Фермент щелочная фосфатаза (ЩФ, щелочная фенилфосфатаза) выполняет физиологическую роль дефосфорилирующего соединения. Фермент обнаружен во множестве организмов, как прокариотов , так и эукариотов , с одной и той же общей функцией, но в разных структурных формах, подходящих для среды, в которой они функционируют. Щелочная фосфатаза обнаруживается в периплазматическом пространстве бактерий E. coli . Этот фермент термостабилен и имеет максимальную активность при высоком pH. У людей он встречается во многих формах в зависимости от его происхождения в организме: он играет важную роль в метаболизме в печени и развитии скелета. Из-за его широкой распространенности в этих регионах его концентрация в кровотоке используется диагностами в качестве биомаркера, помогающего поставить такие диагнозы, как гепатит или остеомаляция . [2]
Уровень щелочной фосфатазы в крови проверяется с помощью теста ЩФ, который часто является частью обычных анализов крови. Уровни этого фермента в крови зависят от таких факторов, как возраст, пол или группа крови. [2] Уровень щелочной фосфатазы в крови также увеличивается в два-четыре раза во время беременности. Это результат дополнительной щелочной фосфатазы, вырабатываемой плацентой и печенью. [3] [4] Кроме того, аномальные уровни щелочной фосфатазы в крови могут указывать на проблемы, связанные с печенью, желчным пузырем или костями. Опухоли и инфекции почек, а также недостаточность питания также демонстрируют аномальный уровень щелочной фосфатазы в крови. [2] Уровни щелочной фосфатазы в клетке можно измерить с помощью процесса, называемого «Метод оценки». Обычно берут и окрашивают мазок крови, чтобы отнести каждый лейкоцит к определенным «лейкоцитарным индексам щелочной фосфатазы». Этот маркер предназначен для распознавания лейкоцитов и определения различной активности ферментов в зависимости от степени окрашивания каждого образца. [5]
У грамотрицательных бактерий , таких как Escherichia coli , щелочная фосфатаза расположена в периплазматическом пространстве , снаружи внутренней клеточной мембраны и внутри пептидогликановой части клеточной стенки. Поскольку периплазматическая щель более подвержена изменениям окружающей среды, чем внутренняя клетка, щелочная фосфатаза достаточно устойчива к инактивации, денатурации или деградации . Эта характеристика фермента необычна для многих других белков. [6]
Точная структура и функция изофермента E. coli направлены исключительно на обеспечение источника неорганического фосфата, когда в окружающей среде не хватает этого метаболита. Неорганические фосфаты затем связываются с белками-переносчиками, которые доставляют неорганические фосфаты в специфическую транспортную систему с высоким сродством, известную как фосфат-специфическая транспортная система (система Pst), которая транспортирует фосфат через цитоплазматическую мембрану. [7]
В то время как внешняя мембрана E. coli содержит порины, проницаемые для фосфорилированных соединений, внутренняя мембрана этого не делает. Возникает вопрос, как транспортировать такие соединения через внутреннюю мембрану в цитозоль. Сильный анионный заряд фосфатных групп вместе с остальной частью соединения делает фосфорилированные соединения очень несмешиваемыми в неполярной области бислоя. Решение возникает при отщеплении фосфатной группы от соединения посредством ЩФ. Реакция дефосфорилирования, которую катализирует ЩФ, приводит к образованию чистого неорганического фосфата, который в конечном итоге может быть направлен системой Pst [8] для транслокации в цитозоль [9] с сопутствующей продукцией дефосфорилированного соединения. Таким образом, основная цель дефосфорилирования щелочной фосфатазой состоит в том, чтобы увеличить скорость диффузии фосфорилированных молекул в клетки, одновременно препятствуя их диффузии. [10]
Щелочная фосфатаза представляет собой цинксодержащий димерный фермент с молекулярной массой 86 000 Да, каждая субъединица которого содержит 429 аминокислот с четырьмя цистеиновыми остатками, связывающими две субъединицы. [11] Щелочная фосфатаза содержит четыре иона Zn и два иона Mg, при этом Zn занимает активные центры A и B, а Mg — сайт C, поэтому полностью активная нативная щелочная фосфатаза называется ферментом (Zn A Zn B Mg C ) 2 . . Механизм действия щелочной фосфатазы включает геометрическую координацию субстрата между ионами Zn в активных центрах, тогда как сайт Mg не оказывается достаточно близким, чтобы непосредственно участвовать в механизме гидролиза, однако он может способствовать форма электростатического потенциала вокруг активного центра. [11]
