Микроскопия

Просмотр объектов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть невооруженным глазом

Изображение пыльцы , полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (ложные цвета)

Микроскопическое исследование в биохимической лаборатории

Микроскопия — это техническая область использования микроскопов для просмотра объектов и областей объектов, которые невозможно увидеть невооруженным глазом (объекты, которые находятся вне диапазона разрешения обычного глаза). ^[1] Существует три хорошо известных направления микроскопии: оптическая , электронная и сканирующая зондовая микроскопия , а также новая область рентгеновской микроскопии . ^{[ требуется ссылка ]}

Оптическая микроскопия и электронная микроскопия включают дифракцию , отражение или преломление электромагнитного излучения /электронных пучков, взаимодействующих с образцом , и сбор рассеянного излучения или другого сигнала для создания изображения. Этот процесс может быть выполнен путем широкопольного облучения образца (например, стандартная световая микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия ) или путем сканирования тонкого пучка по образцу (например, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и сканирующая электронная микроскопия ). Сканирующая зондовая микроскопия включает взаимодействие сканирующего зонда с поверхностью интересующего объекта. Развитие микроскопии произвело революцию в биологии , дало начало области гистологии и поэтому остается важнейшей техникой в ​​науках о жизни и физике . Рентгеновская микроскопия является трехмерной и неразрушающей, что позволяет повторно получать изображения одного и того же образца для исследований in situ или 4D и обеспечивает возможность «увидеть изнутри» изучаемый образец, прежде чем принести его в жертву методам более высокого разрешения. 3D-рентгеновский микроскоп использует технику компьютерной томографии ( микроКТ ), вращая образец на 360 градусов и реконструируя изображения. КТ обычно выполняется с помощью плоскопанельного дисплея. 3D-рентгеновский микроскоп использует ряд объективов, например, от 4X до 40X, и может также включать плоскую панель.

История

Антони ван Левенгук (1632–1723)

Область микроскопии ( оптическая микроскопия ) восходит как минимум к 17 веку. Более ранние микроскопы, однолинзовые увеличительные стекла с ограниченным увеличением, датируются как минимум еще широким распространением использования линз в очках в 13 веке ^[2], но более продвинутые составные микроскопы впервые появились в Европе около 1620 года ^{[3] [4]} Самыми ранними практиками микроскопии являются Галилео Галилей , который в 1610 году обнаружил, что он может близко фокусировать свой телескоп, чтобы рассматривать небольшие объекты крупным планом ^{[5] [6]} и Корнелис Дреббель , который, возможно, изобрел составной микроскоп около 1620 года. ^{[7] [8]} Антони ван Левенгук разработал очень большой простой микроскоп в 1670-х годах и часто считается первым признанным микроскопистом и микробиологом . ^{[9] [10]}

Оптическая микроскопия

Стереомикроскоп

Оптическая или световая микроскопия включает в себя пропускание видимого света, прошедшего через образец или отраженного от него, через одну или несколько линз , чтобы обеспечить увеличенное изображение образца. ^[11] Полученное изображение может быть обнаружено непосредственно глазом, отображено на фотопластинке или захвачено в цифровом виде . Одна линза с ее насадками или система линз и оборудования для получения изображений вместе с соответствующим осветительным оборудованием, предметным столиком и опорой составляют базовый световой микроскоп. Самой последней разработкой является цифровой микроскоп , который использует ПЗС-камеру для фокусировки на интересующем экспонате. Изображение отображается на экране компьютера, поэтому окуляры не нужны. ^[12]

Ограничения

Ограничения стандартной оптической микроскопии ( светлопольной микроскопии ) лежат в трех областях:

• Этот метод позволяет эффективно отображать только темные или сильно преломляющие свет объекты.
• Существует дифракционно-ограниченное разрешение, зависящее от длины волны падающего света; в видимом диапазоне разрешение оптической микроскопии ограничено приблизительно 0,2   микрометра ( см.: микроскоп ), а практический предел увеличения составляет ~1500x. ^[13]
• Расфокусированный свет от точек за пределами фокальной плоскости снижает четкость изображения. ^[14]

Живые клетки, в частности, обычно не имеют достаточного контраста для успешного изучения, поскольку внутренние структуры клетки бесцветны и прозрачны. Наиболее распространенный способ увеличения контраста — окрашивание структур селективными красителями, но это часто подразумевает уничтожение и фиксацию образца. ^[15] Окрашивание также может вносить артефакты , которые являются видимыми структурными деталями, которые вызваны обработкой образца и, таким образом, не являются особенностями образца. В целом, эти методы используют различия в показателе преломления клеточных структур. Светлопольная микроскопия сравнима с просмотром через стеклянное окно: вы видите не стекло, а только грязь на стекле. Разница есть, поскольку стекло является более плотным материалом, и это создает разницу в фазе проходящего через него света. Человеческий глаз не чувствителен к этой разнице в фазе, но были разработаны умные оптические решения, чтобы изменить эту разницу в фазе на разницу в амплитуде (интенсивности света). ^{[ необходима цитата ]}

Методы

Для улучшения контрастности образца или выделения структур в образце необходимо использовать специальные методы. Для повышения контрастности или маркировки образца доступен огромный выбор методов микроскопии.

• Четыре примера методов трансиллюминации, используемых для создания контраста в образце папиросной бумаги . 1,559 мкм/пиксель.
• 
  Освещение в светлом поле , контрастность образца обусловлена ​​поглощением света в образце
• 
  Освещение кросс-поляризованным светом , контраст образца достигается вращением поляризованного света через образец
• 
  Освещение в темном поле , контрастность образца достигается за счет света, рассеянного образцом.
• 
  Фазово-контрастное освещение, контраст образца возникает из-за интерференции различных длин пути света через образец.

Светлое поле

Микроскопия светлого поля является самой простой из всех методов световой микроскопии. Освещение образца осуществляется с помощью проходящего белого света, т. е. он освещается снизу и наблюдается сверху. Ограничения включают низкую контрастность большинства биологических образцов и низкое видимое разрешение из-за размытости материала, находящегося вне фокуса. Простота метода и минимальная подготовка образца являются значительными преимуществами. ^{[ необходима цитата ]}

Косое освещение

Использование косого (сбоку) освещения придает изображению трехмерный вид и может выделить в противном случае невидимые особенности. Более поздняя техника, основанная на этом методе, — это контрастная модуляция Гофмана , система, используемая в инвертированных микроскопах для использования в клеточной культуре. Косое освещение усиливает контраст даже в прозрачных образцах; однако, поскольку свет попадает вне оси, положение объекта будет казаться смещенным при изменении фокуса. Это ограничение делает невозможным использование таких методов, как оптическое секционирование или точное измерение по оси z.

Темное поле

Микроскопия темного поля — это метод улучшения контрастности неокрашенных, прозрачных образцов. ^[16] Освещение темного поля использует тщательно выровненный источник света для минимизации количества непосредственно прошедшего (нерассеянного) света, попадающего в плоскость изображения, собирая только свет, рассеянный образцом. Темное поле может значительно улучшить контрастность изображения — особенно прозрачных объектов — при этом требуя незначительной настройки оборудования или подготовки образца. Однако этот метод страдает от низкой интенсивности света на конечном изображении многих биологических образцов и продолжает страдать от низкого видимого разрешения.

Диатомея под освещением Рейнберга

Освещение Рейнберга — это вариант освещения темного поля, в котором прозрачные цветные фильтры вставляются непосредственно перед конденсором , так что световые лучи при высокой апертуре окрашены иначе, чем при низкой апертуре (т. е. фон образца может быть синим, в то время как объект кажется самосветящимся красным). Возможны и другие цветовые комбинации, но их эффективность весьма изменчива. ^[17]

Дисперсионное окрашивание

Дисперсионное окрашивание — оптическая техника, которая приводит к цветному изображению бесцветного объекта. Это оптическая техника окрашивания, которая не требует никаких красителей или пятен для получения цветового эффекта. Существует пять различных конфигураций микроскопа, используемых в более широкой технике дисперсионного окрашивания. Они включают в себя светлопольное окрашивание по линии Бекке, косое окрашивание, окрашивание по темному полю, фазово-контрастное окрашивание и окрашивание с объективной остановкой дисперсии.

