Окисление ДНК — это процесс окислительного повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты . Как подробно описано Берроузом и др., [1] 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dG) является наиболее распространенным окислительным повреждением, наблюдаемым в дуплексной ДНК, поскольку гуанин имеет более низкий потенциал одноэлектронного восстановления , чем другие нуклеозиды в ДНК. Одноэлектронные потенциалы восстановления нуклеозидов (в вольтах по отношению к NHE ) составляют гуанин 1,29, аденин 1,42, цитозин 1,6 и тимин 1,7. Примерно 1 из 40 000 гуанинов в геноме присутствует в виде 8-оксо-dG в нормальных условиях. Это означает, что в любой момент времени в геноме человеческой клетки может существовать >30 000 8-oxo-dG. Другим продуктом окисления ДНК является 8-оксо-дА. 8-оксо-dA встречается примерно с 1/10 частотой 8-оксо-dG. [2] Потенциал восстановления гуанина может быть уменьшен на целых 50%, в зависимости от конкретных соседних нуклеозидов, расположенных рядом с ним в ДНК.
Избыточное окисление ДНК связано с некоторыми заболеваниями и раком, [3] в то время как нормальный уровень окисленных нуклеотидов, обусловленный нормальным уровнем АФК , может быть необходим для памяти и обучения. [4] [5]
В 2003 году Cooke et al. выявили более 20 окислительно-поврежденных повреждений оснований ДНК. [6] и они перекрывают 12 окисленных оснований, о которых сообщил в 1992 году Диздароглу. [7] Двумя наиболее часто окисляемыми основаниями, обнаруженными Диздароглу после ионизирующего излучения (вызывающего окислительный стресс), были два продукта окисления гуанина, показанные на рисунке. Одним из этих продуктов был 8-OH-Gua (8-гидроксигуанин). (Статья 8-оксо-2'-дезоксигуанозин относится к тому же поврежденному основанию, поскольку описанная там кето-форма 8-оксо-Гуа может претерпевать таутомерный сдвиг в енольную форму 8-ОН-Гуа, показанную здесь.) Другой продукт был FapyGua (2,6-диамино-4-гидрокси-5-формамидопиримидин). Другим частым продуктом окисления был 5-OH-Hyd (5-гидроксигидантоин), полученный из цитозина.
Большинство окисленных оснований удаляются из ДНК ферментами, действующими в рамках пути репарации вырезания оснований. [6] Удаление окисленных оснований в ДНК происходит довольно быстро. Например, уровень 8-oxo-dG повышался в 10 раз в печени мышей, подвергнутых ионизирующему излучению, но избыток 8-oxo-dG удалялся с периодом полураспада 11 минут. [8]
Стационарные уровни эндогенных повреждений ДНК представляют собой баланс между образованием и восстановлением. Свенберг и др. [9] измерили среднее количество стационарных эндогенных повреждений ДНК в клетках млекопитающих. Семь наиболее распространенных повреждений, обнаруженных ими, показаны в Таблице 1. Только одно прямо окисленное основание, 8-гидроксигуанин , с содержанием около 2400 8-OH-G на клетку, было одним из наиболее частых повреждений ДНК, присутствующих в устойчивом состоянии.
По данным обзора Valavanidis et al. [11] повышенный уровень 8-оксо-dG в ткани может служить биомаркером окислительного стресса. Они также отметили, что повышенные уровни 8-oxo-dG часто связаны с канцерогенезом и заболеваниями.
На рисунке, показанном в этом разделе, эпителий толстой кишки мыши, находящейся на нормальной диете, имеет низкий уровень 8-оксо-dG в криптах толстой кишки (панель А). Однако мышь, которая, вероятно, подвергается опухолевому генезу в толстой кишке (из-за добавления в ее рацион дезоксихолата [10] ), имеет высокий уровень 8-оксо-dG в эпителии толстой кишки (панель B). Дезоксихолат увеличивает внутриклеточную выработку активного кислорода, что приводит к усилению окислительного стресса [12] [13] , что может способствовать онкогенезу и канцерогенезу. Из 22 мышей, получавших диету с дезоксихолатом , у 20 (91%) через 10 месяцев на диете развились опухоли толстой кишки, а опухоли у 10 из этих мышей (45% мышей) включали аденокарциному (рак). [10] Кук и др. [6] отмечают, что ряд заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и системная красная волчанка, повышают уровень 8-оксо-dG, но не повышают канцерогенез.
Валаванидис и др. [11] отметили, что окислительное повреждение ДНК, такое как 8-oxo-dG, может способствовать канцерогенезу по двум механизмам. Первый механизм включает модуляцию экспрессии генов, тогда как второй заключается в индукции мутаций.
