_(19762396143).jpg/1280px-Biology_and_man_(1944)_(19762396143).jpg)
Кристаллизация вирусов — это перегруппировка вирусных компонентов в твердые кристаллические частицы. [1] Кристаллы состоят из тысяч неактивных форм определенного вируса, расположенных в форме призмы . [ 2] Неактивная природа вирусных кристаллов дает иммунологам преимущества для эффективного анализа структуры и функций вирусов. Понимание таких характеристик было улучшено благодаря усовершенствованию и разнообразию технологий кристаллизации. Вирусные кристаллы имеют глубокую историю широкого применения в эпидемиологии и вирусологии и по сей день остаются катализатором для изучения вирусных моделей с целью смягчения потенциальных вспышек заболеваний .
Кристаллы вирусов берут свое начало в конце 19 века, когда первые открытия кристаллизации белков были сделаны немецкими биологами Риттхаузеном и Осборном , в основном для гемоглобина у червей и рыб . [3] Эти ранние наблюдения в первую очередь рассматривались как лабораторные курьезы. То, что начиналось как простые курьезы, превратилось в необходимость очистки и выделения белков для более четкой визуализации, что привело к кристаллизации белков . Методы кристаллизации белков в конечном итоге были введены в вирусологию после появления вирусов табачной мозаики (ВТМ) , которые были первыми из когда-либо обнаруженных вирусов. [4]
Достижение четкой визуализации вирусов с использованием ограниченной технологии, такой как микроскопия, было затруднено из-за их относительно миниатюрных размеров, при этом наименьший из вирусов имел диаметр около 20 нм. [5] Поэтому микроскопия была относительно сложной областью, с альтернативными методами наблюдения, пользовавшимися большим спросом. Вирусы TMV были впервые кристаллизованы Уэнделлом Стэнли , который продемонстрировал, что вирусы TMV сохраняли свою инфекционность даже в кристаллической форме. [3] Именно в это время исследователи обнаружили, что кристаллизованные вирусы (подобно белкам и другим органическим молекулам) могут дифрагировать рентгеновские лучи, что подразумевает сложный структурный механизм в вирусных телах. Этот прорыв послужил основой для расширения вирусологии в рентгеновскую кристаллографию . [3]
Рентгеновская кристаллография была разработана в середине 20-го века усилиями ученых по изучению характеристик кристаллизованных вирусов в лабораторных исследованиях. Среди них была Дороти Ходжкин , эксперт в области молекулярной микробиологии, которая определила структуру ВТМ с помощью вирусных кристаллов, которые могли преломлять рентгеновские лучи. [7] Это открытие послужило основой для непрерывного совершенствования методов вирусной кристаллографии, что впоследствии привело к определению множества других вирусных структур , включая полиовирус , риновирус и ретровирус человека (ВИЧ) . Такие достижения дали ценную информацию о механизмах вирусной инфекции и репликации , тем самым способствуя разработке противовирусных препаратов и вакцин в конце 20-го века.
К концу 20-го века ученые поняли, что вирусы, окруженные толстыми липидными мембранами, не способны образовывать упорядоченные кристаллы. [3] Такие вирусы затрудняли правильное получение результатов рентгеновской дифракции . [3] В ответ на это появилась криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) как новый альтернативный метод изучения вирусных структур . Крио-ЭМ позволяет ученым визуализировать вирусы с разрешением, близким к атомарному, без кристаллизации . [3] Сочетание рентгеновской кристаллографии и крио-ЭМ внесло вклад в область морфологии вирусов и поведения в иммунной системе . Такие достижения в области технологий не только пролили свет на вирусные характеристики, но и произвели революцию в вирусологии в целом и продолжают оставаться предметом пристального внимания по сей день.