Фазовый контраст

Фазово-контрастная световая микрофотография некальцинированного гиалинового хряща, показывающая хондроциты и органеллы , лакуны и внеклеточный матрикс.

В электронной микроскопии : фазово-контрастное изображение

Более сложные методы покажут пропорциональные различия в оптической плотности. Фазовый контраст — широко используемый метод, который показывает различия в показателе преломления как различия в контрасте. Он был разработан голландским физиком Фрицем Цернике в 1930-х годах (за что он был удостоен Нобелевской премии в 1953 году). Например, ядро ​​клетки будет выглядеть темным на фоне окружающей цитоплазмы. Контраст отличный; однако он не подходит для использования с толстыми объектами. Часто даже вокруг небольших объектов образуется ореол, который скрывает детали. Система состоит из круглого кольца в конденсоре, которое создает конус света. Этот конус накладывается на кольцо аналогичного размера внутри фазового объектива. Каждый объектив имеет кольцо разного размера, поэтому для каждого объектива необходимо выбрать другую настройку конденсора. Кольцо в объективе имеет особые оптические свойства: оно, прежде всего, уменьшает интенсивность прямого света, но, что более важно, оно создает искусственную разность фаз примерно в четверть длины волны. Поскольку физические свойства этого прямого света изменились, происходит интерференция с дифрагированным светом, что приводит к фазово-контрастному изображению. Одним из недостатков фазово-контрастной микроскопии является образование гало (кольцо гало-света).

Дифференциальный интерференционный контраст

Превосходным и гораздо более дорогим является использование интерференционного контраста . Различия в оптической плотности будут проявляться как различия в рельефе. Ядро внутри клетки фактически будет проявляться как глобула в наиболее часто используемой системе дифференциального интерференционного контраста по Жоржу Номарски . Однако следует иметь в виду, что это оптический эффект , и рельеф не обязательно напоминает истинную форму. Контраст очень хороший, и апертуру конденсора можно использовать полностью открытой, тем самым уменьшая глубину резкости и максимизируя разрешение.

Система состоит из специальной призмы ( призма Номарского , призма Волластона ) в конденсоре, которая разделяет свет на обыкновенный и необыкновенный лучи. Пространственная разница между двумя лучами минимальна (меньше максимального разрешения объектива). После прохождения через образец лучи воссоединяются аналогичной призмой в объективе.

В однородном образце нет разницы между двумя лучами, и контраст не создается. Однако вблизи преломляющей границы (например, ядра внутри цитоплазмы) разница между обыкновенным и необыкновенным лучом создаст рельеф на изображении. Дифференциальный интерференционный контраст требует для работы поляризованного источника света ; на пути света должны быть установлены два поляризующих фильтра, один под конденсором (поляризатор), а другой над объективом (анализатор).

Примечание: В случаях, когда оптическая конструкция микроскопа обеспечивает заметное боковое разделение двух лучей, мы имеем дело с классической интерференционной микроскопией , которая не дает рельефных изображений, но, тем не менее, может использоваться для количественного определения массы и толщины микроскопических объектов.

Интерференционное отражение

Дополнительным методом, использующим интерференцию, является интерференционная отражательная микроскопия (также известная как контраст отраженной интерференции, или RIC). Она основана на адгезии клеток к предметному стеклу для получения сигнала интерференции. Если к стеклу не прикреплена ни одна клетка, то интерференции не будет.

Микроскопию интерференционного отражения можно получить, используя те же элементы, что и DIC, но без призм. Кроме того, свет, который обнаруживается, отражается, а не передается, как при использовании DIC.

Флуоресценция

Изображения также могут содержать артефакты . Это конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микрофотография пыльника кресс-салата Таля (часть тычинки ). На снимке, помимо прочего, видна красивая красная текучая воротничковая структура чуть ниже пыльника. Однако неповрежденная тычинка кресс-салата Таля не имеет такого воротничка, это артефакт фиксации: тычинка была срезана ниже рамки изображения, а эпидермис (верхний слой клеток) стебля тычинки отслоился, образовав нехарактерную структуру. Фото: Хейти Павес из Таллиннского технического университета .

Когда определенные соединения освещаются светом высокой энергии, они излучают свет более низкой частоты. Этот эффект известен как флуоресценция . Часто образцы демонстрируют характерное автофлуоресцентное изображение, основанное на их химическом составе.

Этот метод имеет решающее значение в современных науках о жизни, поскольку он может быть чрезвычайно чувствительным, позволяя обнаруживать отдельные молекулы. Многие флуоресцентные красители могут быть использованы для окрашивания структур или химических соединений. Одним из эффективных методов является сочетание антител, связанных с флуорофором, как при иммуноокрашивании . Примерами часто используемых флуорофоров являются флуоресцеин или родамин .

Антитела могут быть созданы специально для химического соединения. Например, одной из часто используемых стратегий является искусственное производство белков на основе генетического кода (ДНК). Затем эти белки можно использовать для иммунизации кроликов, образуя антитела, которые связываются с белком. Затем антитела химически связываются с флуорофором и используются для отслеживания белков в исследуемых клетках.

Высокоэффективные флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), были разработаны с использованием молекулярно-биологического метода слияния генов , процесса, который связывает экспрессию флуоресцентного соединения с экспрессией целевого белка. Этот комбинированный флуоресцентный белок, как правило, нетоксичен для организма и редко мешает функции изучаемого белка. Генетически модифицированные клетки или организмы напрямую экспрессируют флуоресцентно меченые белки, что позволяет изучать функцию исходного белка in vivo .

Рост кристаллов белка приводит к образованию как кристаллов белка, так и кристаллов соли. Оба бесцветны и микроскопичны. Восстановление кристаллов белка требует визуализации, которая может быть сделана с помощью собственной флуоресценции белка или с помощью трансмиссионной микроскопии. Оба метода требуют ультрафиолетового микроскопа, поскольку белки поглощают свет при 280 нм. Белок также будет флуоресцировать примерно при 353 нм при возбуждении светом 280 нм. ^[18]

Поскольку флуоресцентное излучение отличается по длине волны (цвету) от возбуждающего света, идеальное флуоресцентное изображение показывает только интересующую структуру, которая была помечена флуоресцентным красителем. Эта высокая специфичность привела к широкому использованию флуоресцентной световой микроскопии в биомедицинских исследованиях. Различные флуоресцентные красители могут использоваться для окрашивания различных биологических структур, которые затем могут быть обнаружены одновременно, при этом оставаясь специфичными из-за индивидуального цвета красителя.

Чтобы заблокировать возбуждающий свет от попадания на наблюдателя или детектор, необходимы наборы фильтров высокого качества. Обычно они состоят из возбуждающего фильтра, выбирающего диапазон длин волн возбуждения , дихроичного зеркала и эмиссионного фильтра, блокирующего возбуждающий свет. Большинство флуоресцентных микроскопов работают в режиме эпи-освещения (освещение и детектирование с одной стороны образца) для дальнейшего уменьшения количества возбуждающего света, попадающего на детектор.