Щелочная фосфатаза в E. coli редко растворима и активна в условиях повышенных температур, таких как 80 ° C. Из-за кинетической энергии, вызванной этой температурой, слабые водородные связи и гидрофобные взаимодействия обычных белков разрушаются и, следовательно, сливаются и выпадают в осадок. Однако при димеризации щелочной фосфатазы связи, поддерживающие ее вторичную и третичную структуры, эффективно похоронены, так что при этой температуре на них не так сильно влияет. Более того, даже при более высоких температурах, таких как 90 °C, щелочная фосфатаза обладает необычным свойством обратной денатурации. Благодаря этому, хотя он в конечном итоге денатурирует при температуре около 90 ° C, он обладает дополнительной способностью точно реформировать свои связи и возвращаться к своей исходной структуре и функциям после повторного охлаждения. [6]
Щелочная фосфатаза в E. coli расположена в периплазматическом пространстве и поэтому может высвобождаться с помощью методов, которые ослабляют клеточную стенку и высвобождают белок. Из-за расположения фермента и структуры белков фермента фермент находится в растворе с меньшим количеством белков, чем в другой части клетки.[12] Термостабильность белков также можно использовать при выделении этого фермента (посредством тепловой денатурации). Кроме того, щелочную фосфатазу можно определить с использованием п-нитрофенилфосфата. Реакция, при которой щелочная фосфатаза дефосфорилирует неспецифический субстрат, п-нитрофенилфосфат, с образованием п-нитрофенола (ПНФ) и неорганического фосфата. Желтый цвет PNP и его λ max при 410 позволяют спектрофотометрически определять важную информацию о ферментативной активности. [13] Некоторые сложности бактериальной регуляции и метаболизма позволяют предположить, что другие, более тонкие цели фермента также могут играть роль в клетке. Однако в лаборатории мутантные Escherichia coli , лишенные щелочной фосфатазы, выживают довольно хорошо, как и мутанты, неспособные остановить выработку щелочной фосфатазы. [14]
Оптимальный pH для активности фермента E. coli составляет 8,0 [15] , тогда как оптимум pH бычьего фермента немного выше и составляет 8,5. [16] Щелочная фосфатаза составляет 6% всех белков в дерепрессированных клетках. [17]
Когда несколько копий полипептида, кодируемого геном , образуют агрегат, такая белковая структура называется мультимером. Когда мультимер образуется из полипептидов, продуцируемых двумя разными мутантными аллелями конкретного гена, смешанный мультимер может проявлять большую функциональную активность, чем несмешанные мультимеры, образованные каждым из мутантов по отдельности. В таком случае это явление называется внутригенной комплементацией . Щелочная фосфатаза E. coli , димерный фермент, обладает внутригенной комплементацией. [18] Когда были объединены отдельные мутантные версии щелочной фосфатазы, образовавшиеся в результате гетеродимерные ферменты проявили более высокий уровень активности, чем можно было бы ожидать, исходя из относительной активности родительских ферментов. Эти результаты показали, что димерная структура щелочной фосфатазы E.coli обеспечивает кооперативные взаимодействия между составляющими мономерами, которые могут генерировать более функциональную форму голофермента. [ нужна цитата ]
За счет изменения аминокислот фермента щелочной фосфатазы дикого типа, продуцируемого Escherichia coli , создается мутантная щелочная фосфатаза, которая не только имеет 36-кратное увеличение активности фермента, но и сохраняет термическую стабильность. [19] Типичное использование щелочных фосфатаз в лаборатории включает удаление моноэфиров фосфатов для предотвращения самолигирования, что нежелательно во время клонирования плазмидной ДНК . [20]
Общие щелочные фосфатазы, используемые в исследованиях, включают:
