Рибофлавин , также известный как витамин B2 , является витамином, содержащимся в пище и продаваемым в качестве пищевой добавки . [3] Он необходим для образования двух основных коферментов , флавинмононуклеотида и флавинадениндинуклеотида . Эти коферменты участвуют в энергетическом обмене , клеточном дыхании и выработке антител , а также в нормальном росте и развитии. Коферменты также необходимы для метаболизма ниацина , витамина B6 и фолиевой кислоты . Рибофлавин назначают для лечения истончения роговицы , а его прием внутрь может снизить частоту возникновения мигрени у взрослых.
Дефицит рибофлавина встречается редко и обычно сопровождается дефицитом других витаминов и питательных веществ. Его можно предотвратить или лечить с помощью пероральных добавок или инъекций. Как водорастворимый витамин, любой рибофлавин, потребляемый сверх потребности в питании, не сохраняется; он либо не усваивается, либо усваивается и быстро выводится с мочой , в результате чего моча приобретает ярко-желтый оттенок. Природные источники рибофлавина включают мясо, рыбу и птицу, яйца, молочные продукты, зеленые овощи, грибы и миндаль. В некоторых странах требуется его добавление к зерновым . [3]
В очищенной, твердой форме это водорастворимый желто-оранжевый кристаллический порошок. В дополнение к своей функции витамина, он используется как пищевой краситель . Биосинтез происходит в бактериях, грибах и растениях, но не в животных. Промышленный синтез рибофлавина изначально был достигнут с помощью химического процесса, но современное коммерческое производство опирается на методы ферментации с использованием штаммов грибов и генетически модифицированных бактерий.
Рибофлавин, также известный как витамин B 2 , является водорастворимым витамином и одним из витаминов группы B . [3] [4] [5] В отличие от фолата и витамина B 6 , которые встречаются в нескольких химически родственных формах, известных как витамеры , рибофлавин является только одним химическим соединением. Он является исходным соединением в синтезе коферментов флавинмононуклеотида (ФМН, также известного как рибофлавин-5'-фосфат) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). ФАД является более распространенной формой флавина, которая, как сообщается, связывается с 75% числа генов, кодируемых флавин-зависимыми белками, в геноме всех видов (флавопротеоме) [6] [7] и служит коферментом для 84% кодируемых человеком флавопротеинов. [6]
В очищенной, твердой форме рибофлавин представляет собой желто-оранжевый кристаллический порошок со слабым запахом и горьким вкусом. Он растворим в полярных растворителях , таких как вода и водные растворы хлорида натрия, и слабо растворим в спиртах. Он не растворим в неполярных или слабополярных органических растворителях, таких как хлороформ, бензол или ацетон. [8] В растворе или при сухом хранении в виде порошка рибофлавин термостабилен, если не подвергается воздействию света. При нагревании для разложения он выделяет токсичные пары, содержащие оксид азота . [8]
Рибофлавин необходим для образования двух основных коферментов, FMN и FAD. [3] [9] Эти коферменты участвуют в энергетическом обмене , клеточном дыхании , выработке антител , росте и развитии. [9] Рибофлавин необходим для метаболизма углеводов , белков и жиров . [3] FAD способствует превращению триптофана в ниацин (витамин B3 ) [ 10] , а превращение витамина B6 в кофермент пиридоксаль-5'-фосфат требует FMN. [10] Рибофлавин участвует в поддержании нормального уровня циркулирующего гомоцистеина ; при дефиците рибофлавина уровень гомоцистеина повышается, повышая риск сердечно-сосудистых заболеваний . [10]
Окислительно-восстановительные реакции — это процессы, включающие перенос электронов . Флавиновые коферменты поддерживают функцию примерно 70-80 флавоферментов у людей (и еще сотен во всех организмах, включая те, которые кодируются архейными , бактериальными и грибковыми геномами ), которые отвечают за одно- или двухэлектронные окислительно-восстановительные реакции, которые используют способность флавинов преобразовываться между окисленными, полувосстановленными и полностью восстановленными формами. [3] [5] FAD также требуется для активности глутатионредуктазы , необходимого фермента в образовании эндогенного антиоксиданта , глутатиона . [10]