См. также: флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения Нейробиология

Конфокальный

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия использует сфокусированный лазерный луч (например, 488 нм), который сканирует образец для возбуждения флуоресценции поточечно. Излучаемый свет направляется через точечное отверстие, чтобы предотвратить попадание не сфокусированного света на детектор, обычно фотоумножительную трубку . Изображение строится на компьютере, нанося измеренные интенсивности флуоресценции в соответствии с положением возбуждающего лазера. По сравнению с полным освещением образца, конфокальная микроскопия дает немного более высокое латеральное разрешение и значительно улучшает оптическое секционирование (осевое разрешение). Поэтому конфокальная микроскопия обычно используется там, где важна трехмерная структура.

Подкласс конфокальных микроскопов — микроскопы с вращающимися дисками , которые способны сканировать несколько точек образца одновременно. Соответствующий диск с отверстиями отклоняет свет, находящийся вне фокуса. Детектором света в микроскопе с вращающимися дисками является цифровая камера, обычно EM-CCD или sCMOS .

Двухфотонная микроскопия

Двухфотонный микроскоп также является лазерным сканирующим микроскопом, но вместо ультрафиолетового, синего или зеленого лазерного света для возбуждения используется импульсный инфракрасный лазер . Только в крошечном фокусе лазера интенсивность достаточно высока для генерации флуоресценции путем двухфотонного возбуждения , что означает, что не генерируется внефокусная флуоресценция, и не требуется точечного отверстия для очистки изображения. ^[19] Это позволяет получать изображения глубоко в рассеивающей ткани, где конфокальный микроскоп не сможет эффективно собирать фотоны. ^[20] Двухфотонные микроскопы с широкопольным обнаружением часто используются для функциональной визуализации, например, визуализации кальция , в мозговой ткани. ^[21] Несколько компаний продают их как многофотонные микроскопы , хотя выгоды от использования 3-фотонного вместо 2-фотонного возбуждения незначительны.

Микроскопия с одноплоскостным освещением и флуоресцентная микроскопия с использованием светового листа

Используя плоскость света, сформированную путем фокусировки света через цилиндрическую линзу под узким углом или путем сканирования линии света в плоскости, перпендикулярной оси объектива, можно получить оптические сечения с высоким разрешением. ^{[22] [23] [24]} Освещение одной плоскости или освещение световым листом также достигается с помощью методов формирования луча, включающих многопризменные расширители луча . ^{[25] [26]} Изображения захватываются ПЗС. Эти варианты позволяют получать изображения с очень быстрым и высоким отношением сигнал/шум.

Широкопольная многофотонная микроскопия

Широкопольная многофотонная микроскопия ^{[27] [28] [29] [30]} относится к оптической нелинейной технике визуализации , в которой большая площадь объекта освещается и отображается без необходимости сканирования. Высокая интенсивность требуется для индуцирования нелинейных оптических процессов, таких как двухфотонная флуоресценция или генерация второй гармоники . В сканирующих многофотонных микроскопах высокая интенсивность достигается путем плотной фокусировки света, а изображение получается путем сканирования луча. В широкопольной многофотонной микроскопии высокая интенсивность наилучшим образом достигается с использованием оптически усиленного импульсного лазерного источника для достижения большого поля зрения (~100 мкм). ^{[27] [28] [29]} Изображение в этом случае получается как один кадр с помощью ПЗС-камеры без необходимости сканирования, что делает эту технику особенно полезной для визуализации динамических процессов одновременно по всему интересующему объекту. При широкопольной многофотонной микроскопии частота кадров может быть увеличена до 1000 раз по сравнению с многофотонной сканирующей микроскопией . ^[28] Однако в рассеивающей ткани качество изображения быстро ухудшается с увеличением глубины.

Деконволюция

Флуоресцентная микроскопия — это мощный метод, позволяющий показать специфически маркированные структуры в сложной среде и предоставить трехмерную информацию о биологических структурах. Однако эта информация размывается тем фактом, что при освещении все флуоресцентно маркированные структуры излучают свет, независимо от того, находятся ли они в фокусе или нет. Таким образом, изображение определенной структуры всегда размывается из-за вклада света от структур, которые находятся не в фокусе. Это явление приводит к потере контрастности, особенно при использовании объективов с высокой разрешающей способностью, обычно иммерсионных объективов с высокой числовой апертурой.

Математически смоделированная функция рассеяния точки импульсной терагерцовой лазерной системы визуализации. ^[31]

Однако размытие не вызвано случайными процессами, такими как рассеяние света, а может быть хорошо определено оптическими свойствами формирования изображения в системе формирования изображения микроскопа. Если рассмотреть небольшой источник флуоресцентного света (по сути, яркое пятно), свет, исходящий от этого пятна, распространяется дальше от нашей точки зрения, поскольку пятно становится все более размытым. В идеальных условиях это создает форму «песочных часов» этого точечного источника в третьем (осевом) измерении. Эта форма называется функцией рассеяния точки (ФРТ) системы формирования изображения микроскопа. Поскольку любое флуоресцентное изображение состоит из большого количества таких небольших источников флуоресцентного света, говорят, что изображение «свернуто функцией рассеяния точки». Математически смоделированная ФРТ терагерцовой лазерной импульсной системы формирования изображения показана справа.

Выходные данные системы формирования изображений можно описать с помощью уравнения:

${\displaystyle s(x,y)=PSF(x,y)*o(x,y)+n}$

Где n — аддитивный шум. ^[32] Знание этой функции рассеяния точки ^[33] означает, что можно обратить этот процесс в определенной степени с помощью компьютерных методов, обычно известных как деконволюционная микроскопия. ^[34] Существуют различные алгоритмы для 2D- или 3D-деконволюции. Их можно грубо классифицировать на невосстановительные и восстановительные методы. В то время как невосстановительные методы могут улучшить контрастность, удаляя не сфокусированный свет из фокальных плоскостей, только восстановительные методы могут фактически переназначить свет в его надлежащее место происхождения. Обработка флуоресцентных изображений таким образом может быть преимуществом по сравнению с прямым получением изображений без не сфокусированного света, таких как изображения с конфокальной микроскопии , поскольку световые сигналы, которые в противном случае были бы устранены, становятся полезной информацией. Для 3D-деконволюции обычно предоставляют серию изображений, полученных из разных фокальных плоскостей (называемых Z-стеком), плюс знание PSF, которое может быть получено либо экспериментально, либо теоретически из знания всех вносящих вклад параметров микроскопа.

Методы субдифракции

Пример микроскопии сверхвысокого разрешения. Изображение Her3 и Her2 , мишени препарата Трастузумаб для лечения рака молочной железы , внутри раковой клетки.

В последнее время было разработано множество методов микроскопии сверхвысокого разрешения, которые позволяют обойти дифракционный предел .

Это в основном достигается путем многократного получения изображения достаточно статического образца и либо изменения возбуждающего света, либо наблюдения за стохастическими изменениями в изображении. Методы деконволюции, описанные в предыдущем разделе, которые удаляют размытость, вызванную PSF, и назначают математически «правильное» происхождение света, используются, хотя и с несколько иным пониманием того, что означает значение пикселя. Предполагая, что в большинстве случаев один флуорофор вносит вклад в одиночный блоб на одном отдельном снятом изображении, блобы на изображениях можно заменить их вычисленным положением, значительно улучшая разрешение до уровня, значительно ниже дифракционного предела.

