Слитые белки или химерные (kī-ˈmir-ik) белки (дословно, сделанные из частей из разных источников) — это белки, созданные путем объединения двух или более генов , которые изначально кодировали отдельные белки. Трансляция этого слитого гена приводит к получению одного или нескольких полипептидов с функциональными свойствами, полученными из каждого из исходных белков. Рекомбинантные слитые белки создаются искусственно с помощью технологии рекомбинантной ДНК для использования в биологических исследованиях или терапии . Химерные или химерные обычно обозначают гибридные белки, сделанные из полипептидов , имеющих разные функции или физико-химические закономерности. Химерные мутантные белки возникают естественным образом, когда сложная мутация , такая как хромосомная транслокация , тандемная дупликация или ретротранспозиция, создает новую кодирующую последовательность, содержащую части кодирующих последовательностей из двух разных генов. Природные слитые белки обычно встречаются в раковых клетках, где они могут функционировать как онкопротеины . Белок слияния bcr-abl является хорошо известным примером онкогенного белка слияния и считается основным онкогенным фактором хронического миелолейкоза .
Некоторые белки слияния объединяют целые пептиды и, следовательно, содержат все функциональные домены исходных белков. Однако другие белки слияния, особенно те, которые встречаются в природе, объединяют только части кодирующих последовательностей и, следовательно, не сохраняют исходные функции родительских генов, которые их сформировали.
Многие целые слияния генов полностью функциональны и все еще могут действовать, заменяя исходные пептиды. Однако некоторые испытывают взаимодействия между двумя белками, которые могут изменять их функции. Помимо этих эффектов, некоторые слияния генов могут вызывать регуляторные изменения , которые изменяют, когда и где действуют эти гены. Для частичных слияний генов перетасовка различных активных участков и связывающих доменов может привести к появлению новых белков с новыми функциями.
Слияние флуоресцентных меток с белками в клетке-хозяине является широко распространенной методикой, используемой в экспериментальных исследованиях клеток и биологии для отслеживания взаимодействия белков в реальном времени. Первая флуоресцентная метка, зеленый флуоресцентный белок (GFP), была выделена из Aequorea victoria и до сих пор часто используется в современных исследованиях. Более поздние производные включают фотоконвертируемые флуоресцентные белки (PCFP), которые были впервые выделены из Anthozoa . Наиболее часто используемой PCFP является флуоресцентная метка Kaede , но разработка Kikume зелено-красной (KikGR) в 2005 году обеспечивает более яркий сигнал и более эффективное фотопреобразование. Преимущество использования флуоресцентных меток PCFP заключается в возможности отслеживать взаимодействие перекрывающихся биохимических путей в реальном времени. Метка изменит цвет с зеленого на красный, как только белок достигнет интересующей точки в пути, и альтернативный цвет белка можно отслеживать на протяжении пути. Эта методика особенно полезна при изучении путей рециркуляции рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR). Судьба переработанных рецепторов G-белка может быть либо отправлена в плазматическую мембрану для переработки, помеченная зеленой флуоресцентной меткой, либо отправлена в лизосому для деградации, помеченная красной флуоресцентной меткой. [1]
Целью создания белков слияния при разработке лекарств является придание свойств каждого из «родительских» белков полученному химерному белку. В настоящее время для медицинского применения доступно несколько химерных белковых препаратов .
Многие химерные белковые препараты представляют собой моноклональные антитела , специфичность которых к целевой молекуле была разработана с использованием мышей, и поэтому изначально они были «мышиными» антителами. Как нечеловеческие белки, мышиные антитела, как правило, вызывают иммунную реакцию при введении людям. Процесс химеризации включает в себя инженерную замену сегментов молекулы антитела, которые отличают его от человеческого антитела. Например, можно ввести человеческие константные домены , тем самым устраняя большую часть потенциально иммуногенных частей препарата, не изменяя его специфичности для предполагаемой терапевтической цели. Номенклатура антител указывает этот тип модификации путем вставки -xi- в непатентованное название (например, abci- xi -mab ). Если части вариабельных доменов также заменяются человеческими частями, получаются гуманизированные антитела. Хотя концептуально они не отличаются от химер, этот тип обозначается с помощью -zu-, например, в dacli- zu -mab . Дополнительные примеры см. в списке моноклональных антител .
Помимо химерных и гуманизированных антител, существуют и другие фармацевтические цели для создания химерных конструкций. Этанерцепт , например, является блокатором TNFα, созданным путем объединения рецептора фактора некроза опухоли (TNFR) с сегментом Fc иммуноглобулина G 1. TNFR обеспечивает специфичность для мишени препарата, а сегмент Fc антитела, как полагают, добавляет стабильности и доставляемости препарата. [2] Дополнительные химерные белки, используемые для терапевтических целей, включают:
Рекомбинантный слитый белок — это белок, созданный с помощью генной инженерии слитого гена. Обычно это включает удаление стоп- кодона из последовательности кДНК, кодирующей первый белок, а затем добавление последовательности кДНК второго белка в рамку с помощью лигирования или ПЦР с перекрывающимся расширением . Затем эта последовательность ДНК будет экспрессироваться клеткой как один белок. Белок может быть сконструирован так, чтобы включать полную последовательность обоих исходных белков или только часть любого из них.
Если две сущности являются белками, часто также добавляются линкерные (или «спейсерные») пептиды, которые повышают вероятность того, что белки будут складываться независимо и вести себя так, как ожидается. Особенно в случае, когда линкеры обеспечивают очистку белка , линкеры в слияниях белков или пептидов иногда конструируются с сайтами расщепления для протеаз или химических агентов, которые обеспечивают высвобождение двух отдельных белков. Этот метод часто используется для идентификации и очистки белков путем слияния белка GST , пептида FLAG или гекса-гис-пептида (6xHis-тег), которые могут быть выделены с помощью аффинной хроматографии с никелевыми или кобальтовыми смолами. Ди- или мультимерные химерные белки могут быть изготовлены с помощью генной инженерии путем слияния с исходными белками пептидных доменов, которые вызывают искусственную ди- или мультимеризацию белка (например, стрептавидиновые или лейциновые молнии ). Слитые белки также могут быть изготовлены с токсинами или антителами, прикрепленными к ним, для изучения развития заболеваний. Промотор гидрогеназы, P SH , изучался путем конструирования слияния промотора P SH -gfp с использованием репортерного гена зеленого флуоресцентного белка ( gfp) . [3]
Новые рекомбинантные технологии позволили улучшить дизайн слитых белков для использования в таких разнообразных областях, как биодетекция, бумажная и пищевая промышленность, а также биофармацевтика. Недавние усовершенствования включали слияние отдельных пептидов или фрагментов белков с областями существующих белков, такими как N и C концы , и, как известно, улучшают следующие свойства: [4]
Самые ранние применения дизайна рекомбинантных белков можно задокументировать в использовании отдельных пептидных меток для очистки белков в аффинной хроматографии . С тех пор были разработаны различные методы дизайна слитых белков для различных применений, от флуоресцентных белковых меток до рекомбинантных препаратов слитых белков. Три наиболее часто используемых метода дизайна включают тандемное слияние, вставку домена и посттрансляционную конъюгацию. [5]
Интересующие белки просто соединены конец в конец посредством слияния N или C концов между белками. Это обеспечивает гибкую мостовую структуру, обеспечивающую достаточно места между партнерами слияния для обеспечения правильного сворачивания . Однако N или C концы пептида часто являются решающими компонентами в получении желаемого образца сворачивания для рекомбинантного белка, делая простое соединение доменов конец в конец неэффективным в этом случае. По этой причине для поддержания функциональности интересующих доменов белка часто необходим белковый линкер. [5]
Эта техника включает слияние последовательных доменов белка путем кодирования желаемых структур в одну полипептидную цепь, но иногда может потребоваться вставка домена в другой домен. Эта техника обычно рассматривается как более сложная для выполнения, чем тандемное слияние, из-за сложности поиска подходящего сайта лигирования в интересующем гене. [5]
Этот метод позволяет объединить белковые домены после рибосомальной трансляции интересующих белков, в отличие от генетического слияния до трансляции, используемого в других рекомбинантных технологиях. [5]
Белковые линкеры помогают в разработке белков слияния, обеспечивая соответствующее расстояние между доменами, поддерживая правильное сворачивание белка в случае, когда взаимодействия N или C концов имеют решающее значение для сворачивания. Обычно белковые линкеры допускают важные взаимодействия доменов, усиливают стабильность и уменьшают стерические помехи, что делает их предпочтительными для использования в разработке белков слияния, даже когда N и C концы могут быть слиты. Три основных типа линкеров — гибкие, жесткие и расщепляемые in vivo. [5] [6]
Гены слияния, возникающие в природе, чаще всего создаются, когда хромосомная транслокация заменяет терминальные экзоны одного гена неповрежденными экзонами из второго гена. Это создает один ген, который может быть транскрибирован , сплайсирован и транслирован для получения функционального белка слияния. Многие важные онкогены , способствующие развитию рака, являются генами слияния, полученными таким образом.
Вот несколько примеров:
Антитела представляют собой гибридные белки, полученные путем рекомбинации V(D)J .
Существуют также редкие примеры природных полипептидов, которые, по-видимому, являются слиянием двух четко определенных модулей, в которых каждый модуль проявляет свою характерную активность или функцию, независимо от другого. Два основных примера: двойная химера PP2C в Plasmodium falciparum (малярийный паразит), в которой каждый модуль PP2C проявляет ферментативную активность протеинфосфатазы 2C, [7] и иммунофилины двойного семейства , которые встречаются в ряде одноклеточных организмов (таких как простейшие паразиты и Flavobacteria ) и содержат полноразмерные циклофилиновые и шаперонные модули FKBP . [8] [9] Эволюционное происхождение такой химеры остается неясным.