]}

«Baby Blue», прототип аппарата для проведения ПЦР 1986 года

Когда Маллис разработал ПЦР в 1983 году, он работал в Эмеривилле , Калифорния, в Cetus Corporation , одной из первых биотехнологических компаний, где он отвечал за синтез коротких цепочек ДНК. Маллис написал, что идея ПЦР пришла ему в голову во время ночной поездки по шоссе Pacific Coast Highway в своей машине. ^[84] Он играл в уме с новым способом анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда понял, что вместо этого изобрел метод амплификации любого участка ДНК посредством повторяющихся циклов дупликации, управляемых ДНК-полимеразой. В Scientific American Маллис резюмировал процедуру: «Начиная с одной молекулы генетического материала ДНК, ПЦР может генерировать 100 миллиардов подобных молекул за полдень. Реакция проста в исполнении. Для нее требуется не более чем пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла». ^[85] ДНК-дактилоскопия была впервые использована для проверки отцовства в 1988 году. ^[86]

Маллис приписывал использование ЛСД как неотъемлемую часть разработки ПЦР: «Изобрел бы я ПЦР, если бы не принял ЛСД? Я серьезно в этом сомневаюсь. Я мог бы сидеть на молекуле ДНК и наблюдать, как проходят полимеры. Я узнал это частично под воздействием психоделических препаратов». ^[87]

Маллис и биохимик Майкл Смит , разработавшие другие важные способы манипулирования ДНК, ^[1] были совместно удостоены Нобелевской премии по химии в 1993 году, через семь лет после того, как Маллис и его коллеги из Cetus впервые реализовали его предложение на практике. ^[88] Статья Маллиса 1985 года с Р. К. Сайки и Х. А. Эрлихом «Ферментативная амплификация геномных последовательностей β-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии» — изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) — была удостоена награды Citation for Chemical Breakthrough Award от Отдела истории химии Американского химического общества в 2017 году. ^{[89] [2]}

В основе метода ПЦР лежит использование подходящей ДНК-полимеразы, способной выдерживать высокие температуры >90 °C (194 °F), необходимые для разделения двух цепей ДНК в двойной спирали ДНК после каждого цикла репликации . ДНК-полимеразы, первоначально использовавшиеся для экспериментов in vitro , предваряющих ПЦР, не могли выдерживать эти высокие температуры. ^[2] Поэтому ранние процедуры репликации ДНК были очень неэффективными и трудоемкими, и требовали больших количеств ДНК-полимеразы и непрерывной обработки на протяжении всего процесса.

Открытие в 1976 году полимеразы Taq — ДНК-полимеразы , очищенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus , которая в природе обитает в горячих (от 50 до 80 °C (от 122 до 176 °F)) средах ^[14], таких как горячие источники, — проложило путь к кардинальным улучшениям метода ПЦР. ДНК-полимераза, выделенная из T. aquaticus , стабильна при высоких температурах, оставаясь активной даже после денатурации ДНК ^[15] , что устраняет необходимость добавления новой ДНК-полимеразы после каждого цикла. ^[3] Это позволило реализовать автоматизированный процесс амплификации ДНК на основе термоциклера.

Патентные споры

Метод ПЦР был запатентован Кэри Маллисом и передан Cetus Corporation , где Маллис работал, когда изобрел этот метод в 1983 году. Фермент полимераза Taq также был запатентован. Было несколько громких судебных исков, связанных с этим методом, включая безуспешный иск ^[90], поданный DuPont . Швейцарская фармацевтическая компания Hoffmann-La Roche приобрела права на патенты в 1992 году. Последний из коммерческих патентов на ПЦР истек в 2017 году. ^[91]

Связанная с этим патентная битва за фермент полимеразы Taq все еще продолжается ^{[ по состоянию на? ]} в нескольких юрисдикциях по всему миру между Roche и Promega . Юридические споры вышли за рамки сроков действия первоначальных патентов на ПЦР и полимеразу Taq , которые истекли 28 марта 2005 года. ^[92]

Смотрите также

• Биологический портал

• Тестирование на COVID-19
• ДНК-шиппинг
• Изотермическая амплификация, опосредованная петлей
• Техника выбора
• Термус термофильный
• Pfu ДНК-полимераза

Ссылки

1. "Нобелевская премия по химии 1993 года". NobelPrize.org .
2. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA и др. (декабрь 1985 г.). «Ферментативная амплификация геномных последовательностей бета-глобина и анализ сайтов рестрикции для диагностики серповидноклеточной анемии». Science . 230 (4732): 1350–54. Bibcode :1985Sci...230.1350S. doi :10.1126/science.2999980. PMID  2999980.
3. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT и др. (январь 1988 г.). «Праймер-направленная ферментативная амплификация ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы». Science . 239 (4839): 487–91. Bibcode :1988Sci...239..487S. doi :10.1126/science.239.4839.487. PMID  2448875.
4. Enners E, Porta AR (2012). «Определение температур отжига для полимеразной цепной реакции». The American Biology Teacher . 74 (4): 256–60. doi :10.1525/abt.2012.74.4.9. S2CID  86708426.
5. Ninfa A, Ballou D, Benore M (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . США: Wiley. С. 408–10. ISBN 978-0-470-08766-4.
6. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (июнь 1994 г.). «Эффективная амплификация длинных мишеней из клонированных вставок и человеческой геномной ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 91 (12): 5695–99. Bibcode : 1994PNAS...91.5695C. doi : 10.1073 /pnas.91.12.5695 . PMC 44063. PMID  8202550. 
7. Carr AC, Moore SD (2012). Lucia A (ред.). "Надежная количественная оценка полимеразных цепных реакций с использованием глобальной подгонки". PLOS ONE . 7 (5): e37640. Bibcode : 2012PLoSO...737640C. doi : 10.1371/journal.pone.0037640 . PMC 3365123. PMID  22701526 . 
8. Джозеф Сэмбрук, Дэвид В. Рассел (2001). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство (третье изд.). Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-0-87969-576-7.Глава 8: Амплификация ДНК in vitro с помощью полимеразной цепной реакции
9. «Полимеразная цепная реакция (ПЦР)». Национальный центр биотехнологической информации, Национальная медицинская библиотека США.
10. "ПЦР". Центр изучения генетической науки, Университет Юты .
11. Павлов АР, Павлова НВ, Козявкин СА, Слесарев АИ (май 2004). "Последние разработки в оптимизации термостабильных ДНК-полимераз для эффективного применения". Тенденции в биотехнологии . 22 (5): 253–60. doi :10.1016/j.tibtech.2004.02.011. PMID  15109812.
12. Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (ноябрь 1990 г.). «Оптимизация температуры отжига для амплификации ДНК in vitro». Nucleic Acids Research . 18 (21): 6409–12. doi :10.1093/nar/18.21.6409. PMC 332522. PMID  2243783 . 
13. Sharkey DJ, Scalice ER, Christy KG, Atwood SM, Daiss JL (май 1994). «Антитела как термолабильные переключатели: высокотемпературный запуск полимеразной цепной реакции». Bio/Technology . 12 (5): 506–09. doi :10.1038/nbt0594-506. PMID  7764710. S2CID  2885453.
14. Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM (сентябрь 1976 г.). «Полимераза дезоксирибонуклеиновой кислоты из экстремального термофила Thermus aquaticus». Журнал бактериологии . 127 (3): 1550–57. doi : 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. PMC 232952. PMID  8432. 
15. Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD и др. (май 1993 г.). «Высокоуровневая экспрессия, очистка и ферментативная характеристика полноразмерной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и укороченной формы, лишенной экзонуклеазной активности от 5' до 3'». Методы и применение ПЦР . 2 (4): 275–87. doi : 10.1101/gr.2.4.275 . PMID  8324500.
16. Schochetman G, Ou CY, Jones WK (декабрь 1988 г.). «Полимеразная цепная реакция». Журнал инфекционных заболеваний . 158 (6): 1154–57. doi :10.1093/infdis/158.6.1154. JSTOR  30137034. PMID  2461996.