Для реализации такого предположения в основе этих методов лежат знания и химический контроль фотофизики флуорофоров, с помощью которых достигается разрешение ~20 нанометров. ^{[35] [36]}

Последовательная амплифицированная микроскопия с временным кодированием

Микроскопия с последовательным временным кодированием и усилением (STEAM) — это метод визуализации, который обеспечивает сверхбыструю скорость затвора и частоту кадров, используя оптическое усиление изображения для обхода фундаментального компромисса между чувствительностью и скоростью, а также однопиксельный фотодетектор для устранения необходимости в детекторной матрице и ограничениях по времени считывания ^[37]. Метод по крайней мере в 1000 раз быстрее, чем современные камеры CCD и CMOS . Следовательно, он потенциально полезен для научных, промышленных и биомедицинских приложений, требующих высокой скорости получения изображений, включая диагностику в реальном времени и оценку ударных волн, микрофлюидики , MEMS и лазерной хирургии . ^[38]

Расширения

Большинство современных приборов предоставляют простые решения для микрофотографии и записи изображений в электронном виде. Однако такие возможности не всегда присутствуют, и более опытный микроскопист может предпочесть нарисованное от руки изображение фотографии. Это связано с тем, что микроскопист со знанием предмета может точно преобразовать трехмерное изображение в точный двухмерный рисунок. Однако в фотографии или другой системе захвата изображения только одна тонкая плоскость всегда находится в хорошем фокусе. ^{[ необходима цитата ]}

Создание точных микрографий требует микроскопической техники с использованием монокулярного окуляра. Важно, чтобы оба глаза были открыты, а глаз, который не смотрит вниз в микроскоп, был сосредоточен на листе бумаги на столе рядом с микроскопом. С практикой и без перемещения головы или глаз можно точно прослеживать наблюдаемые формы, одновременно «видя» кончик карандаша на микроскопическом изображении. ^{[ необходима цитата ]}

Всегда менее утомительно наблюдать, когда микроскоп сфокусирован так, что изображение видно на бесконечности, и оба глаза всегда открыты. ^{[ необходима цитата ]}

Другие улучшения

Микроспектроскопия:спектроскопия с микроскопом

рентген

Поскольку разрешение зависит от длины волны света. Электронная микроскопия была разработана с 1930-х годов, в которой вместо света используются электронные пучки. Из-за гораздо меньшей длины волны электронного пучка разрешение намного выше.

Хотя и менее распространенная, рентгеновская микроскопия также была разработана с конца 1940-х годов. Разрешение рентгеновской микроскопии находится между разрешением световой микроскопии и электронной микроскопии.

Электронная микроскопия

До изобретения субдифракционной микроскопии длина волны света ограничивала разрешение традиционной микроскопии примерно до 0,2 микрометра. Для получения более высокого разрешения в электронных микроскопах используется электронный луч с гораздо меньшей длиной волны.

• Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) очень похожа на составной световой микроскоп, посылая электронный луч через очень тонкий срез образца. Предел разрешения в 2005 году составлял около 0,05 ^{[ сомнительно – обсудить ]} нанометра и с тех пор существенно не увеличивался.
• Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) визуализирует детали на поверхности образцов и дает очень хорошее 3D-изображение. Она дает результаты, очень похожие на результаты стереосветового микроскопа. Наилучшее разрешение для СЭМ в 2011 году составило 0,4 нанометра.

Электронные микроскопы, оборудованные для рентгеновской спектроскопии, могут обеспечить качественный и количественный элементный анализ. Этот тип электронного микроскопа, также известный как аналитический электронный микроскоп, может быть очень мощным инструментом для исследования наноматериалов . [ ^39]

Сканирующая зондовая микроскопия

Это метод субдифракции. Примерами сканирующих зондовых микроскопов являются атомно-силовой микроскоп (АСМ), сканирующий туннельный микроскоп , фотонный силовой микроскоп и микроскоп с возвратным отслеживанием . Все такие методы используют физический контакт твердого зондового наконечника для сканирования поверхности объекта, которая должна быть почти плоской.

Ультразвуковая сила

Ультразвуковая силовая микроскопия (UFM) была разработана для улучшения деталей и контрастности изображения на «плоских» интересующих областях, где изображения AFM ограничены по контрастности. Сочетание AFM-UFM позволяет генерировать акустическое микроскопическое изображение ближнего поля. Наконечник AFM используется для обнаружения ультразвуковых волн и преодолевает ограничение длины волны, которое возникает в акустической микроскопии. Используя упругие изменения под наконечником AFM, можно генерировать изображение с гораздо большей детализацией, чем топография AFM.

Ультразвуковая силовая микроскопия позволяет проводить локальное картирование упругости в атомно-силовой микроскопии путем приложения ультразвуковой вибрации к кантилеверу или образцу. Для количественного анализа результатов ультразвуковой силовой микроскопии выполняется измерение кривой сила-расстояние с применением ультразвуковой вибрации к основанию кантилевера, а результаты сравниваются с моделью динамики кантилевера и взаимодействия зонда с образцом, основанной на методе конечных разностей.

Ультрафиолетовая микроскопия

Ультрафиолетовые микроскопы имеют две основные цели. Первая заключается в использовании более короткой длины волны ультрафиолетовой электромагнитной энергии для улучшения разрешения изображения сверх предела дифракции стандартных оптических микроскопов. Этот метод используется для неразрушающего контроля устройств с очень маленькими характеристиками, такими как те, которые встречаются в современных полупроводниках. Второе применение УФ-микроскопов — это усиление контраста, при котором реакция отдельных образцов усиливается по сравнению с их окружением из-за взаимодействия света с молекулами внутри самого образца. Одним из примеров является рост кристаллов белка . Кристаллы белка образуются в солевых растворах. Поскольку кристаллы соли и белка образуются в процессе роста и оба обычно прозрачны для человеческого глаза, их нельзя различить с помощью стандартного оптического микроскопа. Поскольку триптофан белка поглощает свет на длине волны 280 нм, визуализация с помощью УФ-микроскопа с полосовыми фильтрами 280 нм упрощает различение двух типов кристаллов. Кристаллы белка кажутся темными, а кристаллы соли — прозрачными.

Инфракрасная микроскопия

Термин «инфракрасная микроскопия» относится к микроскопии, выполняемой на инфракрасных длинах волн. В типичной конфигурации прибора инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье (FTIR) объединен с оптическим микроскопом и инфракрасным детектором . Инфракрасный детектор может быть одноточечным детектором, линейной решеткой или двумерной решеткой фокальной плоскости. FTIR обеспечивает возможность выполнять химический анализ с помощью инфракрасной спектроскопии , а микроскоп и точечный или матричный детектор позволяют выполнять этот химический анализ с пространственным разрешением, т. е. в различных областях образца. Таким образом, этот метод также называется инфракрасной микроспектроскопией ^{[40] [41]} Альтернативная архитектура, называемая лазерной прямой инфракрасной визуализацией (LDIR), включает в себя комбинацию настраиваемого источника инфракрасного света и одноточечного детектора на летающем объективе. Этот метод часто используется для инфракрасной химической визуализации , где контраст изображения определяется реакцией отдельных областей образца на определенные длины волн ИК, выбранные пользователем, обычно это определенные полосы поглощения ИК и связанные с ними молекулярные резонансы . Ключевым ограничением обычной инфракрасной микроспектроскопии является то, что пространственное разрешение ограничено дифракцией . В частности, пространственное разрешение ограничено числом, связанным с длиной волны света. Для практических ИК-микроскопов пространственное разрешение ограничено 1-3-кратной длиной волны, в зависимости от конкретной методики и используемого инструмента. Для длин волн среднего ИК-диапазона это устанавливает практический предел пространственного разрешения ~3-30 мкм.

Существуют также ИК-версии субдифракционной микроскопии. ^{[40] [41]} К ним относятся ИК- сканирующий оптический микроскоп ближнего поля (NSOM) , ^[42] фототермическая микроспектроскопия и инфракрасная спектроскопия на основе атомно-силового микроскопа (AFM-IR) , а также сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля рассеивающего типа (s-SNOM) ^[43] и нано-FTIR , которые обеспечивают наномасштабное пространственное разрешение на длинах волн ИК.

Цифровая голографическая микроскопия

Клетки человека, полученные с помощью фазового сдвига DHM (слева) и фазово-контрастной микроскопии (справа)

В цифровой голографической микроскопии (DHM) интерферирующие волновые фронты от когерентного (монохроматического) источника света регистрируются на датчике. Изображение восстанавливается в цифровом виде компьютером из записанной голограммы . Помимо обычного светлопольного изображения, создается изображение со сдвигом фаз .

