EGF -подобный домен является эволюционно консервативным белковым доменом , который получил свое название от эпидермального фактора роста , где он был впервые описан. Он состоит из около 30-40 аминокислотных остатков и был обнаружен во многих белках, в основном животных. [2] [3] Большинство случаев EGF-подобного домена обнаружено во внеклеточном домене мембраносвязанных белков или в белках, которые, как известно, секретируются . Исключением является простагландин-эндопероксидсинтаза . EGF-подобный домен включает 6 остатков цистеина , которые в эпидермальном факторе роста, как было показано, образуют 3 дисульфидные связи . Структуры 4-дисульфидных EGF-доменов были решены из белков ламинина и интегрина . Основная структура EGF-подобных доменов представляет собой двухцепочечный β-слой , за которым следует петля к короткому C-концевому двухцепочечному β-слою. Эти два β-слоя обычно обозначаются как основной (N-концевой) и второстепенный (C-концевой) слои. [4] EGF-подобные домены часто встречаются в многочисленных тандемных копиях в белках: эти повторы обычно складываются вместе, образуя один линейный соленоидный доменный блок в качестве функциональной единицы.
Несмотря на сходство доменов, подобных EGF, были идентифицированы различные подтипы доменов. [5] Два основных предложенных типа доменов, подобных EGF, — это домен, подобный человеческому EGF (hEGF), и домен, подобный комплементу C1r (cEGF), [4] , который был впервые идентифицирован в протеазе комплемента человека C1r. [5] C1r — это высокоспецифичная сериновая протеаза, инициирующая классический путь активации комплемента во время иммунного ответа. [6] Оба домена, подобные hEGF и cEGF, содержат три дисульфида и происходят от общего предка, который нес четыре дисульфида, один из которых был утрачен в ходе эволюции. Кроме того, домены, подобные cEGF, можно разделить на два подтипа (1 и 2), тогда как все домены, подобные hEGF, принадлежат к одному подтипу. [4]
Дифференциация доменов cEGF-like и hEGF-like и их подтипов основана на структурных особенностях и связности их дисульфидных связей. Домены cEGF- и hEGF-like имеют различную форму и ориентацию минорного слоя, а один C-концевой полуцистин имеет различное положение. Утраченные цистеины общего предка различаются между доменами cEGF- и hEGF-like, и, следовательно, эти типы различаются по своим дисульфидным связям. Дифференциация cEGF на подтипы 1 и 2, которая, вероятно, произошла после его отделения от hEGF, основана на различном количестве остатков между различными полуцистинами. Расположенный на N-конце мотив связывания кальция можно обнаружить как в доменах hEGF-, так и в доменах cEGF-like, и поэтому он не подходит для их различения. [4]
hEGF- и cEGF-подобные домены также содержат посттрансляционные модификации , которые часто необычны и различаются между hEGF- и cEGF-подобными доменами. Эти посттрансляционные модификации включают O-гликозилирование, в основном модификации O-фукозы, и β-гидроксилирование остатков аспартата и аспарагина. Модификации O-фукозы были обнаружены только в hEGF-подобных доменах, и они важны для правильного сворачивания hEGF-подобного домена. β-Гидроксилирование появляется в hEGF- и cEGF-подобных доменах, первый гидроксилирован на аспарагиновой кислоте, а последний гидроксилирован на остатке аспарагина. Биологическая роль этой посттрансляционной модификации неясна, [4] но у мышей с нокаутом фермента аспартил-β-гидроксилирования наблюдаются дефекты развития. [7]
Белки, содержащие EGF-подобные домены, широко распространены и могут быть исключительно hEGF- или cEGF-подобными, или содержать смесь обоих. Во многих митогенных и развивающихся белках, таких как Notch и Delta, EGF-подобные домены относятся только к типу hEGF. Другие белки содержат только cEGF, такие как тромбомодулин и рецептор ЛПНП . В смешанных EGF-белках hEGF- и cEGF-подобные домены сгруппированы вместе, причем hEGF всегда являются N-концевыми по отношению к cEGF. Такие белки участвуют в свертывании крови или являются компонентами внеклеточного матрикса, такими как фибриллин и LTBP-1 (белок 1, связывающий латентный трансформирующий фактор роста бета). В дополнение к вышеупомянутым трем дисульфидным типам hEGF- и cEGF-подобных, существуют белки, несущие четырехдисульфидный EGF-подобный домен, такие как ламинин и интегрин. [4]
Два основных подтипа EGF-подобных доменов hEGF и cEGF не только отличаются по своей структуре и конформации, но и имеют разные функции. Эта гипотеза подтверждается исследованиями LTBP-1. LTBP-1 прикрепляет трансформирующий фактор роста β (TGF-β) к внеклеточному матриксу. hEGF-подобные домены играют роль в нацеливании сборки LTBP-1/TGF-β на внеклеточный матрикс. После прикрепления к внеклеточному матриксу TGF-β диссоциирует от субъединиц hEGF, что позволяет осуществить его последующую активацию. cEGF-подобные домены, по-видимому, играют неспецифическую роль в этой активации, способствуя расщеплению LTBP-1 от TGF-β различными протеазами. [4]
В заключение следует отметить, что хотя отдельные EGF-подобные домены сгруппированы, подтипы можно четко разделить по их последовательности, конформации и, что наиболее важно, по их функции.