Вирусы определяются как «облигатные внутриклеточные паразиты», которые содержат ДНК или РНК в ядре вирусного генома и заключены в защитную белковую оболочку. [8] Как правило, ядро заключено в капсидные белки в однослойной или двухслойной структуре. [8] Некоторые вирусы, такие как некоторые коронавирусы , также образуют большую липидную мембрану, известную как оболочка , когда обнаруживаются у определенных хозяев. [9] Эта мембрана состоит из липидного бислоя, окружающего слой мембраносвязанных белков, с поверхностными гликопротеинами или шиповидными белками, выступающими из внеклеточного аспекта. Такая вирусная оболочка обычно приобретается при перемещении через плазму или внутриклеточные матрицы организма-хозяина и может различаться по составу в зависимости от содержания липидов мембраны клетки-хозяина и белков клетки-хозяина. [8] Структура, которая должна быть отмечена для кристаллизации и идентификации, — это структура капсидного белка . Вирусы имеют в основном икосаэдрическую структуру, а вторая по распространенности организация — спиральная , пружиноподобная структура. [10] Структуры вирусного капсида организованы таким образом, чтобы максимально повысить эффективность переноса определенной длины цепи РНК или ДНК. [11] Кинетика белков капсида также может играть роль в его организации, хотя это еще не полностью выяснено. [12] Симметрия и геометрия вирусов облегчается кристаллизацией вирусов (и, в частности, субъединиц их белков капсида) с целью изучения белок -белковых взаимодействий ; прокси для свойств и функций капсидов. [1]
Спиральная структура капсида в значительной степени зависит от длины вирусного генома РНК или ДНК . [11] Из-за природы упаковки идентичных асимметричных белков без вращательной симметрии для минимизации нарушения белок-белковых связей в специфических связывающих и рецепторных участках, структуры капсидного белка, состоящие из повторения идентичных белковых субъединиц, обязательно выстраиваются в решетку, которая сворачивается, чтобы заключить свое содержимое в спиральную структуру, очень похожую на естественную спиральную структуру, наблюдаемую в ДНК . [11] Эта результирующая спиральная структура возникает из-за геометрических ограничений и симметричной природы, необходимых для массива белковых субсборок и его белок-белковых взаимодействий. [11] Было обнаружено, что вирус табачной мозаики , изученный Каспаром и Клугом в их исследовании кристаллизации 1962 года, состоит из «агрегата из 2–5 капсидных белковых субъединиц», организованных в спиральную структуру капсида. [11]
Структура икосаэдрического капсида в значительной степени зависит от энергетической эффективности и геометрических ограничений упаковки генома. [11] Подобно ограничениям, которые придают симметричную природу спиральной капсидной структуре, определенные геометрические ограничения естественным образом и обязательно применяются к возможным конформациям оболочки. Структура икосаэдрического капсида является наиболее распространенной компоновкой из-за симметрии 2-3-5 ее одноименной формы, что позволяет использовать до наибольшего числа (60 единиц) треугольных «идентичных симметричных единиц» для построения «сферической» оболочки, чтобы заключить в себя некоторый заданный материал в любом заданном размере. [12] С точки зрения оптимизации соотношения количества требуемых белковых субсборок и площади заключенной поверхности, икосаэдрическая симметрия снова оказывается наименьшей и наиболее эффективной симметрией для принятия. [11] Икосаэдрическая структура капсида является оптимальной конструкцией для материала оболочки благодаря ее геометрическим и симметричным свойствам, что обеспечивает ее эффективную конструкцию, которая естественным образом и обязательно принимается большинством вирусных линий. [11] Симметричная и высокоупорядоченная природа большинства вирусных кристаллов может быть отнесена к присущей симметрии икосаэдрической структуры капсида и ее белок-белковым взаимодействиям. [1]
Вирусы обычно вторгаются в клетки-хозяева и захватывают их в качестве метода репликации. [13] После заражения клеточные процессы клетки-хозяина нарушаются , поскольку вирусно-кодируемые белки производятся в результате репликации и размножения вируса. [13] Этот процесс состоит из белок-белковых взаимодействий первичной и третичной структуры капсида и является предметом пристального внимания для лучшего понимания молекулярных и биохимических механизмов поведения вируса. [1]
Целью кристаллизации является выращивание кристаллов вируса подходящего размера и высокого качества для их правильного считывания в процессе визуализации. [1] Искусственная кристаллизация в лаборатории обычно выполняется в четыре основных этапа:
1. Размножение
Вирусы определенных видов помещаются в инкубаторы со здоровыми клетками, что имитирует идеальные условия для их правильного функционирования. [3] При наличии здоровых клеток вирусы прикрепляются и подвергаются репликации, образуя большие образцы. [13]