Эпигенетические изменения, например, путем метилирования CpG-островков в промоторной области гена, могут подавлять экспрессию гена (см. Метилирование ДНК при раке ). В целом, эпигенетические изменения могут модулировать экспрессию генов. По обзору Бернштейна и Бернштейна [14] репарация различных типов повреждений ДНК может с низкой частотой оставлять остатки различных процессов репарации и тем самым вызывать эпигенетические изменения. 8-oxo-dG в первую очередь восстанавливается путем эксцизионного восстановления основания (BER). [15] Ли и др. [16] рассмотрели исследования, показывающие, что один или несколько белков BER также участвуют в эпигенетических изменениях, включающих метилирование, деметилирование ДНК или реакции, связанные с модификацией гистонов. Нисида и др. [17] исследовали уровни 8-oxo-dG, а также оценили метилирование промотора 11 генов-супрессоров опухолей (TSG) в 128 образцах биопсии печени. Эти биопсии были взяты у пациентов с хроническим гепатитом С — заболеванием, вызывающим окислительные повреждения печени. Среди 5 оцененных факторов только повышенные уровни 8-oxo-dG высоко коррелировали с метилированием промотора TSG (p<0,0001). Это метилирование промотора могло снизить экспрессию этих генов-супрессоров опухолей и способствовать канцерогенезу .
Ясуи и др. [18] исследовали судьбу 8-оксо-dG, когда это окисленное производное дезоксигуанозина было вставлено в ген тимидинкиназы в хромосоме лимфобластоидных клеток человека в культуре. Они вставили 8-оксо-dG примерно в 800 клеток и смогли обнаружить продукты, которые возникли после вставки этого измененного основания, как это было определено на основе клонов, полученных после роста клеток. 8-oxo-dG был восстановлен до G в 86% клонов, что, вероятно, отражает точную репарацию оснований или синтез транслейкоза без мутации. Трансверсии G:C в T:A произошли в 5,9% клонов, делеции одного основания - в 2,1% и трансверсии G:C в C:G - в 1,2%. В совокупности эти более распространенные мутации составили 9,2% из 14% мутаций, возникших в месте вставки 8-oxo-dG. Среди других мутаций в 800 проанализированных клонах также были 3 более крупные делеции размером 6, 33 и 135 пар оснований. Таким образом, 8-oxo-dG, если его не репарировать, может напрямую вызывать частые мутации, некоторые из которых могут способствовать канцерогенезу .
Согласно обзору Wang et al., [19] окисленный гуанин, по-видимому, выполняет множество регуляторных ролей в экспрессии генов. Как отмечают Wang et al., [19] гены, склонные к активной транскрипции, плотно распределены в участках генома с высоким содержанием GC. Затем они описали три способа регуляции генов путем окисления ДНК гуанина. В одном случае оказывается, что окислительный стресс может производить 8-оксо-dG в промоторе гена. Окислительный стресс также может инактивировать OGG1. Неактивный OGG1, который больше не вырезает 8-oxo-dG, тем не менее нацеливается на 8-oxo-dG и образует с ним комплексы, вызывая резкий (~70 ° ) изгиб ДНК. Это позволяет собрать комплекс инициации транскрипции, усиливающий транскрипцию соответствующего гена. Экспериментальная база, устанавливающая этот режим, была также рассмотрена Зайферманом и Эпе [20]
Второй способ регуляции генов путем окисления ДНК гуанина [19] [21] возникает, когда 8-оксо-dG образуется в богатой гуанином потенциально образующей G-квадруплекс последовательности (PQS) в кодирующей цепи промотор, после чего активный OGG1 вырезает 8-оксо-dG и генерирует апуриновый/апиримидиновый сайт (AP-сайт). Сайт AP позволяет плавить дуплекс, чтобы демаскировать PQS, принимая складку G-квадруплекса (структура/мотив G4), которая играет регуляторную роль в активации транскрипции.
Третий способ регуляции генов путем окисления ДНК гуанина [19] возникает, когда 8-oxo-dG образует комплекс с OGG1 и затем привлекает ремоделеры хроматина для модуляции экспрессии генов. ДНК-связывающий белок 4 хромодомен-хеликазы (CHD4) , компонент комплекса (NuRD) , рекрутируется OGG1 в участки окислительного повреждения ДНК. CHD4 затем привлекает ферменты метилирования ДНК и гистонов, которые подавляют транскрипцию связанных генов.