Селектины , группа белков, которые участвуют в движении лейкоцитов к источнику воспаления, содержат домен, подобный EGF, а также домен лектина и короткие консенсусные повторы (SCR). [8] [9] Функции домена, подобного EGF, различаются в зависимости от типа селектина. Канзас и его коллеги смогли показать, что домен, подобный EGF, не требуется для максимальной клеточной адгезии в L-селектине (экспрессируется на лимфоцитах). Однако он участвует как в распознавании лиганда, так и в адгезии в P-селектине (экспрессируется на тромбоцитах), а также может участвовать в белок-белковых взаимодействиях. Было высказано предположение, что взаимодействия между доменами лектина и углеводными лигандами могут зависеть от кальция. [8]
Незрелые человеческие дендритные клетки , по-видимому, требуют взаимодействия с EGF-подобными доменами селектинов во время процесса их созревания. Блокирование этого взаимодействия моноклональными антителами к домену EGF-подобного домена предотвращает созревание дендритных клеток. Незрелые клетки не активируют Т-клетки и производят меньше интерлейкина 12, чем дендритные клетки дикого типа. [10]
Фан и др. смогли показать, что искусственное введение участка N-гликозилирования в EGF-подобные домены в P- и L-селектинах увеличило сродство селектинов к их лигандам и привело к более медленному качению. [9] Таким образом, EGF-подобные домены, по-видимому, играют решающую роль в движении лейкоцитов к воспалительным стимулам.
EGF-подобный домен также является частью ламининов, важной группы внеклеточных белков. EGF-подобные домены обычно замаскированы в неповрежденных мембранах, но становятся открытыми, когда мембрана разрушается, например, во время воспаления, тем самым стимулируя рост мембраны и восстанавливая поврежденные части мембраны. [11]
Более того, было показано, что повторы домена стабилина-2, подобные EGF, специфически распознают и связывают апоптотические клетки, вероятно, путем распознавания фосфатидилсерина , маркера апоптотических клеток («сигнал «съешь меня»). [12] Парк и др. далее продемонстрировали, что домены способны конкурентно нарушать распознавание апоптотических клеток макрофагами.
В заключение следует отметить, что домен, подобный EGF, по-видимому, играет важную роль в иммунных реакциях, а также в устранении мертвых клеток в организме.
Связывающие кальций EGF-подобные домены (cbEGF-подобные домены) играют основополагающую роль в таких заболеваниях, как синдром Марфана [13] или геморрагическое расстройство, связанное с Х-хромосомой, гемофилия B [14] и являются одними из самых распространенных внеклеточных кальций-связывающих доменов. [15] Важно, что cbEGF-подобные домены придают специфические функции различным белкам в каскаде свертывания крови. Примерами являются факторы свертывания крови VII , IX и X , белок C и его кофактор белок S. [15]
Связывающие кальций домены, подобные EGF, обычно состоят из 45 аминокислот, расположенных в виде двух антипараллельных бета-слоев. [15] Несколько остатков цистеина в этой последовательности образуют дисульфидные мостики.