Человеческая кишечная щелочная фосфатаза демонстрирует около 80% гомологии с бычьим кишечным ферментом, что подтверждает их общее эволюционное происхождение. Тот же самый бычий фермент имеет более чем 70% гомологию с плацентарным ферментом человека. Однако фермент печени человека и фермент плаценты имеют лишь 20% гомологии, несмотря на их структурное сходство. [23]
Щелочная фосфатаза стала полезным инструментом в лабораториях молекулярной биологии , поскольку ДНК обычно содержит фосфатные группы на 5'- конце. Удаление этих фосфатов предотвращает лигирование ДНК (5'-конец прикрепляется к 3'- концу), тем самым сохраняя линейность молекул ДНК до следующего этапа процесса, для которого они готовятся; кроме того, удаление фосфатных групп позволяет проводить радиоактивное мечение (замену радиоактивными фосфатными группами) для измерения присутствия меченой ДНК на дальнейших этапах процесса или эксперимента. Для этих целей наиболее полезна щелочная фосфатаза креветок, поскольку ее легче всего инактивировать после того, как она выполнила свою работу. [ нужна цитата ]
Другое важное применение щелочной фосфатазы — это метка для иммуноферментных анализов . [ нужна цитата ]
Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки имеют повышенный уровень щелочной фосфатазы на клеточной мембране , поэтому окрашивание щелочной фосфатазой используется для обнаружения этих клеток и проверки плюрипотентности (т. е. эмбриональных стволовых клеток или клеток эмбриональной карциномы ). [24]
Существует положительная корреляция между уровнями костной щелочной фосфатазы в сыворотке крови и костеобразованием у людей, хотя ее использование в качестве биомаркера в клинической практике не рекомендуется. [25]
Текущие исследователи изучают увеличение уровня фактора некроза опухоли-α и его прямое влияние на экспрессию щелочной фосфатазы в гладкомышечных клетках сосудов, а также то, как щелочная фосфатаза (AP) влияет на воспалительные реакции и может играть прямую роль в предотвращении поражения органов. повреждать. [26]
Щелочная фосфатаза обычно используется в молочной промышленности как индикатор успешной пастеризации. Это связано с тем, что самая термостабильная бактерия , обнаруженная в молоке , Mycobacterium paratuberculosis , разрушается при температурах ниже тех, которые необходимы для денатурации фермента. Поэтому его присутствие идеально подходит для указания на неудачную пастеризацию. [30] [31]
Проверка пастеризации обычно выполняется путем измерения флуоресценции раствора, который становится флуоресцентным при воздействии активной щелочной фосфатазы. Производителям молока в Великобритании требуются флуориметрические анализы, чтобы доказать денатурацию щелочной фосфатазы, [32] поскольку тесты на п-нитрофенилфосфат не считаются достаточно точными, чтобы соответствовать стандартам здравоохранения.
В качестве альтернативы можно использовать изменение цвета п -нитрофенилфосфата в качестве субстрата в буферном растворе (тест Ашаффенбурга-Муллена). [33] Сырое молоко обычно приобретает желтую окраску в течение нескольких минут, тогда как правильно пастеризованное молоко не должно иметь никаких изменений. Есть исключения из этого правила, как, например, термостабильные щелочные фосфатазы, продуцируемые некоторыми бактериями, но эти бактерии не должны присутствовать в молоке. [ нужна цитата ]
Все изоферменты щелочной фосфатазы млекопитающих, кроме плацентарной (PALP и SEAP), ингибируются гомоаргинином , и аналогичным образом все, кроме кишечной и плацентарной, блокируются левамизолом . [34] Фосфат является еще одним ингибитором, который конкурентно ингибирует щелочную фосфатазу. [35]
Другим известным примером ингибитора щелочной фосфатазы является [(4-нитрофенил)метил]фосфоновая кислота. [36]
В почве, загрязненной металлами, щелочная фосфатаза ингибируется Cd (кадмием). Кроме того, температура усиливает ингибирование Cd активности фермента, что проявляется в увеличении значений K m . [37]
У человека щелочная фосфатаза присутствует во всех тканях организма, но особенно сконцентрирована в печени , желчных протоках , почках , костях , слизистой оболочке кишечника и плаценте . В сыворотке крови преобладают два типа изоферментов щелочной фосфатазы : скелетный и печеночный. В детстве большая часть щелочной фосфатазы имеет скелетное происхождение. [38] Люди и большинство других млекопитающих содержат следующие изоферменты щелочной фосфатазы: [ нужна ссылка ]
Четыре гена кодируют четыре изофермента. Ген тканенеспецифической щелочной фосфатазы расположен на хромосоме 1 , а гены трех других изоформ — на хромосоме 2 . [39]
Кишечная щелочная фосфатаза секретируется энтероцитами и , по-видимому, играет ключевую роль в кишечном гомеостазе и защите [40] [41] , а также в подавлении воспаления [42] посредством репрессии нижестоящего Toll-подобного рецептора (TLR)-4 . зависимый и MyD88 -зависимый воспалительный каскад. [43] Он дефосфорилирует токсичные/воспалительные микробные лиганды, такие как липополисахариды (ЛПС), [44] неметилированные цитозин-гуаниндинуклеотиды, флагеллин и внеклеточные нуклеотиды, такие как уридиндифосфат или АТФ. Дефосфорилирование ЛПС с помощью IAP может снизить тяжесть инфекции Salmonella Tryphimurium и Clostridioides difficile , восстанавливая нормальную микробиоту кишечника. [44] Таким образом, измененная экспрессия IAP связана с хроническими воспалительными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). [44] [45] Он также, по-видимому, регулирует всасывание липидов [46] и секрецию бикарбоната [47] в слизистой двенадцатиперстной кишки, что регулирует поверхностный pH. С 1960-х годов кишечная щелочная фосфатаза используется для доставки лекарств . Поскольку этот фермент расщепляет фосфатные субструктуры лекарств, вспомогательных веществ и даже поверхности наноносителей, он позволяет создавать системы доставки лекарств, которые могут изменять свои свойства в организме по требованию. [48] Растворимость многих лекарств можно существенно улучшить за счет разработки фосфатных пролекарств . На слизистой оболочке кишечника фосфатные субструктуры расщепляются щелочной фосфатазой и препарат всасывается. [49] Кроме того, анионные наноносители, обладающие биоинертными свойствами, могут изменить свою поверхность на интерактивную после достижения кишечного эпителия, поскольку из-за инициируемого щелочной фосфатазой отщепления анионных фосфатных групп от их поверхностного заряда преобразуется в катионное улучшение, например, клеточного поглощения. [50]
Исследования показывают, что белок щелочной фосфатазы, обнаруженный в раковых клетках, аналогичен белку, обнаруженному в доброкачественных тканях организма, и что в обоих случаях этот белок происходит от одного и того же гена. В одном исследовании сравнивались ферменты метастазов в печень гигантоклеточной карциномы легкого и доброкачественных плацентарных клеток. Они были сходны по NH 2 -концевой последовательности, пептидной карте, молекулярной массе субъединицы и изоэлектронной точке. [51]
В другом исследовании, в котором ученые изучали присутствие белка щелочной фосфатазы в линии клеток рака толстой кишки человека, также известной как HT-29, результаты показали, что активность фермента аналогична активности незлокачественного кишечного типа. Однако это исследование показало, что без влияния бутирата натрия активность щелочной фосфатазы в раковых клетках довольно низкая. [52] Исследование, основанное на влиянии бутирата натрия на раковые клетки, показало, что он влияет на экспрессию корегулятора андрогенных рецепторов, транскрипционную активность, а также на ацетилирование гистонов в раковых клетках. [53] Это объясняет, почему добавление бутирата натрия демонстрирует повышенную активность щелочной фосфатазы в раковых клетках толстой кишки человека. [52] Кроме того, это еще раз подтверждает теорию о том, что активность фермента щелочной фосфатазы действительно присутствует в раковых клетках. [ нужна цитата ]
В другом исследовании клетки хориокарциномы выращивали в присутствии 5-бром-2'-дезоксиуридина, и результаты показали 30-40-кратное увеличение активности щелочной фосфатазы. Эта процедура повышения активности фермента известна как индукция фермента . Имеющиеся данные показывают, что активность щелочной фосфатазы в опухолевых клетках действительно существует, но она минимальна и ее необходимо повысить. Результаты этого исследования также показывают, что активность этого фермента различается в разных клеточных линиях хориокарциномы и что активность белка щелочной фосфатазы в этих клетках ниже, чем в доброкачественных клетках плаценты. [54] [55] , но уровни значительно выше у детей и беременных женщин. Анализы крови всегда следует интерпретировать с использованием референсного диапазона лаборатории, проводившей анализ. Высокий уровень щелочной фосфатазы может возникнуть при обструкции желчных протоков . [56]