Зайферманн и Эпе [20] отметили, что высокоселективную индукцию 8-оксо-dG в промоторных последовательностях, наблюдаемую при индукции транскрипции, может быть трудно объяснить следствием общего окислительного стресса. Однако, по-видимому, существует механизм направленной генерации окисленных оснований в областях промотора. Перилло и др., [22] [23] показали, что лизин-специфичная гистон-деметилаза LSD1 генерирует локальный всплеск активных форм кислорода (АФК), который индуцирует окисление близлежащих нуклеотидов при выполнении своей функции. Конкретный пример: после обработки клеток эстрогеном LSD1 продуцировал H 2 O 2 как побочный продукт своей ферментативной активности. Было показано, что окисление ДНК с помощью LSD1 в ходе деметилирования гистона H3 по лизину 9 необходимо для рекрутирования OGG1, а также топоизомеразы IIβ в промоторную область bcl-2 , эстроген-зависимого гена, и последующей транскрипции. инициация.
8-оксо-dG встречается в геноме не случайно. В эмбриональных фибробластах мыши 2–5-кратное обогащение 8-оксо-dG было обнаружено в областях генетического контроля, включая промоторы , 5'-нетранслируемые области и 3'-нетранслируемые области, по сравнению с уровнями 8-оксо-dG, обнаруженными в гене . телах и в межгенных регионах . [24] В эндотелиальных клетках легочной артерии крысы, когда 22 414 генов, кодирующих белок, были исследованы на предмет местоположения 8-oxo-dG, большинство 8-oxo-dG (если они присутствовали) были обнаружены в областях промотора, а не внутри тел генов. [25] Среди сотен генов, на уровень экспрессии которых влияла гипоксия, те с недавно приобретенным промотором 8-oxo-dGs были активированы , а те гены, чьи промоторы потеряли 8-oxo-dGs, почти все были подавлены . [25]
Окисление гуанина, особенно в сайтах CpG , может быть особенно важным для обучения и памяти. Метилирование цитозинов происходит в 60–90% CpG-сайтов в зависимости от типа ткани. [26] В мозгу млекопитающих ~62% CpG метилированы. [26] Метилирование сайтов CpG имеет тенденцию к стабильному молчанию генов. [27] Более 500 из этих CpG-сайтов деметилируются в ДНК нейронов во время формирования и консолидации памяти в гиппокампе [28] [29] и поясной коре [29] головного мозга. Как указано ниже, первым шагом деметилирования метилированного цитозина в сайте CpG является окисление гуанина с образованием 8-оксо-dG.
На первом рисунке в этом разделе показан сайт CpG, где цитозин метилируется с образованием 5-метилцитозина (5mC), а гуанин окисляется с образованием 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (на рисунке это показано в таутомерной форме 8). -OHdG). Когда эта структура формируется, основной фермент эксцизионной репарации OGG1 нацеливается на 8-OHdG и связывается с поражением без немедленного иссечения. OGG1, присутствующий в сайте 5mCp-8-OHdG, рекрутирует TET1 , а TET1 окисляет 5mC, соседний с 8-OHdG. Это инициирует деметилирование 5mC. [30] TET1 является ключевым ферментом, участвующим в деметилировании 5mCpG. Однако TET1 способен действовать на 5mCpG только в том случае, если гуанин был сначала окислен с образованием 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG или его таутомер 8-oxo-dG), в результате чего образовался динуклеотид 5mCp-8-OHdG ( см. первый рисунок в этом разделе). [30] Это инициирует путь деметилирования метилированного цитозина, что в конечном итоге приводит к образованию неметилированного цитозина, как показано на втором рисунке в этом разделе.
Было установлено, что измененная экспрессия белка в нейронах из-за изменений в метилировании ДНК (вероятно, контролируемая 8-оксо-dG-зависимым деметилированием сайтов CpG в промоторах генов в ДНК нейронов) играет центральную роль в формировании памяти. [32]
Доказательства того, что повреждение ДНК , вызванное окислительным стрессом , играет роль в биполярном расстройстве, были рассмотрены Raza et al. [33] У пациентов с биполярным расстройством наблюдаются повышенные уровни окислительно-индуцированных повреждений оснований ДНК даже в периоды стабильного психического состояния. [34] Уровень фермента эксцизионной репарации оснований OGG1 , который удаляет определенные окисленные основания из ДНК, также снижается по сравнению со здоровыми людьми. [34]
Большое депрессивное расстройство связано с увеличением окислительного повреждения ДНК. [33] Увеличение окислительных модификаций пуринов и пиримидинов у пациентов с депрессией может быть связано с нарушением восстановления окислительных повреждений ДНК. [35]
Посмертные исследования пожилых пациентов с хронической шизофренией показали, что окислительное повреждение ДНК увеличивается в области гиппокампа мозга. [36] Средняя доля нейронов с окисленным основанием ДНК 8-oxo-dG была в 10 раз выше у больных шизофренией, чем у лиц сравнения. Доказательства, указывающие на роль окислительного повреждения ДНК при шизофрении, были рассмотрены Raza et al. [33] и Маркканен и др. [37]