Рибофлавин, ФМН и ФАД участвуют в метаболизме ниацина, витамина B6 и фолата . [ 4] Синтез ниацинсодержащих коферментов, НАД и НАДФ , из триптофана включает в себя ФАД-зависимый фермент, кинуренин-3-монооксигеназу . Дефицит рибофлавина в рационе может снизить выработку НАД и НАДФ, тем самым способствуя дефициту ниацина. [4] Превращение витамина B6 в его кофермент, пиридоксаль-5'-фосфат , включает в себя фермент, пиридоксин-5'-фосфатоксидазу , для которого требуется ФМН. [4] Фермент, участвующий в метаболизме фолата, 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза , требует ФАД для образования аминокислоты метионина из гомоцистеина. [4]
Дефицит рибофлавина, по-видимому, нарушает метаболизм диетического минерала , железа , который необходим для производства гемоглобина и эритроцитов . Уменьшение дефицита рибофлавина у людей, которые испытывают дефицит как рибофлавина, так и железа, повышает эффективность добавок железа для лечения железодефицитной анемии . [11]
Биосинтез происходит в бактериях, грибах и растениях, но не в животных. [5] Биосинтетическими предшественниками рибофлавина являются рибулозо-5-фосфат и гуанозинтрифосфат . Первый преобразуется в L-3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфат, а последний трансформируется в серии реакций, которые приводят к 5-амино-6-(D-рибитиламино)урацилу. Эти два соединения затем являются субстратами для предпоследнего шага в пути, катализируемого ферментом люмазинсинтазой в реакции EC 2.5.1.78. [12] [13] [14]
На последнем этапе биосинтеза две молекулы 6,7-диметил-8-рибитиллумазина объединяются ферментом рибофлавинсинтазой в реакции дисмутации . Это генерирует одну молекулу рибофлавина и одну молекулу 5-амино-6-(D-рибитиламино)урацила. Последний возвращается в предыдущую реакцию в последовательности. [12] [13]
Превращения рибофлавина в кофакторы ФМН и ФАД осуществляются ферментами рибофлавинкиназой и ФАД-синтетазой, действующими последовательно. [13] [15]
В промышленном производстве рибофлавина используются различные микроорганизмы, включая нитчатые грибы , такие как Ashbya gossypii , Candida famata и Candida flaveri , а также бактерии Corynebacterium ammoniagenes и Bacillus subtilis . B. subtilis , генетически модифицированный как для увеличения производства рибофлавина, так и для введения маркера устойчивости к антибиотику ( ампициллину ), используется в коммерческих масштабах для производства рибофлавина для обогащения кормов и продуктов питания. [17] К 2012 году с помощью таких процессов ферментации производилось более 4000 тонн в год. [18]
В присутствии высоких концентраций углеводородов или ароматических соединений некоторые бактерии перепроизводят рибофлавин, возможно, в качестве защитного механизма. Одним из таких организмов является Micrococcus luteus ( штамм Американской коллекции типовых культур номер ATCC 49442), который приобретает желтый цвет из-за продукции рибофлавина при росте на пиридине, но не при росте на других субстратах, таких как янтарная кислота. [16]
Первый полный синтез рибофлавина был осуществлен группой Ричарда Куна . [18] [19] Замещенный анилин , полученный восстановительным аминированием с использованием D-рибозы , был конденсирован с аллоксаном на заключительном этапе:
Кератоконус является наиболее распространенной формой эктазии роговицы , прогрессирующего истончения роговицы. Это состояние лечится с помощью сшивания роговичного коллагена , что увеличивает жесткость роговицы. Сшивание достигается путем нанесения на роговицу местного раствора рибофлавина, который затем подвергается воздействию ультрафиолетового света А. [20] [21]
В своих рекомендациях 2012 года Американская академия неврологии заявила, что высокие дозы рибофлавина (400 мг) «вероятно эффективны и должны рассматриваться для профилактики мигрени» [22], рекомендация также предоставлена Национальным центром мигрени Великобритании. [23] Обзор 2017 года показал, что ежедневный прием рибофлавина в дозе 400 мг в день в течение как минимум трех месяцев может снизить частоту мигренозных головных болей у взрослых. [24] Исследования высоких доз рибофлавина для профилактики или лечения мигрени у детей и подростков не дали окончательных результатов, поэтому добавки не рекомендуются. [1] [3] [25]
Рибофлавин используется в качестве пищевого красителя (желто-оранжевый кристаллический порошок) [8] и имеет обозначение E-номера , E101, в Европе для использования в качестве пищевой добавки [26] .