DHM может работать как в режиме отражения, так и в режиме пропускания. В режиме отражения изображение сдвига фазы обеспечивает относительное измерение расстояния и, таким образом, представляет собой топографическую карту отражающей поверхности. В режиме пропускания изображение сдвига фазы обеспечивает количественное измерение оптической толщины образца без использования меток. Изображения сдвига фазы биологических клеток очень похожи на изображения окрашенных клеток и успешно анализируются с помощью программного обеспечения для анализа высокого содержания .

Уникальной особенностью DHM является возможность настройки фокуса после записи изображения, поскольку все плоскости фокусировки записываются голограммой одновременно. Эта особенность позволяет получать изображения движущихся частиц в объеме или быстро сканировать поверхность. Еще одной привлекательной особенностью является способность DHM использовать недорогую оптику путем коррекции оптических аберраций программным обеспечением.

Цифровая патология (виртуальная микроскопия)

Цифровая патология — это информационная среда на основе изображений, поддерживаемая компьютерной технологией, которая позволяет управлять информацией, полученной с цифрового слайда. Цифровая патология частично поддерживается виртуальной микроскопией , которая представляет собой практику преобразования стеклянных слайдов в цифровые слайды, которые можно просматривать, управлять и анализировать.

Лазерная микроскопия

Лазерная микроскопия — это быстрорастущая область, которая использует источники лазерного освещения в различных формах микроскопии. ^[44] Например, лазерная микроскопия, ориентированная на биологические приложения, использует ультракороткие импульсные лазеры в ряде методов, обозначенных как нелинейная микроскопия, микроскопия насыщения и микроскопия двухфотонного возбуждения . ^[45]

Высокоинтенсивные, короткоимпульсные лабораторные рентгеновские лазеры разрабатываются уже несколько лет. Когда эта технология будет реализована, станет возможным получать увеличенные трехмерные изображения элементарных биологических структур в живом состоянии в точно определенный момент времени. Для оптимального контраста между водой и белком и для лучшей чувствительности и разрешения лазер должен быть настроен вблизи линии азота на уровне около 0,3 нанометров. Разрешение будет ограничено в основном гидродинамическим расширением, которое происходит при регистрации необходимого количества фотонов. ^[46] Таким образом, в то время как образец разрушается под воздействием, его конфигурацию можно запечатлеть до того, как он взорвется. ^{[47] [48] [49] [50] [51] [52] [ чрезмерное цитирование ]}

Ученые работали над практическими разработками и прототипами рентгеновских голографических микроскопов, несмотря на длительную разработку соответствующего лазера. ^{[53] [ 54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [ чрезмерное цитирование ]}

Фотоакустическая микроскопия

Фотоакустическая микрофотография эритроцитов человека.

Метод микроскопии, основанный на фотоакустическом эффекте , ^[61] т. е. генерации (ультра)звука, вызванной поглощением света. Сфокусированный и модулированный по интенсивности лазерный луч растрово сканируется по образцу. Сгенерированный (ультра)звук обнаруживается с помощью ультразвукового преобразователя. Обычно используются пьезоэлектрические ультразвуковые преобразователи. ^[62]

Контрастность изображения связана с коэффициентом поглощения образца . Это контрастирует с микроскопией светлого или темного поля, где контрастность изображения обусловлена ​​пропусканием или рассеиванием. В принципе, контрастность флуоресцентной микроскопии также пропорциональна поглощению образца. Однако во флуоресцентной микроскопии квантовый выход флуоресценции должен быть не равен нулю, чтобы сигнал мог быть обнаружен. Однако в фотоакустической микроскопии каждое поглощающее вещество дает фотоакустический сигнал, который пропорционален ${\displaystyle \alpha }$ ${\displaystyle \eta _{fl}}$ ${\displaystyle PA}$

${\displaystyle PA\propto \alpha *\Gamma *((1-\eta _{fl})*E_{g}+(E_{laser}-E_{g}))}$

Здесь — коэффициент Грюнайзена, — энергия фотона лазера, — энергия запрещенной зоны образца. Таким образом, фотоакустическая микроскопия, по-видимому, хорошо подходит в качестве дополнительной техники к флуоресцентной микроскопии, поскольку высокий квантовый выход флуоресценции приводит к высоким сигналам флуоресценции, а низкий квантовый выход флуоресценции приводит к высоким фотоакустическим сигналам. ${\displaystyle \Gamma }$ ${\displaystyle E_{laser}}$ ${\displaystyle E_{g}}$

Пренебрегая нелинейными эффектами, боковое разрешение dx ограничивается дифракционным пределом Аббе :

${\displaystyle dx=\lambda /(2*NA)}$

где — длина волны возбуждающего лазера, а NA — числовая апертура объектива. Дифракционный предел Аббе имеет место, если фронт входящей волны параллелен. Однако в действительности профиль лазерного луча является гауссовым. Поэтому для расчета достижимого разрешения необходимо использовать формулы для усеченных гауссовых пучков. ^[63] ${\displaystyle \lambda }$

Любительская микроскопия

Любительская микроскопия — это исследование и наблюдение за биологическими и небиологическими образцами в рекреационных целях. Коллекционеры минералов , насекомых , ракушек и растений могут использовать микроскопы в качестве инструментов для обнаружения особенностей, которые помогут им классифицировать собранные ими предметы. Другие любители могут быть заинтересованы в наблюдении за жизнью, обнаруженной в воде пруда, и за другими образцами. Микроскопы также могут оказаться полезными для оценки качества воды для людей, которые держат домашний аквариум. Фотодокументирование и рисование микроскопических изображений — дополнительные удовольствия. Существуют конкурсы по искусству микрофотографии . Участники этого времяпрепровождения могут использовать коммерчески подготовленные микроскопические слайды или готовить свои собственные слайды.

Хотя микроскопия является центральным инструментом в документировании биологических образцов, ее часто недостаточно для обоснования описания нового вида на основе одних только микроскопических исследований. Часто для подтверждения открытия нового вида необходимы генетические и биохимические тесты. Лаборатория и доступ к академической литературе являются необходимостью. Однако есть одно преимущество, которое есть у любителей перед профессионалами: время для изучения своего окружения. Часто продвинутые любители объединяются с профессионалами, чтобы подтвердить свои выводы и, возможно, описать новые виды.

В конце 1800-х годов любительская микроскопия стала популярным хобби в Соединенных Штатах и ​​Европе. Нескольким «профессиональным любителям» платили за их поездки за образцами и микроскопические исследования филантропы, чтобы они развлекались в воскресенье днем ​​(например, специалисту по диатомовым водорослям А. Грунову платил (среди прочих) бельгийский промышленник). Профессор Джон Фин опубликовал «Практические советы по выбору и использованию микроскопа (второе издание, 1878 г.)», а также был редактором «Американского журнала микроскопии».

Примеры изображений, полученных с помощью любительской микроскопии:

• 
  "домашняя пчела" Рот 100X
• 
  Рисовый стебель cs 400X
• 
  Семенник кролика 100X
• 
  Папоротник Проталлиум 400X

Применение в судебной экспертизе

Микроскопия имеет применение в судебной медицине. ^[64] Микроскоп может обнаруживать, разрешать и отображать мельчайшие предметы доказательств, часто без каких-либо изменений или разрушений. Микроскоп используется для идентификации и сравнения волокон, волос, почвы и пыли... и т. д.