РНК в нативной среде подвергаются различным воздействиям. Среди этих угроз окислительный стресс является одной из основных причин повреждения РНК. Уровень окислительного стресса, которому подвергается клетка, отражается количеством активных форм кислорода (АФК). АФК генерируются в результате нормального метаболизма кислорода в клетках и представляют собой список активных молекул, таких как O 2 •- , 1 O 2 , H 2 O 2 и •OH . [38] Нуклеиновая кислота может быть окислена АФК посредством реакции Фентона . [39] На сегодняшний день в ДНК обнаружено около 20 окислительных повреждений. [40] РНК, вероятно, более чувствительны к АФК по следующим причинам: i) в основном одноцепочечная структура предоставляет больше сайтов для АФК; ii) по сравнению с ядерной ДНК РНК менее разделены; iii) РНК широко распределяются в клетках не только в ядре, как ДНК, но и в больших количествах в цитоплазме. [41] [42] Эта теория была подтверждена серией открытий в печени крыс, лейкоцитах человека и т. д. Фактически, мониторинг системы с помощью изотопной метки [ 18 O]-H 2 O 2 показывает большее окисление клеточной РНК. чем в ДНК. Окисление случайным образом повреждает РНК, и каждая атака приводит к проблемам с нормальным клеточным метаболизмом. Хотя изменение генетической информации на мРНК происходит относительно редко, окисление мРНК in vitro и in vivo приводит к низкой эффективности трансляции и аберрантным белковым продуктам. [43] Хотя окисление поражает нуклеиновые нити случайным образом, определенные остатки более восприимчивы к АФК, причем такие «горячие точки» подвергаются воздействию АФК с высокой скоростью. Среди всех обнаруженных к настоящему времени повреждений одним из наиболее распространенных в ДНК и РНК является 8-гидроксигуанин. [44] Более того, 8-гидроксигуанин является единственным измеримым среди всех повреждений РНК. Помимо своего содержания, 8-гидроксидезоксигуанозин (8-oxodG) и 8-гидроксигуанозин (8-oxoG) идентифицированы как наиболее вредные окислительные повреждения из-за их мутагенного эффекта [45] , при котором этот неканонический аналог может ошибочно соединяться как с аденином, так и с аденином. и цитозин с одинаковой эффективностью. [46] [47]Это неправильное спаривание приводит к изменению генетической информации посредством синтеза ДНК и РНК. В РНК уровни окисления в основном оцениваются с помощью анализов на основе 8-oxoG. На данный момент подходы, разработанные для прямого измерения уровня 8-oxoG, включают анализ на основе ВЭЖХ и анализы с использованием моноклональных антител против 8-oxoG. Метод на основе ВЭЖХ измеряет 8-oxoG с помощью электрохимического детектора (ЭХД) и общий G с помощью УФ- детектора. [48] Соотношение, полученное в результате сравнения двух чисел, показывает степень окисления всего G. Моноклональные мышиные антитела против 8-oxoG широко применяются для непосредственного обнаружения этого остатка на срезах тканей или на мембранах, предлагая более наглядный способ изучения его распределения в тканях и в отдельных подмножествах ДНК или РНК. Установленные непрямые методы в основном основаны на мутагенных последствиях этого поражения, такие как анализ lacZ. [49] Этот метод был впервые разработан и описан Таддеи и стал потенциально мощным инструментом для понимания ситуации окисления как на уровне последовательности РНК, так и на уровне отдельных нуклеотидов. Другим источником окисленных РНК является неправильное включение окисленного аналога отдельных нуклеотидов. Действительно, размер пула предшественников РНК в сотни раз больше, чем у ДНК.
Были яростные споры о том, существует ли проблема контроля качества РНК. Однако, учитывая различную продолжительность периода полураспада различных видов РНК, варьирующуюся от нескольких минут до часов, деградацию дефектной РНК уже нельзя легко объяснить ее временным характером. Действительно, реакция с АФК занимает всего несколько минут, что даже короче средней продолжительности жизни самых нестабильных РНК. [41] Если добавить к этому тот факт, что стабильная РНК занимает львиную долю от общего количества РНК, удаление ошибок РНК становится сверхкритичным, и им больше нельзя пренебрегать. Эта теория подтверждается тем фактом, что уровень окисленной РНК снижается после устранения окислительного воздействия. [50] [51] Некоторые потенциальные факторы включают рибонуклеазы , которые, как предполагается, избирательно разрушают поврежденные РНК в условиях стресса. Также известно, что ферменты , работающие на уровне пула предшественников РНК, контролируют качество последовательности РНК, изменяя предшественник ошибки в форму, которая не может быть включена непосредственно в формирующуюся цепь.