Молекулярная биология / m ə ˈ l ɛ k j ʊ l ər / — это раздел биологии , который стремится понять молекулярные основы биологической активности внутри и между клетками , включая биомолекулярный синтез, модификацию, механизмы и взаимодействия. [1] [2] [3]
Хотя клетки и другие микроскопические структуры наблюдались в живых организмах еще в 18 веке, детальное понимание механизмов и взаимодействий, управляющих их поведением, не возникло до 20 века, когда технологии, используемые в физике и химии, продвинулись достаточно далеко, чтобы позволить их применение в биологических науках. Термин «молекулярная биология» впервые был использован в 1945 году английским физиком Уильямом Эстбери , который описал его как подход, направленный на выяснение основ биологических явлений, т.е. раскрытие физических и химических структур и свойств биологических молекул, а также их взаимодействия с другими молекулами и то, как эти взаимодействия объясняют наблюдения так называемой классической биологии, которая вместо этого изучает биологические процессы в более крупных масштабах и на более высоких уровнях организации. [4] В 1953 году Фрэнсис Крик , Джеймс Уотсон , Розалинд Франклин и их коллеги из Отделения Совета медицинских исследований Кавендишской лаборатории первыми описали модель двойной спирали для химической структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая часто считается знаковым событием для зарождающейся области, поскольку оно предоставило физико-химическую основу для понимания ранее туманной идеи о нуклеиновых кислотах как основном веществе биологической наследственности. Они предложили эту структуру на основе предыдущих исследований Франклина, которые им передали Морис Уилкинс и Макс Перуц . [5] Их работа привела к открытию ДНК у других микроорганизмов, растений и животных. [6]
Область молекулярной биологии включает методы, которые позволяют ученым изучать молекулярные процессы. [7] Эти методы используются для эффективного поиска новых лекарств, диагностики заболеваний и лучшего понимания физиологии клеток. [8] Некоторые клинические исследования и медицинские методы лечения, возникающие на основе молекулярной биологии, охватываются генной терапией , тогда как использование молекулярной биологии или молекулярно-клеточной биологии в медицине теперь называется молекулярной медициной .
Молекулярная биология находится на стыке биохимии и генетики ; По мере того как эти научные дисциплины возникли и развивались в 20 веке, стало ясно, что обе они стремились определить молекулярные механизмы, лежащие в основе жизненно важных клеточных функций. [9] Достижения молекулярной биологии тесно связаны с разработкой новых технологий и их оптимизацией. [10] Молекулярная биология была объяснена работами многих ученых, и поэтому история этой области зависит от понимания этих ученых и их экспериментов. [ нужна цитата ]
Область генетики возникла в результате попыток понять набор правил, лежащих в основе воспроизводства и наследственности , а также природу гипотетических единиц наследственности, известных как гены . Грегор Мендель начал эту работу в 1866 году, когда он впервые описал законы наследственности, которые он наблюдал в своих исследованиях скрещивания растений гороха. [11] Одним из таких законов генетического наследования является закон сегрегации , который гласит, что диплоидные особи с двумя аллелями определенного гена передадут одну из этих аллелей своему потомству. [12] Из-за его критической работы изучение генетической наследственности обычно называют менделевской генетикой . [13]
Важнейшей вехой в молекулярной биологии стало открытие структуры ДНК . Эта работа началась в 1869 году Фридрихом Мишером , швейцарским биохимиком, который первым предложил структуру, называемую нуклеином , которая, как мы теперь знаем, представляет собой (дезоксирибонуклеиновую кислоту) или ДНК. [14] Он открыл это уникальное вещество, изучая компоненты гнойных повязок и отмечая уникальные свойства «фосфорсодержащих веществ». [15] Другим заметным автором модели ДНК был Феб Левен , который предложил «полинуклеотидную модель» ДНК в 1919 году в результате своих биохимических экспериментов на дрожжах. [16] В 1950 году Эрвин Чаргафф расширил работу Левена и выяснил несколько важных свойств нуклеиновых кислот: во-первых, последовательность нуклеиновых кислот варьируется у разных видов. [17] Во-вторых, общая концентрация пуринов (аденина и гуанина) всегда равна общей концентрации пиримидинов (цистеина и тимина). [14] Теперь это известно как правило Чаргаффа. В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали двойную спиральную структуру ДНК, [18] основанную на работе по рентгеновской кристаллографии Розалинд Франклин , которую им передали Морис Уилкинс и Макс Перуц . [5] Уотсон и Крик описали структуру ДНК и высказали предположения о значении этой уникальной структуры для возможных механизмов репликации ДНК. [18] Уотсон и Крик были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1962 году вместе с Уилкинсом за предложение модели структуры ДНК. [6]
В 1961 году было продемонстрировано, что когда ген кодирует белок , три последовательных основания ДНК гена определяют каждую последующую аминокислоту белка. [19] Таким образом, генетический код представляет собой триплетный код, где каждый триплет (называемый кодоном ) определяет определенную аминокислоту. Кроме того, было показано, что кодоны не перекрываются друг с другом в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что каждая последовательность считывается с фиксированной начальной точки. В 1962–1964 годах благодаря использованию условно летальных мутантов бактериального вируса [20] были достигнуты фундаментальные успехи в понимании функций и взаимодействий белков, участвующих в механизмах репликации ДНК , репарации ДНК , рекомбинации ДНК и при сборке молекулярных структур. [21]
В 1928 году Фредерик Гриффит обнаружил свойство вирулентности бактерий пневмококка , которое убивало лабораторных крыс. По мнению Менделя, распространенному в то время, передача генов могла происходить только от родительских клеток к дочерним. Гриффит выдвинул другую теорию, заявив, что перенос генов, происходящий у представителей одного поколения, известен как горизонтальный перенос генов (HGT). Это явление теперь называется генетической трансформацией. [22]
Эксперимент Гриффита касался бактерий пневмококка, у которых было два разных штамма: один вирулентный и гладкий, а другой авирулентный и шероховатый. Гладкий штамм имел блестящий внешний вид благодаря наличию особого типа полисахарида – капсулы полимера глюкозы и глюкуроновой кислоты. Из-за этого полисахаридного слоя бактерий иммунная система хозяина не может распознать бактерии и убивает хозяина. Другой, авирулентный, шероховатый штамм лишен этой полисахаридной капсулы и имеет тусклый, шероховатый вид. [ нужна цитата ]
Известно, что наличие или отсутствие капсулы у штамма генетически детерминировано. Гладкие и шероховатые деформации встречаются в нескольких различных типах, таких как SI, S-II, S-III и т. д. и RI, R-II, R-III и т. д. соответственно. Все эти подтипы бактерий S и R отличаются друг от друга типом продуцируемого ими антигена. [6]
Эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти стал знаковым исследованием, проведенным в 1944 году и продемонстрировавшим, что ДНК, а не белок, как считалось ранее, несет генетическую информацию у бактерий. Освальд Эйвери , Колин Манро Маклауд и Маклин Маккарти использовали экстракт штамма пневмококка , который мог вызвать пневмонию у мышей. Они показали, что генетическую трансформацию бактерий можно осуществить, вводя им очищенную ДНК из экстракта. Они обнаружили, что когда ДНК в экстракте переваривалась ДНКазой , трансформация безвредных бактерий в вирулентные терялась. Это предоставило убедительные доказательства того, что ДНК является генетическим материалом, бросив вызов преобладающему мнению о том, что за это ответственны белки. Это заложило основу для последующего открытия его структуры Уотсоном и Криком.