В случае чернильных отметин, пятен крови или пуль обработка образца не требуется, и доказательства проявляются непосредственно при микроскопическом исследовании. В случае следов веществ подготовка образца должна быть выполнена до проведения микроскопического исследования. ^{[ необходимо уточнение ]}

Световые микроскопы наиболее широко используются в судебной экспертизе, поскольку для формирования изображений используются фотоны. Наиболее применимыми для изучения судебно-медицинских образцов являются следующие микроскопы: ^[65]

1. Сложный микроскоп

2. Сравнительный микроскоп

3. Стереоскопический микроскоп

4. Поляризационный микроскоп

5. Микроспектрофотометр

Такое разнообразие типов микроскопов, используемых в судебной экспертизе, обусловлено в основном их диапазонами увеличения, которые составляют (1-1200X), (50-30 000X) и (500-250 000X) для оптической микроскопии, СЭМ и ТЭМ соответственно. ^[65]

Смотрите также

• Перечень методов анализа материалов
• Цифровой микроскоп
• Цифровая патология
• Микроскопия с циклическим изображением
• Коррекция бесконечности
• Интерферометрическая микроскопия
• Освещение по Кёлеру
• Список микроскопистов
• Микроденситометр
• Хронология развития микроскопической технологии
• Микроскопия с двухфотонным возбуждением
• USB-микроскоп
• Микроскопы Ван Левенгука
• Микроскопическое открытие микробной жизни (микроорганизмов) Ван Левенгуком