Кроме того, уровень щелочной фосфатазы увеличивается, если происходит активное костеобразование, поскольку фермент является побочным продуктом активности остеобластов (как в случае болезни Педжета костей ). [ нужна цитата ]
Уровень щелочной фосфатазы гораздо более повышен в метастатических клетках рака простаты , чем в неметастатических клетках рака простаты. [57] Высокий уровень ЩФ у пациентов с раком простаты связан со значительным снижением выживаемости. [57]
Уровни также повышены у людей с нелеченой целиакией . [58] Пониженные уровни щелочной фосфатазы встречаются реже, чем повышенные. Источник повышенных уровней можно установить путем определения уровня γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови . Сопутствующее повышение уровня щелочной фосфатазы и γ-глутамилтрансферазы должно вызывать подозрение на гепатобилиарное заболевание. [59]
Некоторые заболевания не влияют на уровень щелочной фосфатазы, например, гепатит С. Высокий уровень этого фермента не отражает какого-либо поражения печени, хотя высокий уровень щелочной фосфатазы может быть результатом закупорки кровотока в желчевыводящих путях или повышение давления в печени. [60]
Если неясно, почему уровень щелочной фосфатазы повышен, исследование изоферментов с помощью электрофореза может подтвердить источник повышения. Скельфосфатаза (которая локализуется в остеобластах и внеклеточных слоях вновь синтезированного матрикса) высвобождается в кровообращение по пока неясному механизму. [61] Плацентарная щелочная фосфатаза повышена при семиномах [62] и активных формах рахита , а также при следующих заболеваниях и состояниях: [63]
Следующие состояния или заболевания могут привести к снижению уровня щелочной фосфатазы: [67]
Было показано, что измерение щелочной фосфатазы (вместе со специфическим антигеном простаты) во время и после шести месяцев лечения метастатического рака простаты гормонами позволяет прогнозировать выживаемость пациентов. [69]
Лейкоцитарная щелочная фосфатаза обнаруживается в зрелых лейкоцитах . Уровни лейкоцитов LAP могут помочь в диагностике определенных состояний. [ нужна цитата ]
Щелочная фосфатаза является гомодимерным ферментом, то есть состоит из двух молекул. В каталитических центрах содержатся три иона металлов, два иона Zn и один Mg, и оба типа имеют решающее значение для проявления ферментативной активности. Ферменты катализируют гидролиз моноэфиров в фосфорной кислоте, что дополнительно может катализировать реакцию трансфосфорилирования с большими концентрациями акцепторов фосфата. Хотя основные особенности каталитического механизма и активности сохраняются у щелочного фосфата млекопитающих и бактерий, щелочная фосфатаза млекопитающих имеет более высокую удельную активность и значения K m , следовательно, более низкое сродство, более щелочной оптимум pH, меньшую термостабильность и, как правило, мембраносвязанные. и ингибируются L-аминокислотами и пептидами по неконкурентному механизму. Эти свойства заметно различаются у разных изоферментов щелочной фосфатазы млекопитающих и, следовательно, демонстрируют разницу в функциях in vivo . [ нужна цитата ]
Щелочная фосфатаза имеет гомологию с большим количеством других ферментов и составляет часть суперсемейства ферментов с несколькими перекрывающимися каталитическими аспектами и характеристиками субстрата. Это объясняет, почему наиболее характерные структурные особенности щелочных кислот млекопитающих такие, какие они есть, и указывают на их субстратную специфичность и гомологию с другими членами семейства изоферментов нуклеозидпирофосфатазы/фосфодиэстеразы. [39] Исследования показали связь между членами семейства щелочных фосфатаз и арилсульфатазами. Сходство в структуре указывает на то, что эти два семейства ферментов произошли от общего предка. Дальнейший анализ связал щелочные фосфаты и арилсульфатазы с более крупным суперсемейством. Некоторые из общих генов, обнаруженных в этом суперсемействе, кодируют фосфодиэстеразу, а также аутотоксин. [71]
{{cite journal}}
: CS1 maint: DOI неактивен по состоянию на январь 2024 г. ( ссылка )