cbEGF-подобные домены не показывают существенных структурных отклонений от EGF-подобных доменов; однако, как следует из названия, cbEGF-подобные домены связывают один ион кальция . Сродство к связыванию с кальцием сильно варьируется и часто зависит от соседних доменов. [15] Консенсусный мотив для связывания кальция - Asp-Leu/Ile-Asp-Gln-Cys. Координация кальция сильно коррелирует с необычной посттрансляционной модификацией cbEGF-подобных доменов: либо аспарагин, либо аспартат подвергаются бета-гидроксилированию, что приводит к образованию эритро-бета-гидроксиаспарагина (Hyn) или эритро-бета-гидроксиаспарагиновой кислоты (Hya) соответственно. Hya можно обнаружить в N-концевом модуле cbEGF (см. ниже) факторов IX, X и белка C. Модификация Hyn, по-видимому, более распространена, чем Hya, и, как было показано, встречается в фибриллине-1, белке внеклеточного матрикса. [16] Обе модификации катализируются диоксигеназой Asp/Asn-бета-гидроксилазой [17] и являются уникальными для доменов EGF у эукариот. [15]
Сообщалось о дальнейших посттрансляционных модификациях. Гликозилирование в форме O-связанных ди- или трисахаридов может происходить в остатке серина между первыми двумя цистеинами факторов свертывания крови VII и IX. [18] [19] [20] Фактор VII демонстрирует O-связанную фукозу в Ser60. [20]
Несколько доменов cbEGF часто соединены одной или двумя аминокислотами, образуя более крупные повторяющиеся массивы, здесь называемые «модулями cbEGF». В каскаде свертывания крови факторы свертывания VII, IX и X и белок C содержат тандем из двух модулей cbEGF, тогда как белок S имеет четыре. Впечатляет, что в фибриллине-1 и фибриллине-2 было обнаружено 43 модуля cbEGF. [21] Модульность этих белков добавляет сложности к взаимодействию белок-белок, а также модуль-модуль. В факторах VII, IX и X двум модулям cbEGF предшествует модуль, содержащий N-концевую гамма-карбоксиглутаминовую кислоту (Gla) ( модуль Gla ). [15] Исследования in vitro тандема Gla-cbEGF, выделенного из фактора X, показали значение K d 0,1 мМ для связывания кальция [18] при концентрации свободного кальция в плазме крови приблизительно 1,2 мМ. Удивительно, но при отсутствии модуля Gla модуль cbEGF демонстрирует значение K d 2,2 мМ для кальция. [17] Таким образом, присутствие модуля Gla увеличивает сродство к кальцию в 20 раз. Аналогичным образом активность модулей Gla и сериновой протеазы модифицируется модулями cbEGF. При отсутствии кальция модули Gla и cbEGF очень подвижны. Однако, поскольку модуль cbEGF ассоциируется с кальцием, движение модуля Gla значительно ограничено, поскольку модуль cbEGF теперь принимает конформацию, которая фиксирует соседний модуль Gla в фиксированном положении. [22] [23] Таким образом, координация кальция вызывает конформационные изменения, которые, в свою очередь, могут модулировать ферментативную активность.
Нарушение координации кальция может привести к серьезным расстройствам. Дефектное связывание кальция с фактором свертывания крови IX способствует развитию гемофилии B. У людей с этим наследственным заболеванием, как правило, развиваются кровоизлияния, что потенциально приводит к опасным для жизни состояниям. Причиной гемофилии B является снижение активности или дефицит фактора свертывания крови IX. Считается, что точечные мутации, приводящие к снижению сродства фактора IX к кальцию, связаны с этим нарушением свертываемости крови. [15] На молекулярном уровне представляется, что гемофилия B может быть результатом нарушения способности эффективно локализовать модуль Gla, как это обычно происходит после координации кальция модулем cbEGF в полностью функциональном факторе IX. [15] Считается, что этот дефект нарушает биологическую функцию фактора IX. Похожая проблема возникает у пациентов с гемофилией B и имеющих мутацию (Glu78Lys) в факторе IX, которая препятствует взаимодействию двух модулей cbEGF друг с другом. [15] Наоборот, у здоровых людей Glu78 в первом модуле cbEGF контактирует с Arg94 во втором модуле cbEGF и тем самым выравнивает оба модуля. [24] Таким образом, взаимодействия доменов (частично облегчаемые координацией кальция) имеют решающее значение для каталитической активности белков, участвующих в каскаде свертывания крови.
Ниже приведен список человеческих белков, содержащих домен, подобный EGF: