Трансген — это ген , который был перенесен естественным путем или с помощью любого из методов генной инженерии из одного организма в другой. Введение трансгена в процессе, известном как трансгенез , потенциально может изменить фенотип организма. Трансген описывает сегмент ДНК , содержащий последовательность генов, выделенную из одного организма и введенную в другой организм. Этот ненативный сегмент ДНК может либо сохранять способность продуцировать РНК или белок в трансгенном организме, либо изменять нормальную функцию генетического кода трансгенного организма. В общем, ДНК включена в зародышевую линию организма . Например, у высших позвоночных это можно сделать путем инъекции чужеродной ДНК в ядро оплодотворенной яйцеклетки . Этот метод обычно используется для введения генов заболеваний человека или других представляющих интерес генов в линии лабораторных мышей для изучения функций или патологий , связанных с этим конкретным геном.
Конструкция трансгена требует сборки нескольких основных частей. Трансген должен содержать промотор , который представляет собой регуляторную последовательность, определяющую, где и когда трансген активен, экзон , последовательность, кодирующую белок (обычно полученную из кДНК интересующего белка), и стоп-последовательность. Обычно они объединяются в бактериальную плазмиду , а кодирующие последовательности обычно выбираются из трансгенов с ранее известными функциями. [1]
Трансгенные или генетически модифицированные организмы , будь то бактерии, вирусы или грибы, служат многим исследовательским целям. Выведены трансгенные растения , насекомые, рыбы и млекопитающие (в том числе человек). Трансгенные растения, такие как кукуруза и соя, заменили дикие штаммы в сельском хозяйстве некоторых стран (например, США). Ускользание трансгена было зарегистрировано для ГМО-культур с 2001 года и отличалось стойкостью и инвазивностью. Трансгенные организмы ставят этические вопросы и могут вызвать проблемы биобезопасности .
Идея формирования организма в соответствии с конкретными потребностями не является новой наукой. Однако до конца 1900-х годов фермеры и ученые могли выводить новые штаммы растений или организмов только из близкородственных видов, поскольку для того, чтобы потомство могло воспроизводиться, ДНК должна была быть совместима. [ нужна цитата ]
В 1970-х и 1980-х годах учёные преодолели это препятствие, изобретя процедуры объединения ДНК двух совершенно разных видов с помощью генной инженерии . Организмы, полученные с помощью этих процедур, были названы трансгенными. Трансгенез – это то же самое, что и генная терапия в том смысле, что они оба трансформируют клетки для определенной цели. Однако по своим целям они совершенно различны: генная терапия направлена на излечение дефекта клеток, а трансгенез направлен на создание генетически модифицированного организма путем включения конкретного трансгена в каждую клетку и изменения генома . Таким образом, трансгенез изменит зародышевые клетки, а не только соматические клетки, чтобы гарантировать передачу трансгенов потомству при размножении организмов. Трансгены изменяют геном, блокируя функцию гена-хозяина; они могут либо заменить ген хозяина геном, кодирующим другой белок, либо ввести дополнительный ген. [2]
Первый трансгенный организм был создан в 1974 году, когда Энни Чанг и Стэнли Коэн экспрессировали гены Staphylococcus aureus в Escherichia coli . [3] В 1978 году дрожжевые клетки были первыми эукариотическими организмами, подвергшимися переносу генов. [4] Мышиные клетки были впервые трансформированы в 1979 году, а мышиные эмбрионы — в 1980 году. Большинство самых первых трансмутаций осуществлялось путем микроинъекций ДНК непосредственно в клетки. Ученые смогли разработать другие методы трансформации, такие как включение трансгенов в ретровирусы и последующее заражение клеток; использование электроинфузии, при которой электрический ток используется для пропускания чужеродной ДНК через клеточную стенку; биолистика , представляющая собой процедуру попадания пуль ДНК в клетки; а также доставку ДНК в только что оплодотворенную яйцеклетку. [5]
Первые трансгенные животные предназначались только для генетических исследований с целью изучения конкретной функции гена, и к 2003 году были изучены тысячи генов.
Для сельского хозяйства было разработано множество трансгенных растений для производства генетически модифицированных культур , таких как кукуруза, соя, рапсовое масло, хлопок, рис и другие. По состоянию на 2012 год [обновлять]эти ГМО-культуры были посажены на 170 миллионах гектаров по всему миру. [6]
Одним из примеров трансгенных видов растений является золотой рис . В 1997 году только в Юго-Восточной Азии у пяти миллионов детей развилась ксерофтальмия , заболевание, вызванное дефицитом витамина А. [7] Из этих детей четверть миллиона ослепли. [7] Чтобы бороться с этим, ученые использовали биолистику , чтобы вставить ген фитоенсинтазы нарциссов в местные сорта риса Азии . [8] Добавление нарциссов увеличило выработку β-каротина . [8] Продукт представлял собой трансгенный вид риса, богатый витамином А, называемый золотым рисом . Мало что известно о влиянии золотого риса на ксерофтальмию, поскольку кампании против ГМО предотвратили полное коммерческое использование золотого риса в нуждающихся сельскохозяйственных системах. [9]
Ускользание генов генно-инженерных растений посредством гибридизации с дикими сородичами впервые обсуждалось и исследовалось в Мексике [10] и Европе в середине 1990-х годов. Существует мнение, что бегство трансгенов неизбежно, есть даже «некоторые доказательства того, что это происходит». [6] До 2008 года было зарегистрировано несколько случаев. [6] [11]
Образец кукурузы, взятый в 2000 году из Сьерра-Хуареса, Оахака , Мексика, содержал трансгенный промотор 35S, тогда как большой образец, взятый другим методом из того же региона в 2003 и 2004 годах, его не содержал. В образце из другого региона, взятом в 2002 году, также этого не произошло, а в пробах, взятых в 2004 году, это было сделано, что позволяет предположить персистенцию или повторное введение трансгена. [12] Исследование 2009 года обнаружило рекомбинантные белки в 3,1% и 1,8% образцов, чаще всего на юго-востоке Мексики. Импорт семян и зерна из США может объяснить частоту и распространение трансгенов в западно-центральной Мексике, но не на юго-востоке. Кроме того, 5,0% партий семян кукурузы в мексиканских запасах кукурузы содержат рекомбинантные белки, несмотря на мораторий на ГМ-культуры. [13]
В 2011 году трансгенный хлопок был обнаружен в Мексике среди дикого хлопка после 15 лет выращивания ГМО-хлопка. [14]
Трансгенный рапс Brassicus napus , гибридизированный с аборигенным японским видом Brassica rapa , был обнаружен в Японии в 2011 году [15] после того, как был идентифицирован в 2006 году в Квебеке , Канада. [16] Они были устойчивыми в течение шестилетнего периода исследования, без давления селекции гербицидов и несмотря на гибридизацию с дикой формой. Это было первое сообщение об интрогрессии — стабильном включении генов из одного генофонда в другой — устойчивого к гербицидам трансгена Brassica napus в генофонд дикой формы. [17]
Трансгенная полевица ползучая , устойчивая к глифосату , как «одна из первых ветроопыляемых, многолетних и сильно скрещивающихся трансгенных культур», была посажена в 2003 году в рамках большого (около 160 га) полевого испытания в центральном Орегоне недалеко от Мадраса. , Орегон . В 2004 году было обнаружено, что его пыльца достигла дикорастущих популяций полевицы на расстоянии до 14 километров. Перекрестноопыляющийся Agrostis gigantea был обнаружен даже на расстоянии 21 километра. [18] Производитель Scotts Company не смог удалить все генно-инженерные растения, и в 2007 году Министерство сельского хозяйства США оштрафовало Scotts на 500 000 долларов за несоблюдение правил. [19]
Было показано, что долгосрочный мониторинг и контроль конкретного трансгена неосуществим. [20] Европейское управление по безопасности пищевых продуктов опубликовало руководство по оценке рисков в 2010 году. [21]
Генетически модифицированные мыши являются наиболее распространенной моделью животных для трансгенных исследований. [22] Трансгенных мышей в настоящее время используют для изучения различных заболеваний, включая рак, ожирение, болезни сердца, артрит, тревогу и болезнь Паркинсона. [23] Двумя наиболее распространенными типами генетически модифицированных мышей являются нокаутные мыши и онкомические мыши . Нокаутные мыши — это тип мышиной модели, в которой трансгенная вставка используется для нарушения экспрессии существующего гена. Чтобы создать нокаутных мышей, трансген с желаемой последовательностью встраивают в изолированную бластоцисту мыши с помощью электропорации . Затем внутри некоторых клеток естественным образом происходит гомологичная рекомбинация , заменяющая интересующий ген разработанным трансгеном. Благодаря этому процессу исследователи смогли продемонстрировать, что трансген может быть интегрирован в геном животного, выполнять определенную функцию внутри клетки и передаваться будущим поколениям. [24]
Онкомисы — еще один генетически модифицированный вид мышей, созданный путем внедрения трансгенов, которые повышают уязвимость животного к раку. Исследователи рака используют онкомис для изучения профилей различных видов рака, чтобы применить эти знания к исследованиям на людях. [24]
Было проведено множество исследований трансгенеза у Drosophila melanogaster , плодовой мухи. Этот организм уже более 100 лет служит полезной генетической моделью благодаря хорошо изученной модели его развития. Перенос трансгенов в геном дрозофилы осуществлялся с использованием различных методов, включая элемент P , Cre-loxP и вставку ΦC31 . Наиболее практикуемый метод, используемый до сих пор для вставки трансгенов в геном дрозофилы , использует элементы P. Мобильные P-элементы, также известные как транспозоны , представляют собой сегменты бактериальной ДНК, которые транслоцируются в геном без присутствия комплементарной последовательности в геноме хозяина. P-элементы вводятся парами по два, которые фланкируют интересующую область вставки ДНК. Кроме того, P-элементы часто состоят из двух компонентов плазмиды, один из которых известен как транспозаза P-элемента, а другой - остов P-транспозона. Плазмидная часть транспозазы управляет транспозицией основной цепи транспозона P, содержащей интересующий трансген и часто маркер, между двумя концевыми сайтами транспозона. Успех этой вставки приводит к необратимому добавлению интересующего трансгена в геном. Хотя этот метод оказался эффективным, места вставки P-элементов часто неконтролируемы, что приводит к неблагоприятной случайной вставке трансгена в геном дрозофилы . [25]
Чтобы улучшить локализацию и точность трансгенного процесса, был введен фермент, известный как Cre . Cre оказался ключевым элементом в процессе, известном как обмен кассет, опосредованный рекомбиназой (RMCE). Хотя было показано, что он имеет более низкую эффективность трансгенной трансформации, чем транспозазы P-элемента, Cre значительно снижает трудоемкость [ необходимы пояснения ] балансировки случайных вставок P. Cre помогает в целевом трансгенезе интересующего сегмента гена ДНК, поскольку он поддерживает картирование сайтов вставки трансгена, известных как сайты loxP. Эти сайты, в отличие от P-элементов, могут быть специфически вставлены для фланкирования интересующего хромосомного сегмента, способствуя целенаправленному трансгенезу. Транспозаза Cre играет важную роль в каталитическом расщеплении пар оснований, присутствующих в тщательно расположенных сайтах loxP, что позволяет более специфично вставлять интересующую трансгенную донорскую плазмиду. [26]
Чтобы преодолеть ограничения и низкие выходы, которые дают методы трансформации, опосредованные транспозонами и Cre-loxP, недавно был использован бактериофаг ΦC31 . Недавние прорывные исследования включают микроинъекцию интегразы бактериофага ΦC31, которая демонстрирует улучшенную вставку трансгеном больших фрагментов ДНК, которые не могут быть транспонированы только P-элементами. Этот метод включает рекомбинацию сайта прикрепления (attP) в фаге и сайта прикрепления в геноме бактерии-хозяина (attB). По сравнению с обычными методами вставки трансгена P-элемента, ΦC31 интегрирует весь трансгенный вектор, включая бактериальные последовательности и гены устойчивости к антибиотикам. К сожалению, было обнаружено, что наличие этих дополнительных вставок влияет на уровень и воспроизводимость экспрессии трансгена.
Одним из применений в сельском хозяйстве является селективное разведение животных по определенным признакам: трансгенный крупный рогатый скот с увеличенным мышечным фенотипом был получен путем сверхэкспрессии короткой шпилечной РНК, гомологичной мРНК миостатина, с использованием РНК-интерференции. [27] Трансгены используются для производства молока с высоким содержанием белка или шелка из козьего молока. Еще одним сельскохозяйственным применением является селективное разведение животных, устойчивых к болезням, или животных для биофармацевтического производства. [27]
Применение трансгенов является быстро развивающейся областью молекулярной биологии . По состоянию на 2005 год прогнозировалось, что в ближайшие два десятилетия будет создано 300 000 линий трансгенных мышей. [28] Исследователи нашли множество применений трансгенов, особенно в медицинской сфере. Ученые сосредоточены на использовании трансгенов для изучения функций человеческого генома , чтобы лучше понять болезни, адаптации органов животных для трансплантации человеку и производства фармацевтических продуктов , таких как инсулин , гормон роста и факторы, препятствующие свертыванию крови. из молока трансгенных коров. [ нужна цитата ]
По состоянию на 2004 год было известно пять тысяч генетических заболеваний , и возможность лечения этих заболеваний с помощью трансгенных животных, возможно, является одним из наиболее многообещающих применений трансгенов. Существует потенциал использования генной терапии человека для замены мутировавшего гена немутантной копией трансгена для лечения генетического заболевания. Это можно сделать с помощью Cre-Lox или нокаута . Кроме того, генетические нарушения изучаются с использованием трансгенных мышей, свиней, кроликов и крыс. Трансгенные кролики были созданы для изучения наследственных аритмий сердца, поскольку сердце кролика заметно лучше напоминает сердце человека по сравнению с сердцем мыши. [29] [30] Совсем недавно ученые также начали использовать трансгенных коз для изучения генетических нарушений, связанных с фертильностью . [31]
Трансгены могут быть использованы для ксенотрансплантации органов свиней. Путем изучения отторжения ксеноорганов установлено, что острое отторжение пересаженного органа происходит при контакте органа с кровью реципиента за счет распознавания чужеродных антител на эндотелиальных клетках пересаженного органа. Ученые идентифицировали у свиней антиген, вызывающий эту реакцию, и поэтому могут трансплантировать орган без немедленного отторжения путем удаления антигена. Однако позже антиген начинает экспрессироваться, и происходит отторжение. Поэтому проводятся дальнейшие исследования. [ нужна цитация ] Трансгенные микроорганизмы , способные производить каталитические белки или ферменты , которые увеличивают скорость промышленных реакций.
Использование трансгенов у людей в настоящее время чревато проблемами. Трансформация генов в клетки человека еще не доведена до совершенства. Самый известный пример — у некоторых пациентов, у которых развился Т-клеточный лейкоз после лечения Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита (X-SCID). [32] Это объяснили непосредственной близостью вставленного гена к промотору LMO2 , который контролирует транскрипцию протоонкогена LMO2. [33]