17. Борман, Джон, Шустер, Дэвид, Ли, Ву-бо, Джесси, Джоэл, Раштчиан, Аюб (2000). "ПЦР из проблемных шаблонов" (PDF) . Фокус . 22 (1): 10. Архивировано из оригинала (PDF) 7 марта 2017 г.
18. Bogetto P, Waidne L, Anderson H (2000). "Полезные советы по ПЦР" (PDF) . Focus . 22 (1): 12. Архивировано из оригинала (PDF) 7 марта 2017 г.
19. Biolabs NE. "Q5® High-Fidelity DNA Polymerase | NEB". www.neb.com . Получено 4 декабря 2021 г. .
20. Sze MA, Schloss PD (2019). «Влияние ДНК-полимеразы и количества раундов амплификации в ПЦР на данные о последовательности гена 16S рРНК». mSphere . 4 (3): e00163–19. doi :10.1128/mSphere.00163-19. PMC 6531881 . PMID  31118299. 
21. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS (декабрь 1990 г.). «Формамид может значительно улучшить специфичность ПЦР». Nucleic Acids Research . 18 (24): 7465. doi :10.1093/nar/18.24.7465. PMC 332902. PMID  2259646 . 
22. "Электронная ПЦР". NCBI – Национальный центр биотехнологической информации . Получено 13 марта 2012 г.
23. Павлов AR, Павлова NV, Козявкин SA, Слесарев AI (2006). "Термостабильные ДНК-полимеразы для широкого спектра применений: сравнение надежного гибридного TopoTaq с другими ферментами". В Kieleczawa J (ред.). Секвенирование ДНК II: оптимизация подготовки и очистки . Jones & Bartlett. стр. 241–57. ISBN 978-0-7637-3383-4.
24. Pombert JF, Sistek V, Boissinot M, Frenette M (октябрь 2009 г.). «Эволюционные отношения между стрептококками рода salivarius, выведенные из мультилокусных филогений на основе последовательностей генов 16S рРНК, recA, secA и secY». BMC Microbiology . 9 : 232. doi : 10.1186/1471-2180-9-232 . PMC 2777182 . PMID  19878555. 
25. "Химический синтез, секвенирование и амплификация ДНК (конспекты занятий по MBB/BIO 343)". Университет штата Аризона. Архивировано из оригинала 9 октября 1997 года . Получено 29 октября 2007 года .
26. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M и др. (апрель 2009 г.). «Руководящие принципы MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени» (PDF) . Клиническая химия . 55 (4): 611–22. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID  19246619.
27. Гарибян Л, Авашия Н (март 2013 г.). «Полимеразная цепная реакция». Журнал исследовательской дерматологии . 133 (3): 1–4. doi :10.1038/jid.2013.1. PMC 4102308. PMID  23399825 . 
28. Schnell S, Mendoza C (октябрь 1997). «Теоретическое описание полимеразной цепной реакции». Журнал теоретической биологии . 188 (3): 313–18. Bibcode : 1997JThBi.188..313S. doi : 10.1006/jtbi.1997.0473. PMID  9344735.
29. Schnell S, Mendoza C (21 февраля 1997 г.). «Энзимологические соображения относительно теоретического описания количественной конкурентной полимеразной цепной реакции (QC-PCR)». Журнал теоретической биологии . 184 (4): 433–40. Bibcode : 1997JThBi.184..433S. doi : 10.1006/jtbi.1996.0283. ISSN  0022-5193. PMID  9082073.
30. Беккер С., Бёгер П., Ойльманн Р., Эрнст А. (1 ноября 2000 г.). «Смещение ПЦР в экологическом анализе: исследование количественного анализа Taq нуклеазы в анализе микробных сообществ». Прикладная и экологическая микробиология . 66 (11): 4945–53. Bibcode : 2000ApEnM..66.4945B. doi : 10.1128/AEM.66.11.4945-4953.2000. ISSN  1098-5336. PMC 92404. PMID 11055948  . 
31. Solomon AW, Peeling RW, Foster A, Mabey DC (1 октября 2004 г.). «Диагностика и оценка трахомы». Clinical Microbiology Reviews . 17 (4): 982–1011. doi :10.1128/CMR.17.4.982-1011.2004. ISSN  0893-8512. PMC 523557. PMID 15489358  . 