2. Экстракция и очистка (выделение)
Реплицированные вирусные частицы извлекаются, после чего следует очистка для удаления нежелательных веществ, таких как мусор. [3] Этот процесс изолирует вирусные частицы и оставляет их в растворах с высокой концентрацией. [3] Затем они подвергаются центрифугированию , которое отделяет жидкий супернатант от твердого вирусного осадка . [3] Этот процесс повторяется до тех пор, пока осадок не уплотнится и не превратится в вирусный осадок. [3]
3. Зародышеобразование
Концентрированные вирусные гранулы обрабатываются реагентами, которые позволяют им образовывать небольшие кристаллические ядра. Такие стадии называются зародышеобразованием , критическим процессом на ранних стадиях кристаллизации, где небольшие кластеры белков оболочки объединяются для формирования строительных блоков внешней структуры капсида. [15] Некоторые белки оболочки заряжены и производят электростатическое отталкивание , которое необходимо преодолеть с помощью гидрофобных взаимодействий для кристаллизации капсида. [15] Гидрофобные взаимодействия относятся к тенденции неполярных областей молекул, которые прочно связываются друг с другом в водной среде, но минимизируют контакт с водой. [16]
4. Рост кристаллов
Кристаллы вируса обычно выращивают in vitro после того, как сформированы начальные ядра кристалла. [17] На рост кристаллов вируса могут влиять различные факторы, такие как температура , pH и наличие определенных добавок или осадителей в растворе. [3] В случае успеха вирусные частицы выстраиваются и связываются друг с другом в регулярную структуру, образуя повторяющиеся трехмерные решетки . [3] Процесс роста может занять от нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от вируса и условий кристаллизации.
Кристаллические структуры вирусных кристаллов подвергаются визуализации для получения визуальных результатов. Они разработаны для получения информации о микроскопических расположениях в иммобилизованных вирусных частицах. Визуализация со временем улучшилась, поскольку достижения в области рентгеновских источников, детекторов и компьютерных программ визуализации повысили осуществимость таких процедур, как рентгеновская кристаллография и криогенная электронная микроскопия . [18]
Рентгеновская кристаллография использует способность вирусных кристаллов дифрагировать электромагнитные волны при воздействии. [21] Дифракция в данном случае относится к интерференции рассеянных волн, испускаемых в разных направлениях через решетку. [21] Дифракционные картины зависят от внутреннего порядка внутри кристалла. [3] Высокий внутренний порядок с плотным расположением создает более обширные дифракционные картины с более высоким разрешением, что позволяет более точно определять атомные позиции. [3] Рентгеновский дифрактометр используется для измерения способности кристалла дифрагировать волны при воздействии источника рентгеновского излучения. [21]
Рентгеновская кристаллография не гарантирует точной работы для всех вирусных кристаллов. Например, вирусные кристаллы макромолекулярного размера имеют существенные ограничения по сравнению с более мелкими кристаллами. [3] Они мягче и более восприимчивы к повреждениям, и могут легко распадаться под действием высокой радиации. [3] Это происходит из-за значительного количества жидкости между молекулами, в среднем примерно 50% растворителя . [3] Растворитель состоит из воды и других небольших молекул, которые свободно диффундируют через междоузлия кристалла. [3] Такое нежелательное присутствие каналов, заполненных растворителем, внутри макромолекулярных кристаллов затрудняет считывание рентгеновских дифракционных картин. [3]
Криогенная электронная микроскопия (Cryo-EM) использует кинетику пучка электронов для обнаружения и получения изображения образца. [22] Крио-EM обеспечивает общую улучшенную производительность по сравнению с традиционным световым микроскопом благодаря более высокому разрешению и увеличению. [22]
В крио-ЭМ кристаллизация не является обязательной и позволяет напрямую наблюдать биологические образцы, такие как инфицированные клетки-хозяева и активные вирусы. [17] Это обеспечивает значительные преимущества по сравнению с рентгеновской кристаллографией при исследовании сложных вирусных структур, которые создают проблемы во время кристаллизации. Это особенно полезно при наблюдении за конформационными изменениями вируса, чего трудно достичь с помощью кристаллизации. [17]
Однако, несмотря на то, что крио-ЭМ может обеспечить более высокое разрешение по сравнению со световыми микроскопами , этого недостаточно, чтобы превзойти разрешение рентгеновской кристаллографии. [17] Рентгеновская кристаллография по-прежнему остается наиболее подходящим подходом при учете структур атомного уровня и микромолекулярных взаимодействий. [17] Поэтому исследователи объединяют крио-ЭМ и рентгеновскую кристаллизацию как методы преодоления ограничений друг друга.