Национальная медицинская академия обновила Оценочные средние потребности (EAR) и Рекомендуемые диетические нормы (RDA) для рибофлавина в 1998 году. EAR [обновлять]для рибофлавина для женщин и мужчин в возрасте 14 лет и старше составляют 0,9 мг/день и 1,1 мг/день соответственно; RDA составляют 1,1 и 1,3 мг/день соответственно. RDA выше, чем EAR, чтобы обеспечить адекватные уровни потребления для лиц с более высокими, чем средние, потребностями. RDA во время беременности составляет 1,4 мг/день, а RDA для кормящих женщин — 1,6 мг/день. Для младенцев в возрасте до 12 месяцев адекватное потребление (AI) составляет 0,3–0,4 мг/день, а для детей в возрасте 1–13 лет RDA увеличивается с возрастом от 0,5 до 0,9 мг/день. Что касается безопасности, IOM устанавливает допустимые верхние уровни потребления (UL) для витаминов и минералов, когда имеются достаточные доказательства. В случае рибофлавина UL отсутствует, поскольку нет данных о побочных эффектах от высоких доз у людей. В совокупности EAR, RDA, AI и UL называются диетическими референтными уровнями потребления (DRI). [4] [27]
Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (EFSA) называет коллективный набор информации Диетическими референтными значениями, с Референтным потреблением населения (PRI) вместо RDA и Средней потребностью вместо EAR. AI и UL определяются так же, как в Соединенных Штатах. Для женщин и мужчин в возрасте 15 лет и старше PRI устанавливается на уровне 1,6 мг/день. PRI во время беременности составляет 1,9 мг/день, а PRI для кормящих женщин — 2,0 мг/день. Для детей в возрасте 1–14 лет PRI увеличиваются с возрастом от 0,6 до 1,4 мг/день. Эти PRI выше, чем RDA в США. [28] [29] EFSA также рассмотрело максимально безопасное потребление и, как и Национальная академия медицины США, решило, что недостаточно информации для установления UL. [30]
У людей нет доказательств токсичности рибофлавина, вызванной чрезмерным потреблением, а всасывание становится менее эффективным по мере увеличения дозировки. Любой избыток рибофлавина выводится через почки в мочу , что приводит к ярко-желтому цвету, известному как флавинурия. [5] [27] [31] Во время клинического испытания эффективности рибофлавина для лечения частоты и тяжести мигреней субъектам давали до 400 мг рибофлавина перорально в день в течение периодов от 3 до 12 месяцев. Среди побочных эффектов были отмечены боли в животе и диарея . [24]
Для маркировки пищевых продуктов и диетических добавок в США количество в порции выражается в процентах от суточной нормы (%DV). Для маркировки рибофлавина 100% суточной нормы составляло 1,7 мг, но по состоянию на 27 мая 2016 года оно было пересмотрено до 1,3 мг, чтобы привести его в соответствие с RDA. [32] [33] Таблица старых и новых суточных норм для взрослых приведена в Reference Daily Intake .