Ссылки

1. Эдинбургский университет (6 марта 2018 г.). «Что такое микроскопия?». Эдинбургский университет . Архивировано из оригинала 10 апреля 2018 г. Получено 9 апреля 2018 г.
2. Atti Della Fondazione Джорджио Ронки E Contributi Dell'Istituto Nazionale Di Ottica, Том 30, La Fondazione-1975, стр. 554
3. Альберт Ван Хелден; Свен Дюпре; Роб ван Гент (2010). Происхождение телескопа. Издательство Амстердамского университета. п. 24. ISBN 978-90-6984-615-6. Архивировано из оригинала 15 февраля 2017 года.
4. Уильям Розенталь, Очки и другие средства для улучшения зрения: история и руководство по коллекционированию, Norman Publishing, 1996, стр. 391 - 392
5. Роберт Д. Уэрта, Гиганты Дельфта: Иоганн Вермеер и натурфилософы: параллельный поиск знаний в эпоху открытий, Bucknell University Press - 2003, стр. 126
6. А. Марк Смит, От зрения к свету: переход от древней к современной оптике, Издательство Чикагского университета - 2014, стр. 387
7. Рэймонд Дж. Сигер, Люди физики: Галилео Галилей, его жизнь и его труды, Elsevier - 2016, стр. 24
8. Дж. Уильям Розенталь, Очки и другие средства для улучшения зрения: история и руководство по коллекционированию, Norman Publishing, 1996, стр. 391
9. Форд, Брайан Дж. (1992). «От дилетанта к прилежному экспериментатору: переоценка Левенгука как микроскописта и исследователя». История биологии . 5 (3). Архивировано из оригинала 2021-04-19 . Получено 2021-04-16 .
10. Лейн, Ник (6 марта 2015 г.). «Невидимый мир: размышления о Левенгуке (1677) «О маленьком животном». Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci . 2015 г., апрель; 370 (1666): 20140344. [doi:10.1098/rstb.2014.0344]
11. Abramowitz M, Davidson MW (2007). "Введение в микроскопию". Молекулярные выражения . Архивировано из оригинала 2021-04-27 . Получено 2007-08-22 .
12. "Микроскоп - составной, числовой апертурный и иммерсионный микроскоп | Britannica". www.britannica.com . Архивировано из оригинала 2023-06-22 . Получено 2023-06-22 .
13. Эббе, Э. (1874) Вклад в теорию микроскопа и природу микроскопического зрения. Proc. Bristol Nat. Soc. 1, 200–261.
14. Pawley JB (редактор) (2006). Справочник по биологической конфокальной микроскопии (3-е изд.). Берлин: Springer. ISBN 0-387-25921-X . 
15. Лакович, Джозеф Р. (1999) Принципы флуоресцентной спектроскопии. Нью-Йорк: Kluwer Academic/Plenum.
16. Абрамовиц М., Дэвидсон М. В. (01.08.2003). "Darkfield Illumination". Архивировано из оригинала 23.11.2015 . Получено 21.10.2008 .
17. Абрамовиц М., Дэвидсон М. В. (01.08.2003). "Rheinberg Illumination". Архивировано из оригинала 29.09.2008 . Получено 21.10.2008 .
18. Gill, Harindarpal (январь 2010 г.). «Оценка эффективности флуоресценции и поглощения триптофана как инструмента выбора для идентификации кристаллов белка». Acta Crystallographica . F66 (Pt 3): 364–372. doi :10.1107/S1744309110002022. PMC 2833058. PMID  20208182 . 
19. Денк, Винфрид; Свобода, Карел (март 1997 г.). «Фотонное превосходство: почему многофотонная визуализация — это больше, чем трюк». Neuron . 18 (3): 351–357. doi : 10.1016/S0896-6273(00)81237-4 . PMID  9115730. S2CID  2414593.
20. Denk, W.; Delaney, KR; Gelperin, A.; Kleinfeld, D.; Strowbridge, BW; Tank, DW; Yuste, R. (1994). «Анатомическая и функциональная визуализация нейронов с использованием сканирующей микроскопии с 2-фотонным лазером». Journal of Neuroscience Methods . 54 (2): 151–162. doi :10.1016/0165-0270(94)90189-9. PMID  7869748. S2CID  3772937.
21. Свобода, Карел; Денк, Винфрид; Кляйнфельд, Дэвид; Танк, Дэвид В. (1997). «In vivo дендритная кальциевая динамика в неокортикальных пирамидальных нейронах». Nature . 385 (6612): 161–165. Bibcode :1997Natur.385..161S. doi :10.1038/385161a0. ISSN  0028-0836. PMID  8990119. S2CID  4251386. Архивировано из оригинала 25.05.2021 . Получено 20.05.2020 .
22. Voie, AH (1993). «Визуализация неповрежденного барабанного пузыря морской свинки с помощью ортогональной флуоресцентной оптической секционной микроскопии». Hearing Research . 71 (1–2): 119–128. doi :10.1016/S0378-5955(02)00493-8. ISSN  0378-5955. PMID  12204356. S2CID  12775304.
23. Greger, K.; J. Swoger; EHK Stelzer (2007). «Основные строительные блоки и свойства флуоресцентного одноплоскостного осветительного микроскопа». Review of Scientific Instruments . 78 (2): 023705–023705–7. Bibcode : 2007RScI...78b3705G. doi : 10.1063/1.2428277 . ISSN  0034-6748. PMID  17578115.
24. Buytaert, JAN; E. Descamps; D. Adriaens; JJJ Dirckx (2012). «Семейство микроскопов OPFOS: оптическое секционирование биомедицинских образцов с высоким разрешением». Anatomy Research International . 2012 : 206238. arXiv : 1106.3162 . doi : 10.1155/2012/206238 . ISSN  2090-2743. PMC 3335623. PMID 22567307  . 
25. FJ Duarte, в книге High Power Dye Lasers (Springer-Verlag, Берлин, 1991), Глава 2.
26. Дуарте Ф.Дж. (1993), Электрооптическая интерферометрическая микроденситометрическая система, патент США 5255069. Архивировано 13 октября 2017 г. на Wayback Machine .
27. Peterson, Mark D.; Hayes, Patrick L.; Martinez, Imee Su; Cass, Laura C.; Achtyl, Jennifer L.; Weiss, Emily A.; Geiger, Franz M. (2011-05-01). "Генерация второй гармоники с помощью усилителя кГц [Приглашен]". Optical Materials Express . 1 (1): 57. Bibcode : 2011OMExp...1...57P. doi : 10.1364/ome.1.000057.
28. Macias-Romero, Carlos; Didier, Marie EP; Jourdain, Pascal; Marquet, Pierre; Magistretti, Pierre; Tarun, Orly B.; Zubkovs, Vitalijs; Radenovic, Aleksandra ; Roke, Sylvie (2014-12-15). "Высокопроизводительная визуализация второй гармоники для биологических приложений без меток". Optics Express . 22 (25): 31102–12. Bibcode : 2014OExpr..2231102M. doi : 10.1364/oe.22.031102 . hdl : 10754/563269 . PMID  25607059. Архивировано из оригинала 20.06.2020 . Получено 11 декабря 2019 г.
29. Cheng, Li-Chung; Chang, Chia-Yuan; Lin, Chun-Yu; Cho, Keng-Chi; Yen, Wei-Chung; Chang, Nan-Shan; Xu, Chris; Dong, Chen Yuan; Chen, Shean-Jen (2012-04-09). "Пространственно-временная фокусирующая широкопольная многофотонная микроскопия для быстрого оптического секционирования". Optics Express . 20 (8): 8939–48. Bibcode : 2012OExpr..20.8939C. doi : 10.1364/oe.20.008939 . PMID  22513605.
30. Орон, Дэн; Тал, Эран; Силберберг, Ярон (2005-03-07). «Безсканирующая глубинная микроскопия». Optics Express . 13 (5): 1468–76. Bibcode : 2005OExpr..13.1468O. doi : 10.1364/opex.13.001468 . PMID  19495022.
31. Ахи, Киараш; Анвар, Мехди (2016-05-26). Анвар, Мехди Ф; Кроу, Томас В; Манзур, Тарик (ред.). «Моделирование терагерцовых изображений на основе рентгеновских изображений: новый подход к проверке терагерцовых изображений и идентификации объектов с мелкими деталями за пределами терагерцового разрешения». Терагерцовая физика, устройства и системы X: передовые приложения в промышленности . Терагерцовая физика, устройства и системы X: передовые приложения в промышленности и обороне. 9856 : 985610. Bibcode :2016SPIE.9856E..10A. doi :10.1117/12.2228685. S2CID  124315172.
32. Соломон, Крис (2010). Основы цифровой обработки изображений . John Wiley & Sons, Ltd. ISBN 978-0-470-84473-1.
33. Nasse MJ; Woehl JC (2010). «Реалистичное моделирование функции рассеяния точки освещения в конфокальной сканирующей оптической микроскопии». J. Opt. Soc. Am. A. 27 ( 2): 295–302. Bibcode :2010JOSAA..27..295N. doi :10.1364/JOSAA.27.000295. PMID  20126241.
34. Wallace W, Schaefer LH, Swedlow JR (2001). «Руководство для работающих по деконволюции в световой микроскопии». BioTechniques . 31 (5): 1076–8, 1080, 1082 passim. doi : 10.2144/01315bi01 . PMID  11730015.
35. Кауфманн Райнер; Мюллер Патрик; Хильденбранд Георг; Хаусманн Михаэль; Кремер Кристоф (2010). «Анализ кластеров мембранных белков Her2/neu в различных типах клеток рака молочной железы с использованием локализационной микроскопии». Журнал микроскопии . 242 (1): 46–54. CiteSeerX 10.1.1.665.3604 . doi :10.1111/j.1365-2818.2010.03436.x. PMID  21118230. S2CID  2119158. 
36. Ван де Линде С.; Вольтер С.; Зауэр С. (2011). «Фотопереключение и локализация одиночных молекул». Aust. J. Chem . 64 (5): 503–511. doi : 10.1071/CH10284 .
37. K. Goda; KK Tsia; B. Jalali (2009). "Последовательное кодирование во времени усиленных изображений для наблюдения в реальном времени быстрых динамических явлений". Nature . 458 (7242): 1145–9. Bibcode :2009Natur.458.1145G. doi :10.1038/nature07980. PMID  19407796. S2CID  4415762.
38. Джалали, Бахрам; Кейпвелл, Дейл; Года, Кейсуке; Циа, Кевин К. (2010-05-10). «Производительность последовательного временного кодирования амплифицированного микроскопа». Optics Express . 18 (10): 10016–10028. Bibcode : 2010OExpr..1810016T. doi : 10.1364/OE.18.010016. hdl : 10722/91333 . ISSN  1094-4087. PMID  20588855. S2CID  8077381.
39. Kosasih, Felix Utama; Ducati, Caterina (май 2018 г.). «Характеристика деградации перовскитных солнечных ячеек с помощью in-situ и operando электронной микроскопии». Nano Energy . 47 : 243–256. doi :10.1016/j.nanoen.2018.02.055. Архивировано из оригинала 26.01.2021 . Получено 28.06.2019 .
40. HM Pollock и SG Kazarian, Микроспектроскопия в среднем инфракрасном диапазоне, в Энциклопедии аналитической химии (ред. Роберт А. Мейерс, 1-26 (2014), John Wiley & Sons Ltd,
41. Pollock Hubert M (2014). «Микроспектроскопия в среднем инфракрасном диапазоне». Энциклопедия аналитической химии . С. 1–26. doi :10.1002/9780470027318.a5609.pub2. ISBN 9780470027318.
42. HM Pollock и DA Smith, Использование зондов ближнего поля для вибрационной спектроскопии и фототермической визуализации, в Handbook of Vibrational Spectroscopy, JM Chalmers и PR Griffiths (редакторы), John Wiley & Sons Ltd, том 2, стр. 1472 - 1492 (2002)
43. Кейлманн, Фриц; Хилленбранд, Райнер (15.04.2004). Ричардс, Дэвид; Заяц, Анатолий (ред.). «Ближнепольная микроскопия с помощью упругого рассеяния света от наконечника». Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences . 362 (1817): 787–805. doi :10.1098/rsta.2003.1347. ISSN  1364-503X. PMID  15306494. S2CID  20211405. Архивировано из оригинала 09.11.2020 . Получено 02.11.2020 .
44. Duarte FJ (2016). «Настраиваемая лазерная микроскопия». В Duarte FJ (ред.). Настраиваемые лазерные приложения (3-е изд.). Boca Raton: CRC Press . стр. 315–328. ISBN 9781482261066.
45. Томас Дж. Л., Рудольф В. (2008). «Биологическая микроскопия с ультракороткими лазерными импульсами». В Дуарте Ф. Дж. (ред.).Применение перестраиваемых лазеров(2-е изд.). Бока-Ратон: CRC Press . стр. 245–80. ISBN 978-1-4200-6009-6.
46. Солем, Дж. К. (1983). «Рентгеновское изображение биологических образцов». Труды Международной конференции по лазерам '83 : 635–640. OSTI  5998195.
47. Solem, JC (1982). "High-intensity x-ray holography: An approach to high-resolution snapshot imaging of biological samples". Технический отчет Национальной лаборатории Лос-Аламоса LA-9508-MS . 83 : 23581. Bibcode : 1982STIN...8323581S. doi : 10.2172/7056325. OSTI  7056325. Архивировано из оригинала 2020-08-04 . Получено 2019-06-28 .
48. Солем, Дж. К.; Болдуин, Г. К. (1982). «Микроголография живых организмов». Science . 218 (4569): 229–235. Bibcode :1982Sci...218..229S. doi :10.1126/science.218.4569.229. PMID  17838608. S2CID  32381820.
49. Солем, Дж. К.; Чаплайн, Г. Ф. (1984). "Рентгеновская биомикроголография". Optical Engineering . 23 (2): 193. Bibcode : 1984OptEn..23..193S. doi : 10.1117/12.7973410.
50. Солем, Дж. К. (1985). «Микроголография». Энциклопедия науки и техники McGraw-Hill .
51. Солем, Дж. К. (1984). «Рентгеновская голография биологических образцов». Труды Девятого международного конгресса по фотобиологии, Филадельфия, Пенсильвания, США, 3 июля 1984 г. (LA-UR-84-3340, CONF-840783-3): 19. OSTI  6314558.
52. Солем, Дж. К. (1986). «Визуализация биологических образцов с помощью высокоинтенсивных мягких рентгеновских лучей». Журнал Оптического общества Америки B. 3 ( 11): 1551–1565. Bibcode : 1986JOSAB...3.1551S. doi : 10.1364/josab.3.001551.
53. Хаддад, WS; Солем, JC; Каллен, D.; Бойер, K.; Роудс, CK (1987). «Описание теории и аппаратуры для цифровой реконструкции голограмм с преобразованием Фурье», Труды Electronics Imaging '87, 2-5 ноября 1987 г., Бостон; Журнал Electronic Imaging , (Институт графической коммуникации, Inc., Бостон), стр. 693.
54. Хаддад, WS; Каллен, D.; Бойер, K.; Родс, CK; Солем, JC; Вайнштейн, RS (1988). «Проект голографического микроскопа с преобразованием Фурье». Рентгеновская микроскопия II . Серия Springer в оптических науках. Том 56. стр. 284–287. doi :10.1007/978-3-540-39246-0_49. ISBN 978-3-662-14490-9.
55. Haddad, WS; Solem, JC; Cullen, D.; Boyer, K.; Rhodes, CK (1988). «Проект голографического микроскопа с преобразованием Фурье и цифровой реконструкцией изображений». Труды конференции CLEO '88 по лазерам и электрооптике, Анахайм, Калифорния, апрель 1988 г.; Optical Society of America, OSA Technical Digest . 7 : WS4. Архивировано из оригинала 2016-02-02 . Получено 2016-01-13 .
56. Haddad, WS; Cullen, D.; Solem, JC; Boyer, K.; Rhodes, CK (1988). "Рентгеновский Фурье-преобразовательный голографический микроскоп". Труды тематической конференции OSA по коротковолновому когерентному излучению: генерация и применение, 26–29 сентября 1988 г., Cape Cod, MA., Falcone, R.; Kirz, J.; Ред. (Оптическое общество Америки, Вашингтон, округ Колумбия) : 284–289. Архивировано из оригинала 27.01.2016 . Получено 13.01.2016 .
57. Солем, Дж. К.; Бойер, К.; Хаддад, В. С.; Родс, К. К. (1990). Просниц, Дональд (ред.). «Перспективы рентгеновской голографии с лазерами на свободных электронах». Лазеры на свободных электронах и их применение . Лазеры на свободных электронах и их применение. 1227. Просниц, Д.; ред. SPIE: 105–116. Bibcode :1990SPIE.1227..105S. doi :10.1117/12.18609. S2CID  121807907.
58. Haddad, WS; Cullen, D.; Solem, JC; Longworth, JW; McPherson, LA; Boyer, K.; Rhodes, CK (1991). "Голографический микроскоп с преобразованием Фурье". В Chang, Winchyi; Milch, James R. (ред.). Системы камер и сканеров ввода . Т. 1448. С. 81–88. Bibcode : 1991SPIE.1448...81H. doi : 10.1117/12.45347. PMID  20733659. S2CID  120679508. {{cite book}}: |journal=проигнорировано ( помощь )
59. Haddad, WS; Cullen, D.; Solem, JC; Longworth, J.; McPherson, A.; Boyer, K.; Rhodes, CK (1992). "Голографический микроскоп с преобразованием Фурье". Applied Optics . 31 (24): 4973–4978. Bibcode :1992ApOpt..31.4973H. doi :10.1364/ao.31.004973. PMID  20733659.
60. Boyer, K.; Solem, JC; Longworth, J.; Борисов, A.; Rhodes, CK (1996). «Биомедицинское трехмерное голографическое микроизображение в видимом, ультрафиолетовом и рентгеновском диапазонах длин волн». Nature Medicine . 2 (8): 939–941. doi :10.1038/nm0896-939. PMID  8705867. S2CID  25231033.
61. Белл, АГ (1880). «О производстве и воспроизведении звука светом». American Journal of Science . s3-20 (118): 305–324. Bibcode : 1880AmJS...20..305B. doi : 10.2475/ajs.s3-20.118.305. S2CID  130048089. Архивировано из оригинала 27.11.2022 . Получено 28.06.2019 .
62. Яо, Дж.; Ван, Л. В. (2013). «Фотоакустическая микроскопия». Laser Photonics Rev. 7 ( 5): 1–36. Bibcode :2013LPRv....7..758Y. doi :10.1002/lpor.201200060. PMC 3887369 . PMID  24416085. 
63. Лангер, Г.; Бухеггер, Б.; Ячак, Дж.; Клар, ТА; Берер, Т. (2016). «Фотоакустическая и флуоресцентная микроскопия в частотной области». Biomedical Optics Express . 7 (7): 2692–702. doi :10.1364/BOE.7.002692. PMC 4948622. PMID  27446698 . 
64. Kotrly M (август 2015 г.). «Новые возможности использования микроскопических методов в судебной экспертизе». Труды по микроскопии и микроанализу . 21 (S3): 1365–1366. Bibcode : 2015MiMic..21S1365K. doi : 10.1017/S1431927615007618 .
65. Basu S, Millette JR (1986). Электронная микроскопия в судебной экспертизе профессиональных и экологических науках . Нью-Йорк: Plenum Press.