Недавние достижения в криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) расширили пределы, в которых исследователи могут раскрыть морфологию вируса. Крио-ЭМ начала использовать прямые электронные детекторы (DED), которые включают прямое преобразование выброшенных электронов в электрические сигналы, тем самым повышая скорость и осуществимость процедуры визуализации. [23] Ограничения при изучении больших молекулярных комплексов были преодолены с введением криоэлектронной томографии (крио-ЭТ) . Это альтернатива крио-ЭМ, которая позволяет визуализировать окружающую среду и взаимодействие за пределами клетки-хозяина, в которой обитает вирус. [23] Такие достижения продвинули понимание активности вируса в среде его клетки-хозяина, а не только сосредоточение внимания на самом вирусе. [23]
Достижения в рентгеновской кристаллографии под названием макромолекулярной кристаллографии (МКР) также были вовлечены в фазу обновления технологии изображения. [18] МКР считается новой научной дисциплиной, которая адаптирует передовые инструменты и автоматизированные процедуры. Это осуществляется с помощью синхротронных источников, быстрых детекторов и инновационных методов доставки образцов для изучения динамических характеристик макромолекул. [18] Такая техника, которая наблюдает динамику вируса, а не его статический состав, называется кристаллографией с временным разрешением . [18]
Кристаллография с временным разрешением облегчается с помощью рентгеновских лазеров на свободных электронах (XFEL) , которые представляют собой новое поколение источников света, пришедших на смену традиционному понятию синхротронного излучения , поскольку они позволяют лучше контролировать мощность света и диапазон. [18] [24] Несмотря на быстрое развитие крио-ЭМ, не требующей кристаллизации, MX и XFEL позволяют кристаллизации вирусов оставаться актуальной и продолжать играть важную роль в предоставлении деталей вирусов на атомном уровне. [18]
Являются ли вирусы «живыми» или нет, является предметом ожесточенных споров во всем мире. Хотя вирусы демонстрируют некоторые формы поведения, которые можно охарактеризовать как «живые», такие как их способность к репликации и эволюции, у них отсутствуют некоторые существенные черты, обычно связанные с жизнью, такие как клеточная структура и независимый метаболизм. [25] Преодоление ограничений кристаллизации вирусов может предоставить важные сведения о неизвестных молекулярных взаимодействиях, которые определяют их поведение, подобное поведению жизни, тем самым позволяя сравнивать их характеристики с характеристиками, принадлежащими биологическому царству .
С учетом значительных усовершенствований, достигнутых в рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии , исследователи снова переключают свое внимание на процесс выращивания кристаллов , поскольку они остаются важными проблемами, накладывая ограничения на изменчивость размера кристаллов. Требуется больше внимания на преодоление ограничений макромолекулярных кристаллов, поскольку спрос на них растет среди исследователей. [26] Многие вирусные кристаллы попадают в эту категорию, поэтому, как говорят, традиционная технология кристаллизации получит больше внимания в будущем. [26]