Служба сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США ведет базу данных по составу пищевых продуктов, с помощью которой можно осуществлять поиск содержания рибофлавина в сотнях продуктов. [34]
В белой муке, полученной после помола пшеницы, осталось всего 67% от исходного количества рибофлавина, [35] поэтому в некоторых странах белую муку обогащают. [36] Рибофлавин также добавляют в готовые к употреблению сухие завтраки . [37] Рибофлавин трудно включить в жидкие продукты, поскольку он плохо растворяется в воде, отсюда и потребность в рибофлавин-5'-фосфате (ФМН, также называемом E101 при использовании в качестве красителя ), более растворимой форме рибофлавина. [26] Обогащение хлеба и готовых к употреблению сухих завтраков вносит значительный вклад в диетическое снабжение витамином. Свободный рибофлавин естественным образом присутствует в продуктах животного происхождения вместе с белково-связанными ФМН и ФАД. Коровье молоко содержит в основном свободный рибофлавин, но и ФМН, и ФАД присутствуют в низких концентрациях. [38]
Некоторые страны требуют или рекомендуют обогащение зерновых продуктов. [36] По состоянию на 2024 год 57 стран, в основном в Северной и Южной Америке и Юго-Восточной Африке, требуют обогащения пшеничной муки или кукурузной муки рибофлавином или рибофлавин-5'-фосфатом натрия. Указанные количества варьируются от 1,3 до 5,75 мг/кг. [39] Еще 16 стран имеют добровольную программу обогащения. [39] Например, правительство Индии рекомендует 4,0 мг/кг для муки «майда» (белая) и «атта» (цельнозерновая) . [40]
Более 90% рибофлавина в рационе находится в форме связанного с белком ФМН и ФАД. [3] Воздействие желудочной кислоты в желудке высвобождает коферменты, которые впоследствии ферментативно гидролизуются в проксимальном отделе тонкого кишечника с высвобождением свободного рибофлавина. [41]
Всасывание происходит через быструю активную транспортную систему, с некоторой дополнительной пассивной диффузией, происходящей при высоких концентрациях. [41] Желчные соли облегчают всасывание, поэтому всасывание улучшается, когда витамин потребляется с пищей. [4] [5] Большая часть вновь всосавшегося рибофлавина поглощается печенью при первом прохождении, что указывает на то, что постпрандиальное появление рибофлавина в плазме крови может недооценивать всасывание. [5] Были идентифицированы три белка-транспортера рибофлавина: RFVT1 присутствует в тонком кишечнике, а также в плаценте; RFVT2 высоко экспрессируется в мозге и слюнных железах; а RFVT3 наиболее высоко экспрессируется в тонком кишечнике, яичках и простате. [5] [42] Младенцы с мутациями в генах, кодирующих эти транспортные белки, могут лечиться рибофлавином, вводимым перорально. [42]
Рибофлавин обратимо преобразуется в ФМН, а затем в ФАД. Из рибофлавина в ФМН — это функция цинк-зависимой рибофлавинкиназы ; обратный процесс осуществляется фосфатазой. Из ФМН в ФАД — это функция магнийзависимой ФАД-синтазы; обратный процесс осуществляется пирофосфатазой . ФАД, по-видимому, является ингибиторным конечным продуктом, который подавляет собственное образование. [5]
Когда избыток рибофлавина всасывается тонким кишечником, он быстро удаляется из крови и выводится с мочой. [5] Цвет мочи используется как биомаркер статуса гидратации и в нормальных условиях коррелирует с удельным весом мочи и осмоляльностью мочи . [43] Однако добавление рибофлавина в больших количествах приводит к тому, что моча становится более желтой, чем обычно. [31] При нормальном потреблении пищи около двух третей выделяемой мочи составляет рибофлавин, остальная часть частично метаболизируется в гидроксиметилрибофлавин путем окисления внутри клеток и в виде других метаболитов. Когда потребление превышает способность к всасыванию, рибофлавин переходит в толстый кишечник, где он катаболизируется бактериями в различные метаболиты, которые можно обнаружить в кале . [5] Есть предположение, что невсосавшийся рибофлавин может повлиять на микробиом толстого кишечника . [44]
Дефицит рибофлавина встречается редко в Соединенных Штатах и других странах с программами обогащения пшеничной или кукурузной муки. [39] Согласно данным, собранным в ходе полугодовых опросов населения США, в возрасте 20 лет и старше 22% женщин и 19% мужчин сообщили о потреблении добавки, содержащей рибофлавин, как правило, витаминно-минеральной мультидобавки. Для пользователей, не принимающих добавки, диетическое потребление взрослых женщин в среднем составляло 1,74 мг/день, а мужчин — 2,44 мг/день. Эти количества превышают рекомендуемые суточные нормы для рибофлавина в 1,1 и 1,3 мг/день соответственно. [45] Для всех возрастных групп в среднем потребление из пищи превышало рекомендуемые суточные нормы. [46] Опрос в США 2001–2002 годов показал, что менее 3% населения потребляли рибофлавин меньше расчетной средней потребности . [47]