Дальнейшее чтение

• Pluta, Maksymilian (1988). Advanced Light Microscopy vol. 1 Principles and Basic Properties . Elsevier. ISBN 978-0-444-98939-0.
• Pluta, Maksymilian (1989). Advanced Light Microscopy vol. 2 Specialised Methods . Elsevier. ISBN 978-0-444-98918-5.
• Брэдбери, С.; Брейсгердл, Б. (1998). Введение в световую микроскопию . BIOS Scientific Publishers . ISBN 978-0-387-91515-9.
• Иноуэ, Шинья (1986). Видеомикроскопия . Plenum Press. ISBN 978-0-306-42120-4.
• Cremer, C.; Cremer, T. (1978). «Соображения относительно лазерного сканирующего микроскопа с высоким разрешением и глубиной резкости» (PDF) . Microscopica Acta . 81 (1): 31–44. PMID  713859. Архивировано из оригинала (PDF) 2016-03-04 . Получено 2009-12-22 .Теоретическая основа сверхвысокоразрешающей 4Pi микроскопии и конструкция конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа
• Уиллис, Рэндалл К. (2007). «Портреты жизни, по одной молекуле за раз». Аналитическая химия . 79 (5): 1785–8. doi : 10.1021/ac0718795 . PMID  17375393., статья о субдифракционной микроскопии из выпуска журнала «Аналитическая химия» от 1 марта 2007 г.

Внешние ссылки

Общий

• Глоссарий по микроскопии, общепринятые термины, используемые в любительской световой микроскопии.
• Nikon MicroscopyU Обширная информация о световой микроскопии
• Olympus Microscopy Микроскопия Ресурсный центр
• Carl Zeiss «Микроскопия с самых азов», пошаговое руководство по основам микроскопии.
• Микроскопия в деталях — ресурс с большим количеством иллюстраций, иллюстрирующих наиболее распространенные методы микроскопии.
• Manawatu Microscopy — первая известная среда для совместной работы в области микроскопии и анализа изображений.
• Аудиомикроскопический глоссарий

Методы

• Применение ратиометрической визуализации для микроскопов Примеры работы ратиометрической визуализации на микроскопе
• Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров Интерактивная база данных флуоресцентных красителей и фильтров Carl Zeiss.
• Новые подходы к микроскопии Эрик Бетциг: После Нобелевской премии — Новые подходы к микроскопии.