Подтверждение того, что ДНК является генетическим материалом, вызывающим инфекцию, было получено в эксперименте Херши-Чейза . Для эксперимента они использовали кишечную палочку и бактериофаг. Этот эксперимент также известен как эксперимент с блендером, поскольку кухонный блендер использовался в качестве основного прибора. Альфред Херши и Марта Чейз продемонстрировали, что ДНК, введенная фаговой частицей в бактерию, содержит всю информацию, необходимую для синтеза фаговых частиц-потомков. Они использовали радиоактивность, чтобы пометить белковую оболочку бактериофага радиоактивной серой и ДНК радиоактивным фосфором в двух разных пробирках соответственно. После смешивания бактериофага и E.coli в пробирке начинается инкубационный период, в течение которого фаг трансформирует генетический материал в клетках E.coli . Затем смесь смешивают или взбалтывают, что отделяет фаг от клеток E.coli . Всю смесь центрифугировали, осадок, содержащий клетки E.coli , проверяли, а супернатант отбрасывали. В клетках E.coli был обнаружен радиоактивный фосфор, что указывало на то, что трансформированный материал представлял собой ДНК, а не белковую оболочку.
Трансформированная ДНК прикрепляется к ДНК E.coli , и радиоактивность наблюдается только на ДНК бактериофага. Эта мутировавшая ДНК может быть передана следующему поколению, и появилась теория трансдукции. Трансдукция — это процесс, при котором бактериальная ДНК переносит фрагмент бактериофага и передает его следующему поколению. Это также тип горизонтального переноса генов. [6]
Эксперимент Мезельсона-Шталя стал знаковым экспериментом в молекулярной биологии, который предоставил доказательства полуконсервативной репликации ДНК. Проведенный в 1958 году Мэтью Мезельсоном и Франклином Сталем эксперимент включал выращивание бактерий E. coli в среде, содержащей тяжелый изотоп азота ( 15 N) в течение нескольких поколений. Это привело к тому, что вся вновь синтезированная бактериальная ДНК оказалась включенной в состав тяжелого изотопа.
После того как бактериям дали возможность размножиться в среде, содержащей нормальный азот ( 14 N), образцы отбирали в различные моменты времени. Затем эти образцы подвергали центрифугированию в градиенте плотности, в результате чего молекулы ДНК разделялись в зависимости от их плотности.
Результаты показали, что после одного поколения репликации в среде 14 N ДНК образовывала полосу промежуточной плотности между полосой чистой 15 N ДНК и чистой 14 N ДНК. Это поддержало полуконсервативную репликацию ДНК, предложенную Уотсоном и Криком, где каждая цепь родительской молекулы ДНК служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи, в результате чего образуются две дочерние молекулы ДНК, каждая из которых состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной цепи. .
Эксперимент Мезельсона-Сталя предоставил убедительные доказательства полуконсервативной репликации ДНК, которая имеет фундаментальное значение для понимания генетики и молекулярной биологии.
В начале 2020-х годов молекулярная биология вступила в золотой век, определяемый как вертикальным, так и горизонтальным техническим развитием. В вертикальном плане новые технологии позволяют в режиме реального времени отслеживать биологические процессы на атомном уровне. [23] Сегодня молекулярные биологи имеют доступ к все более доступным данным секвенирования на все более глубоких глубинах, что облегчает разработку новых методов генетических манипуляций с новыми немодельными организмами. Аналогичным образом, специалисты по синтетической молекулярной биологии будут стимулировать промышленное производство малых и макромолекул путем введения экзогенных метаболических путей в различные линии прокариотических и эукариотических клеток. [24]
Горизонтально данные секвенирования становятся все более доступными и используются во многих различных научных областях. Это будет способствовать развитию промышленности в развивающихся странах и увеличит доступность для отдельных исследователей. Аналогичным образом, эксперименты по редактированию генов CRISPR-Cas9 теперь могут быть задуманы и реализованы отдельными людьми менее чем за 10 000 долларов США на новых организмах, что будет способствовать развитию промышленных и медицинских приложений. [25]
В следующем списке описывается точка зрения на междисциплинарные отношения между молекулярной биологией и другими смежными областями. [26]
Хотя исследователи практикуют методы, специфичные для молекулярной биологии, обычно они комбинируются с методами генетики и биохимии . Большая часть молекулярной биологии носит количественный характер, и в последнее время значительный объем работы был выполнен с использованием таких методов информатики, как биоинформатика и вычислительная биология . Молекулярная генетика , изучение структуры и функции генов, была одной из наиболее известных областей молекулярной биологии с начала 2000-х годов. Другие разделы биологии получают информацию от молекулярной биологии, либо напрямую изучая взаимодействия молекул сами по себе, например, в клеточной биологии и биологии развития , либо косвенно, когда молекулярные методы используются для вывода об исторических атрибутах популяций или видов , как в области эволюционной биологии , такие как популяционная генетика и филогенетика . В биофизике также существует давняя традиция изучения биомолекул «с нуля», или молекулярно . [29]
Молекулярное клонирование используется для выделения и последующего переноса интересующей последовательности ДНК в плазмидный вектор. [30] Эта технология рекомбинантной ДНК была впервые разработана в 1960-х годах. [31] В этом методе последовательность ДНК , кодирующая интересующий белок, клонируется с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или ферментов рестрикции в плазмиду ( вектор экспрессии ). Плазмидный вектор обычно имеет как минимум три отличительные особенности: начало репликации, сайт множественного клонирования (MCS) и селективный маркер (обычно устойчивость к антибиотикам ). Кроме того, выше MCS находятся промоторные области и сайт начала транскрипции , которые регулируют экспрессию клонированного гена.
Эту плазмиду можно вставлять как в бактериальные, так и в животные клетки. Введение ДНК в бактериальные клетки может быть осуществлено путем трансформации путем поглощения голой ДНК, конъюгации посредством межклеточного контакта или трансдукции с помощью вирусного вектора. Введение ДНК в эукариотические клетки, например клетки животных, физическими или химическими средствами называется трансфекцией . Доступно несколько различных методов трансфекции, таких как трансфекция фосфатом кальция, электропорация , микроинъекция и трансфекция липосом . Плазмида может быть интегрирована в геном , что приводит к стабильной трансфекции, или может оставаться независимой от генома и временно экспрессироваться, что называется временной трансфекцией. [32] [33]
ДНК, кодирующая интересующий белок, теперь находится внутри клетки, и теперь этот белок можно экспрессировать. Доступны различные системы, такие как индуцируемые промоторы и специфические клеточные сигнальные факторы, которые помогают экспрессировать интересующий белок на высоких уровнях. Затем из бактериальной или эукариотической клетки можно экстрагировать большие количества белка. Белок можно проверить на ферментативную активность в различных ситуациях, белок можно кристаллизовать для изучения его третичной структуры или, в фармацевтической промышленности, можно изучить активность новых лекарств против белка. [34]
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — чрезвычайно универсальный метод копирования ДНК. Короче говоря, ПЦР позволяет копировать или модифицировать определенную последовательность ДНК заранее определенным образом. Реакция чрезвычайно мощная и в идеальных условиях может амплифицировать одну молекулу ДНК до 1,07 миллиарда молекул менее чем за два часа. ПЦР имеет множество применений, включая изучение экспрессии генов, обнаружение патогенных микроорганизмов, обнаружение генетических мутаций и введение мутаций в ДНК. [35] Метод ПЦР можно использовать для введения сайтов рестрикционных ферментов на концы молекул ДНК или для мутации определенных оснований ДНК; последний метод называется сайт-направленным мутагенезом . ПЦР также можно использовать для определения того, обнаружен ли конкретный фрагмент ДНК в библиотеке кДНК . ПЦР имеет множество разновидностей, таких как ПЦР с обратной транскрипцией ( ОТ-ПЦР ) для амплификации РНК и, в последнее время, количественная ПЦР , которая позволяет количественно измерять молекулы ДНК или РНК. [36] [37]
.jpg/1280px-Two_percent_Agarose_Gel_in_Borate_Buffer_cast_in_a_Gel_Tray_(Front,_angled).jpg)
Гель-электрофорез — это метод разделения молекул по размеру с использованием агарозного или полиакриламидного геля. [38] Этот метод является одним из основных инструментов молекулярной биологии. Основной принцип заключается в том, что фрагменты ДНК можно разделить, пропуская через гель электрический ток: поскольку основная цепь ДНК содержит отрицательно заряженные фосфатные группы, ДНК будет мигрировать через агарозный гель в направлении положительного конца тока. [38] Белки также можно разделить по размеру с использованием геля SDS-PAGE или по размеру и их электрическому заряду с помощью так называемого 2D-гель-электрофореза . [39]
Анализ Брэдфорда — это метод молекулярной биологии, который позволяет быстро и точно определить количество белковых молекул, используя уникальные свойства красителя Coomassie Brilliant Blue G-250. [40] Кумасси синий претерпевает видимый сдвиг цвета от красновато-коричневого до ярко-синего при связывании с белком. [40] В нестабильном катионном состоянии кумасси синий имеет фоновую длину волны 465 нм и излучает красновато-коричневый цвет. [41] Когда кумасси синий связывается с белком в кислом растворе, длина волны фона смещается до 595 нм, и краситель приобретает ярко-синий цвет. [41] Белки, участвовавшие в анализе, связываются с кумасси синим примерно за 2 минуты, а комплекс белок-краситель стабилен в течение примерно часа, хотя рекомендуется измерять поглощение в течение 5–20 минут после начала реакции. [40] Концентрацию белка в анализе Брэдфорда можно затем измерить с помощью спектрофотометра видимого света , и поэтому он не требует обширного оборудования. [41]
Этот метод был разработан в 1975 году Мэрион М. Брэдфорд и позволил значительно быстрее и точнее проводить количественный анализ белка по сравнению с предыдущими методами: процедурой Лоури и биуретовым анализом. [40] В отличие от предыдущих методов, анализ Брэдфорда не подвержен влиянию нескольких небелковых молекул, включая этанол, хлорид натрия и хлорид магния. [40] Однако он подвержен влиянию сильных щелочных буферных агентов, таких как додецилсульфат натрия (SDS). [40]
Термины нозерн- , вестерн- и восточный блоттинг произошли от того, что первоначально было шуткой молекулярной биологии, которая разыграла термин Саузерн-блоттинг после метода, описанного Эдвином Саузерн для гибридизации блоттинга ДНК. Патрисия Томас, разработчик РНК-блоттинга, который затем стал известен как нозерн-блоттинг , на самом деле не использовала этот термин. [42]
Названный в честь своего изобретателя, биолога Эдвина Саузерна , Саузерн-блоттинг представляет собой метод исследования наличия определенной последовательности ДНК в образце ДНК. Образцы ДНК до или после расщепления ферментом рестрикции (рестрикционной эндонуклеазой) разделяются с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на мембрану путем блоттинга посредством капиллярного действия . Затем мембрану подвергают воздействию меченого ДНК-зонда, который имеет последовательность оснований, комплементарную последовательности интересующей ДНК. [43] Саузерн-блоттинг реже используется в лабораторных исследованиях из-за способности других методов, таких как ПЦР , обнаруживать определенные последовательности ДНК из образцов ДНК. Однако эти блоты все еще используются для некоторых приложений, таких как измерение количества копий трансгена у трансгенных мышей или при конструировании линий эмбриональных стволовых клеток с нокаутом генов . [29]
Нозерн-блоттинг используется для изучения присутствия специфических молекул РНК в качестве относительного сравнения между набором различных образцов РНК. По сути, это комбинация денатурирующего гель-электрофореза РНК и блоттинга . В этом процессе РНК разделяется по размеру, а затем переносится на мембрану, которая затем исследуется меченым комплементом интересующей последовательности. Результаты можно визуализировать различными способами в зависимости от используемой метки; однако большинство из них приводит к обнаружению полос, отражающих размеры РНК, обнаруженной в образце. Интенсивность этих полос связана с количеством целевой РНК в анализируемых образцах. Эта процедура обычно используется для изучения того, когда и в каком объеме происходит экспрессия генов, путем измерения количества этой РНК, присутствующей в различных образцах, при условии, что посттранскрипционная регуляция не происходит и что уровни мРНК отражают пропорциональные уровни соответствующего белка, находящегося в организме. произведено. Это один из основных инструментов для определения того, в какое время и при каких условиях определенные гены экспрессируются в живых тканях. [44] [45]
Вестерн-блоттинг — это метод, с помощью которого можно обнаружить определенные белки из смеси белков. [46] Вестерн-блоттинг можно использовать для определения размера выделенных белков, а также для количественной оценки их экспрессии. [47] При вестерн-блоттинге белки сначала разделяются по размеру в тонком геле, зажатом между двумя стеклянными пластинами, с помощью метода, известного как SDS-PAGE . Белки в геле затем переносятся на поливинилиденфторид (ПВДФ), нитроцеллюлозу, нейлон или другую опорную мембрану. Эту мембрану затем можно исследовать растворами антител . Антитела, которые специфически связываются с интересующим белком, затем можно визуализировать с помощью различных методов, включая цветные продукты, хемилюминесценцию или авторадиографию . Часто антитела метят ферментами. Когда хемилюминесцентный субстрат подвергается воздействию фермента, это позволяет его обнаружить. Использование методов вестерн-блоттинга позволяет не только обнаруживать, но и проводить количественный анализ. Методы, аналогичные вестерн-блоттингу, можно использовать для прямого окрашивания специфических белков в живых клетках или срезах тканей . [46] [48]
Техника истерн-блоттинга используется для обнаружения посттрансляционной модификации белков. Белки, нанесенные на мембрану из ПВДФ или нитроцеллюлозы, исследуются на наличие модификаций с использованием определенных субстратов. [49]
Микрочип ДНК представляет собой набор пятен, прикрепленных к твердой основе, такой как предметное стекло микроскопа , где каждое пятно содержит один или несколько фрагментов одноцепочечных олигонуклеотидов ДНК. Массивы позволяют наносить большое количество очень маленьких (диаметром 100 микрометров) пятен на одно предметное стекло. Каждое пятно содержит молекулу фрагмента ДНК, комплементарную одной последовательности ДНК . Вариант этого метода позволяет оценить экспрессию генов организма на определенной стадии развития ( профилирование экспрессии ). В этом методе РНК в ткани выделяется и преобразуется в меченую комплементарную ДНК (кДНК). Затем эта кДНК гибридизуется с фрагментами матрицы, и можно провести визуализацию гибридизации. Поскольку можно создать несколько массивов с одинаковым положением фрагментов, они особенно полезны для сравнения экспрессии генов в двух разных тканях, таких как здоровая и раковая ткань. Кроме того, можно измерить, какие гены экспрессируются и как эта экспрессия меняется со временем или под воздействием других факторов. Существует много разных способов изготовления микрочипов; наиболее распространенными являются кремниевые чипы, предметные стекла с пятнами диаметром около 100 микрометров, индивидуальные матрицы и матрицы с более крупными пятнами на пористых мембранах (макрочипы). В одном массиве может быть от 100 до более 10 000 мест. Массивы также можно создавать с использованием других молекул, помимо ДНК. [50] [51] [52] [53]
Аллель-специфический олигонуклеотид (АСО) — это метод, который позволяет обнаруживать мутации одного основания без необходимости ПЦР или гель-электрофореза. Короткие (20–25 нуклеотидов в длину) меченые зонды подвергаются воздействию нефрагментированной целевой ДНК, гибридизация происходит с высокой специфичностью из-за короткой длины зондов, и даже изменение одного основания будет препятствовать гибридизации. Затем целевую ДНК промывают и удаляют меченые зонды, которые не гибридизовались. Затем целевую ДНК анализируют на наличие зонда с помощью радиоактивности или флуоресценции. В этом эксперименте, как и в большинстве методов молекулярной биологии, необходимо использовать контроль, чтобы обеспечить успешное экспериментирование. [54] [55]
В молекулярной биологии процедуры и технологии постоянно развиваются, а старые технологии отказываются от них. Например, до появления гель-электрофореза ДНК ( агарозы или полиакриламида ) размер молекул ДНК обычно определялся по скорости седиментации в градиентах сахарозы - медленный и трудоемкий метод, требующий дорогостоящего оборудования; до градиентов сахарозы использовали вискозиметрию . Помимо исторического интереса, часто стоит знать и о старых технологиях, поскольку иногда бывает полезно решить другую новую проблему, для которой новая техника непригодна. [56]
СМИ, связанные с молекулярной биологией, на Викискладе?