Дефицит рибофлавина (также называемый арибофлавинозом) приводит к стоматиту , симптомы которого включают потрескавшиеся и потрескавшиеся губы, воспаление уголков рта ( ангулярный стоматит ), боль в горле, болезненный красный язык и выпадение волос. [3] Глаза могут стать зудящими, слезящимися, налитыми кровью и чувствительными к свету. [3] Дефицит рибофлавина связан с анемией . [48] Длительная недостаточность рибофлавина может вызвать дегенерацию печени и нервной системы. [3] [4] Дефицит рибофлавина может увеличить риск преэклампсии у беременных женщин. [3] [10] Дефицит рибофлавина во время беременности может привести к врожденным дефектам плода , включая деформации сердца и конечностей. [49] [50]
Люди, подверженные риску низкого уровня рибофлавина, включают алкоголиков , спортсменов- вегетарианцев и практикующих веганство . [3] Беременные или кормящие женщины и их младенцы также могут быть в группе риска, если мать избегает мяса и молочных продуктов. [3] [10] Анорексия и непереносимость лактозы увеличивают риск дефицита рибофлавина. [10] Людям с физически тяжелым образом жизни, таким как спортсмены и рабочие, может потребоваться более высокое потребление рибофлавина. [10] Превращение рибофлавина в ФАД и ФМН нарушено у людей с гипотиреозом , надпочечниковой недостаточностью и дефицитом транспортера рибофлавина. [10]
Дефицит рибофлавина обычно обнаруживается вместе с дефицитом других питательных веществ, особенно других водорастворимых витаминов . [3] Дефицит рибофлавина может быть первичным (т. е. вызванным плохими источниками витаминов в обычном рационе) или вторичным, который может быть результатом условий, которые влияют на всасывание в кишечнике. Вторичный дефицит обычно вызван тем, что организм не может использовать витамин, или повышенной скоростью его выведения. [10] Модели питания, которые увеличивают риск дефицита, включают веганство и вегетарианство с низким содержанием молочных продуктов . [5] Такие заболевания, как рак, болезни сердца и диабет, могут вызывать или усугублять дефицит рибофлавина. [4]
Существуют редкие генетические дефекты, которые нарушают всасывание, транспортировку, метаболизм или использование рибофлавина флавопротеинами. [42] [51] Одним из них является дефицит транспортера рибофлавина, ранее известный как синдром Брауна-Виалетто-Ван Ларе . [42] [51] Варианты генов SLC52A2 и SLC52A3 , которые кодируют транспортные белки RDVT2 и RDVT3, соответственно, являются дефектными. [42] [51] У младенцев и маленьких детей наблюдается мышечная слабость, дефицит черепных нервов , включая потерю слуха, сенсорные симптомы, включая сенсорную атаксию , трудности с кормлением и респираторный дистресс, вызванный сенсомоторной аксональной невропатией и патологией черепных нервов. [51] При отсутствии лечения у младенцев с дефицитом транспортера рибофлавина наблюдается затрудненное дыхание, и они подвергаются риску смерти в течение первого десятилетия жизни. Лечение пероральными добавками большого количества рибофлавина спасает жизнь. [42] [51]
Другие врожденные нарушения метаболизма включают дефицит множественной ацил-КоА-дегидрогеназы , реагирующей на рибофлавин , также известный как подтип глутаровой ацидемии типа 2 , и вариант C677T фермента метилентетрагидрофолатредуктазы , который у взрослых связан с риском высокого кровяного давления. [5]
Оценка статуса рибофлавина имеет важное значение для подтверждения случаев с неспецифическими симптомами, когда подозревается дефицит. Общая экскреция рибофлавина у здоровых взрослых с нормальным потреблением рибофлавина составляет около 120 микрограммов в день, в то время как экскреция менее 40 микрограммов в день указывает на дефицит. [3] [52] Скорость экскреции рибофлавина снижается с возрастом человека, но увеличивается в периоды хронического стресса и использования некоторых рецептурных препаратов . [3]