32. Ramzy RM (апрель 2002 г.). «Последние достижения в области молекулярных диагностических методов для лимфатического филяриатоза человека и их использование в эпидемиологических исследованиях». Труды Королевского общества тропической медицины и гигиены . 96 : S225–29. doi :10.1016/S0035-9203(02)90080-5. PMID  12055843.
33. Sachse K (2003). "Специфичность и эффективность диагностических ПЦР-анализов". В Sachse K, Frey J (ред.). ПЦР-обнаружение микробных патогенов . Методы в молекулярной биологии. Т. 216. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press. стр. 3–29. doi :10.1385/1-59259-344-5:03. ISBN 978-1-59259-344-6. PMID  12512353.
34. Quill E (март 2008 г.). «Медицина. Соответствие крови становится генетическим». Science . 319 (5869): 1478–79. doi :10.1126/science.319.5869.1478. PMID  18339916. S2CID  36945291.
35. Томар Р. (2010). Молекулярные маркеры и биотехнология растений . Pitman Pura, Нью-Дели: New India Publishing Agency. стр. 188. ISBN 978-93-80235-25-7.
36. Cai HY, Caswell JL, Prescott JF (март 2014 г.). «Некультуральные молекулярные методы диагностики бактериальных заболеваний у животных: диагностическая лабораторная перспектива». Ветеринарная патология . 51 (2): 341–50. doi : 10.1177/0300985813511132 . PMID  24569613.
37. Salis AD (2009). "Применение в клинической микробиологии". ПЦР в реальном времени: Текущая технология и применение . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4.
38. Kwok S, Mack DH, Mullis KB, Poiesz B, Ehrlich G, Blair D, et al. (Май 1987). «Идентификация последовательностей вируса иммунодефицита человека с использованием in vitro ферментативной амплификации и обнаружения расщепления олигомеров». Journal of Virology . 61 (5): 1690–94. doi :10.1128/jvi.61.5.1690-1694.1987. PMC 254157 . PMID  2437321. 
39. «Коронавирус: тест il viaggio dei» . Istituto Superiore di Sanità .
40. Finger H, von Koenig CH (1996). Baron S (ред.). Medical Microbiology (4-е изд.). Галвестон, Техас: Медицинское отделение Техасского университета в Галвестоне. ISBN 978-0-9631172-1-2. PMID  21413270.
41. Yeh SH, Mink CM (2012). «Bordetella pertussis и коклюш (коклюш)». Инфекционные заболевания Неттера . С. 11–14. doi :10.1016/B978-1-4377-0126-5.00003-3. ISBN 978-1-4377-0126-5.
42. Алонсо А, Мартин П, Альбарран К, Гарсия П, Гарсия О, де Симон ЛФ и др. (январь 2004 г.). «Конструкции ПЦР в реальном времени для оценки числа копий ядерной и митохондриальной ДНК в криминалистических и древних исследованиях ДНК». Forensic Science International . 139 (2–3): 141–49. doi :10.1016/j.forsciint.2003.10.008. PMID  15040907.
43. Boehnke M, Arnheim N, Li H, Collins FS (июль 1989). «Тонкоструктурное генетическое картирование человеческих хромосом с использованием полимеразной цепной реакции на отдельных сперматозоидах: соображения по экспериментальному дизайну». American Journal of Human Genetics . 45 (1): 21–32. PMC 1683385 . PMID  2568090. 
44. Zhou YH, Zhang XP, Ebright RH (ноябрь 1991 г.). «Случайный мутагенез молекул ДНК размером с ген с помощью ПЦР с Taq ДНК-полимеразой». Nucleic Acids Research . 19 (21): 6052. doi :10.1093/nar/19.21.6052. PMC 329070. PMID  1658751 . 
45. Стурсберг С. (2021). «Создание ПЦР-лаборатории с нуля». INTEGRA Biosciences .
46. Булдук, БК и др. (март 2020 г.). «Новая стратегия ПЦР-системы амплификации-рефрактерных мутаций для скрининга патогенных вариантов MT-TL1 в репозиториях пациентов». Genet Test Mol Biomarkers . 24 (3): 165–170. doi :10.1089/gtmb.2019.0079. PMID  32167396. S2CID  212693790.
47. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N и др. (апрель 1989 г.). «Анализ любой точечной мутации в ДНК. Система мутаций, рефрактерных к амплификации (ARMS)». Nucleic Acids Research . 17 (7): 2503–16. doi :10.1093/nar/17.7.2503. PMC 317639. PMID  2785681. 
48. Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (октябрь 1995 г.). «Одношаговая сборка гена и целой плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Gene . 164 (1): 49–53. doi :10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID  7590320.
49. Иннис МА, Мьямбо КБ, Гельфанд ДХ, Брау МА (декабрь 1988 г.). «Секвенирование ДНК с помощью ДНК-полимеразы Thermus aquaticus и прямое секвенирование ДНК, амплифицированной полимеразной цепной реакцией». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (24): 9436–40. Bibcode : 1988PNAS...85.9436I. doi : 10.1073/pnas.85.24.9436 . PMC 282767. PMID  3200828 . 
50. Pierce KE, Wangh LJ (2007). "Линейная послеэкспоненциальная полимеразная цепная реакция и смежные технологии". Диагностика отдельных клеток . Методы в молекулярной медицине. Т. 132. С. 65–85. doi :10.1007/978-1-59745-298-4_7. ISBN 978-1-58829-578-1. PMID  17876077.
51. Кришнан М. , Угаз В.М., Бернс М.А. (октябрь 2002 г.). «ПЦР в конвекционной ячейке Рэлея-Бенара». Science . 298 (5594): 793. doi :10.1126/science.298.5594.793. PMID  12399582.
52. Priye A, Hassan YA, Ugaz VM (ноябрь 2013 г.). «Микромасштабная хаотическая адвекция обеспечивает надежную конвективную репликацию ДНК». Аналитическая химия . 85 (21): 10536–41. doi :10.1021/ac402611s. PMID  24083802.
53. Schwartz JJ, Lee C, Shendure J (сентябрь 2012 г.). «Точный синтез генов с направленным на теги извлечением молекул ДНК с проверенной последовательностью». Nature Methods . 9 (9): 913–15. doi :10.1038/nmeth.2137. PMC 3433648 . PMID  22886093. 
54. Vincent M, Xu Y, Kong H (август 2004 г.). «Геликазозависимая изотермическая амплификация ДНК». EMBO Reports . 5 (8): 795–800. doi :10.1038/sj.embor.7400200. PMC 1249482. PMID  15247927 . 
55. Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (апрель 1992 г.). «Предотвращение неправильного праймирования перед ПЦР и димеризации праймеров улучшает амплификацию с низким числом копий». Nucleic Acids Research . 20 (7): 1717–23. doi :10.1093/nar/20.7.1717. PMC 312262. PMID  1579465 . 
56. Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD и др. (июнь 1994 г.). «TaqStart Antibody: ПЦР с «горячим стартом», облегчаемая нейтрализующим моноклональным антителом, направленным против Taq DNA polymerase». BioTechniques . 16 (6): 1134–37. PMID  8074881.
57. San Millán RM, Martínez-Ballesteros I, Rementeria A, Garaizar J, Bikandi J (декабрь 2013 г.). "Онлайн-упражнение по разработке и моделированию экспериментов ПЦР и ПЦР-ПДРФ". BMC Research Notes . 6 : 513. doi : 10.1186/1756-0500-6-513 . PMC 4029544. PMID  24314313 . 
58. Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (март 1994). «Геномный дактилоскопический анализ с помощью амплификации полимеразной цепной реакции с простым повтором последовательности (SSR)». Genomics . 20 (2): 176–83. doi :10.1006/geno.1994.1151. PMID  8020964. S2CID  41802285.
59. Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (ноябрь 1988 г.). «Генетические применения обратной полимеразной цепной реакции». Genetics . 120 (3): 621–23. doi :10.1093/genetics/120.3.621. PMC 1203539 . PMID  2852134. 
60. Mueller PR, Wold B (ноябрь 1989). "In vivo footprinting of a muscle Specific Enhancer by ligation mediated PCR". Science . 246 (4931): 780–86. Bibcode :1989Sci...246..780M. doi :10.1126/science.2814500. PMID  2814500.
61. Herman JG , Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (сентябрь 1996 г.). «ПЦР, специфичная для метилирования: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (18): 9821–26. Bibcode : 1996PNAS...93.9821H. doi : 10.1073/pnas.93.18.9821 . PMC 38513. PMID  8790415 . 
62. Isenbarger TA, Finney M, Ríos-Velázquez C, Handelsman J, Ruvkun G (февраль 2008 г.). «Мини-ПЦР, новый объектив для просмотра микробного мира». Applied and Environmental Microbiology . 74 (3): 840–49. Bibcode :2008ApEnM..74..840I. doi :10.1128/AEM.01933-07. PMC 2227730 . PMID  18083877. 
63. Shen C, Yang W, Ji Q, Maki H, Dong A, Zhang Z (ноябрь 2009 г.). "Наблюдение с помощью наноПЦР: различные уровни точности репликации ДНК в полимеразных цепных реакциях, усиленных наночастицами". Nanotechnology . 20 (45): 455103. Bibcode :2009Nanot..20S5103S. doi :10.1088/0957-4484/20/45/455103. PMID  19822925. S2CID  3393115.
64. Шен С (2013). «Обзор технологии полимеразной цепной реакции с использованием наночастиц». Био-нанотехнология . США: Wiley-Blackwell Publishing Ltd. стр. 97–106. doi :10.1002/9781118451915.ch5. ISBN 978-1-118-45191-5.
65. Хортон Р. М., Хант HD, Хо СН, Пуллен Дж. К., Пиз Л. Р. (апрель 1989 г.). «Создание гибридных генов без использования рестриктаз: сплайсинг генов путем перекрытия и расширения». Gene . 77 (1): 61–68. doi :10.1016/0378-1119(89)90359-4. PMID  2744488.
66. Moller S (2006). PCR: Основы . США: Taylor & Francis Group. стр. 144. ISBN 978-0-415-35547-6.
67. Дэвид Ф., Терлотт Э (ноябрь 1998 г.). «[Метод изотермической амплификации генов]» [Метод изотермической амплификации]. Comptes Rendus de l'Académie des Sciences, Série III . 321 (11): 909–14. Бибкод : 1998CRASG.321..909D. дои : 10.1016/S0764-4469(99)80005-5. ПМИД  9879470.
68. Фабрис Давид (сентябрь – октябрь 2002 г.). «Использование топологических топологий ВОПОГ: новое оружие против патогенных агентов» (PDF) . Слияние. Архивировано из оригинала (PDF) 28 ноября 2007 года.(на французском)
69. Yang JY, Brooks S, Meyer JA, Blakesley RR, Zelazny AM, Segre JA и др. (2013). «Pan-PCR, вычислительный метод разработки анализов типирования бактерий на основе данных о последовательности всего генома». Журнал клинической микробиологии . 51 (3): 752–758. doi : 10.1128/jcm.02671-12 . PMC 3592046. PMID  23254127 . 
70. Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA и др. (август 2011 г.). «ПЦР, зависимая от РНКазы H (рПЦР): улучшенная специфичность и обнаружение полиморфизма отдельных нуклеотидов с использованием заблокированных расщепляемых праймеров». BMC Biotechnology . 11 : 80. doi : 10.1186/1472-6750-11-80 . PMC 3224242. PMID  21831278 . 
71. Shyamala V, Ferro-Luzzi Ames G (1993). "Односпецифическая праймерная полимеразная цепная реакция (SSP-PCR) и прогулка по геному". Протоколы ПЦР . Методы в молекулярной биологии. Т. 15. С. 339–48. doi :10.1385/0-89603-244-2:339. ISBN 978-0-89603-244-6. PMID  21400290.
72. Bing DH, Boles C, Rehman FN, Audeh M, Belmarsh M, Kelley B, et al. (1996). "Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes". Труды конференции по генетической идентичности, Седьмой международный симпозиум по идентификации человека . Архивировано из оригинала 7 мая 2001 г.
73. Хан З., Поэттер К., Парк Д.Дж. (апрель 2008 г.). «Усиленная твердофазная ПЦР: механизмы увеличения праймирования с помощью праймеров на твердой подложке». Аналитическая биохимия . 375 (2): 391–93. doi :10.1016/j.ab.2008.01.021. PMID  18267099.
74. Raoult D, Aboudharam G, Crubézy E, Larrouy G, Ludes B, Drancourt M (ноябрь 2000 г.). «Молекулярная идентификация методом «суицидной ПЦР» Yersinia pestis как агента средневековой черной смерти». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 97 (23): 12800–03. Bibcode : 2000PNAS...9712800R. doi : 10.1073/pnas.220225197 . PMC 18844. PMID  11058154 . 
75. Лю YG, Уиттиер RF (февраль 1995 г.). «Термическая асимметричная перемежающаяся ПЦР: автоматическая амплификация и секвенирование фрагментов концов вставок из клонов P1 и YAC для прогулки по хромосоме». Геномика . 25 (3): 674–81. doi :10.1016/0888-7543(95)80010-J. PMID  7759102.
76. Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (июль 1991 г.). «ПЦР 'Touchdown' для обхода ложного праймирования во время амплификации гена». Nucleic Acids Research . 19 (14): 4008. doi :10.1093/nar/19.14.4008. PMC 328507. PMID  1861999 . 
77. Myrick KV, Gelbart WM (февраль 2002 г.). «Универсальная быстрая ходьба для прямого и универсального определения фланкирующей последовательности». Gene . 284 (1–2): 125–31. doi :10.1016/S0378-1119(02)00384-0. PMID  11891053.
78. "Полный текст – LaNe RAGE: новый инструмент для определения фланкирующей последовательности геномной ДНК". www.ejbiotechnology.info . Архивировано из оригинала 16 мая 2008 г. Получено 24 апреля 2008 г.
79. Park DJ (январь 2005 г.). «Новый 5'-концевой мышиный экзон GAPDH, идентифицированный с помощью 5'RACE LaNe». Молекулярная биотехнология . 29 (1): 39–46. doi :10.1385/MB:29:1:39. PMID  15668518. S2CID  45702164.
80. Park DJ (апрель 2004 г.). «3' RACE LaNe: простой и быстрый метод полностью вложенной ПЦР для определения 3'-концевой последовательности кДНК». BioTechniques . 36 (4): 586–88, 590. doi : 10.2144/04364BM04 . PMID  15088375.
81. «Ключевой ингредиент в тестах на коронавирус поступает из озер Йеллоустоуна». Наука . 31 марта 2020 г. Архивировано из оригинала 31 марта 2020 г. Получено 13 мая 2020 г.
82. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (март 1971 г.). «Исследования полинуклеотидов. XCVI. Репарация коротких синтетических ДНК, катализируемая ДНК-полимеразами». Журнал молекулярной биологии . 56 (2): 341–61. doi :10.1016/0022-2836(71)90469-4. PMID  4927950.
83. Rabinow P (1996). Создание ПЦР: История биотехнологии . Чикаго: Издательство Чикагского университета. ISBN 978-0-226-70146-2.
84. Маллис К (1998). Танцы голышом в поле разума . Нью-Йорк: Pantheon Books. ISBN 978-0-679-44255-4.
85. Маллис КБ (апрель 1990 г.). «Необычное происхождение полимеразной цепной реакции». Scientific American . 262 (4): 56–61, 64–65. Bibcode : 1990SciAm.262d..56M. doi : 10.1038/scientificamerican0490-56. PMID  2315679.
86. Patidar M, Agrawal S, Parveen F, Khare P (2015). «Молекулярное понимание слюны в решении споров об отцовстве». Журнал судебной стоматологии . 7 (1): 76–79. doi : 10.4103/0975-1475.150325 . PMC 4330625. PMID  25709326 . 
87. Николс Д., Баркер Э. (2016). «Психоделики». Фармакологические обзоры . 68 (2): 264–355. doi :10.1124/pr.115.011478. PMC 4813425. PMID  26841800 . 
88. "Нобелевская премия по химии 1993 года". NobelPrize.org .
89. "Ссылки на лауреатов премии Chemical Breakthrough Awards 2017". Отдел истории химии . Получено 12 марта 2018 г.
90. "Недавно добавлено".
91. Fore J Jr, Wiechers IR, Cook-Deegan R (3 июля 2006 г.). «Влияние деловой практики, лицензирования и интеллектуальной собственности на разработку и распространение полимеразной цепной реакции: исследование случая». Журнал биомедицинских открытий и сотрудничества . 1 : 7. doi : 10.1186/1747-5333-1-7 . PMC 1523369. PMID  16817955 . 
92. «Советы о том, как выжить в войнах Taq». GEN Genetic Engineering News – Biobusiness Channel . 26 (9). 1 мая 2006 г. Архивировано из оригинала 26 марта 2020 г. Получено 24 апреля 2019 г.

Внешние ссылки

• Патент США на ПЦР Архивировано 16 октября 2011 г. на Wayback Machine
• Что такое эффект плато ПЦР? Видеоурок на YouTube
• История полимеразной цепной реакции из архивов Смитсоновского института