Индикаторами, используемыми для людей, являются эритроцитарная глутатионредуктаза (ЭГР), концентрация эритроцитарного флавина и выделение с мочой. [4] [5] Коэффициент активности эритроцитарной глутатионредуктазы (ЭГРЭ) обеспечивает измерение насыщения тканей и долгосрочного статуса рибофлавина. [52] [3] Результаты выражаются как отношение коэффициента активности, определяемое активностью фермента с добавлением и без добавления ФАД в культуральную среду. ЭГРЭ от 1,0 до 1,2 указывает на то, что присутствует достаточное количество рибофлавина; от 1,2 до 1,4 считается низким, более 1,4 указывает на дефицит. [3] [5] Для менее чувствительного «метода эритроцитарного флавина» значения более 400 нмоль/л считаются достаточными, а значения ниже 270 нмоль/л считаются дефицитными. [4] [52] Выделение с мочой выражается в нмоль рибофлавина на грамм креатинина . Низкий уровень определяется как диапазон от 50 до 72 нмоль/г. Недостаточный уровень ниже 50 нмоль/г. Нагрузочные тесты на выделение с мочой использовались для определения диетических потребностей. У взрослых мужчин при увеличении пероральных доз с 0,5 мг до 1,1 мг наблюдалось скромное линейное увеличение рибофлавина в моче, достигающее 100 микрограммов для последующего 24-часового сбора мочи. [4] После дозы нагрузки 1,1 мг выделение с мочой быстро увеличивалось, так что при дозе 2,5 мг выход мочи составлял 800 микрограммов для 24-часового сбора мочи. [4]
Название «рибофлавин» происходит от « рибозы » (сахара, восстановленная форма которого, рибит , является частью его структуры) и « флавина », кольцевой части, которая придает желтый цвет окисленной молекуле (от латинского flavus , «желтый»). [5] Восстановленная форма, которая встречается в метаболизме вместе с окисленной формой, выглядит как оранжево-желтые иглы или кристаллы. [8] Самая ранняя зарегистрированная идентификация, предшествовавшая любой концепции витаминов как основных питательных веществ, была сделана Александром Уинтером Блитом. В 1879 году Блит выделил водорастворимый компонент сыворотки коровьего молока, который он назвал «лактохромом», который флуоресцировал желто-зеленым цветом при воздействии света. [2]
В начале 1900-х годов несколько исследовательских лабораторий изучали компоненты продуктов питания, необходимые для поддержания роста крыс. Первоначально эти компоненты были разделены на жирорастворимый «витамин» А и водорастворимый «витамин» В. («e» было исключено в 1920 году. [53] ) Далее считалось, что витамин В состоит из двух компонентов: термолабильного вещества под названием B 1 и термостабильного вещества под названием B 2 . [2] Витамин B 2 был предварительно идентифицирован как фактор, необходимый для предотвращения пеллагры , но позже было подтверждено, что это связано с дефицитом ниацина (витамина B 3 ). Путаница была связана с тем фактом, что дефицит рибофлавина (B 2 ) вызывает симптомы стоматита, похожие на те, что наблюдаются при пеллагре, но без широко распространенных периферических поражений кожи. По этой причине на раннем этапе истории выявления дефицита рибофлавина у людей это состояние иногда называли «pellagra sine pellagra» (пеллагра без пеллагры). [54]
В 1935 году Пол Дьёрдь в сотрудничестве с химиком Ричардом Куном и врачом Т. Вагнером-Яуреггом сообщил, что крысы, содержавшиеся на диете без B2, не могли набирать вес. [55] Выделение B2 из дрожжей выявило наличие яркого желто-зеленого флуоресцентного продукта, который восстанавливал нормальный рост при кормлении крыс. Восстановленный рост был прямо пропорционален интенсивности флуоресценции. Это наблюдение позволило исследователям разработать быстрый химический биоанализ в 1933 году, а затем выделить фактор из яичного белка, назвав его овофлавином. [2] Та же группа затем выделила аналогичный препарат из сыворотки и назвала его лактофлавином. В 1934 году группа Куна определила химическую структуру этих флавинов как идентичную, остановилась на названии «рибофлавин» и также смогла синтезировать витамин. [2]
Около 1937 года рибофлавин также называли «витамином G». [56] В 1938 году Ричард Кун был удостоен Нобелевской премии по химии за свою работу по витаминам, в том числе B2 и B6 . [ 57] В 1939 году было подтверждено, что рибофлавин необходим для здоровья человека, с помощью клинического испытания, проведенного Уильямом Х. Себреллом и Роем Э. Батлером. У женщин, питавшихся пищей с низким содержанием рибофлавина, развился стоматит и другие признаки дефицита, которые исчезали при лечении синтетическим рибофлавином. Симптомы возвращались, когда прием добавок прекращался. [2]
