Оптический микроскоп , также называемый световым микроскопом , представляет собой тип микроскопа , который обычно использует видимый свет и систему линз для создания увеличенных изображений мелких объектов. Оптические микроскопы являются старейшей конструкцией микроскопов и, возможно, были изобретены в их нынешней сложной форме в 17 веке. Базовые оптические микроскопы могут быть очень простыми, хотя многие сложные конструкции направлены на улучшение разрешения и контрастности образцов .
Объект помещается на предметный столик и его можно рассматривать непосредственно через один или два окуляра микроскопа. В мощных микроскопах оба окуляра обычно показывают одно и то же изображение, но в стереомикроскопе для создания трехмерного эффекта используются немного разные изображения. Для захвата изображения ( микрофотографии ) обычно используется камера .
Образец можно подсветить разными способами. Прозрачные объекты можно освещать снизу, а твердые объекты можно освещать светом, проходящим через ( светлое поле ) или вокруг ( темное поле ) объектива. Поляризованный свет можно использовать для определения кристаллической ориентации металлических предметов. Фазово-контрастную визуализацию можно использовать для увеличения контрастности изображения путем выделения мелких деталей с различным показателем преломления.
На турели обычно устанавливается ряд объективов с разным увеличением, что позволяет поворачивать их на место и обеспечивает возможность увеличения изображения. Максимальное увеличение оптических микроскопов обычно ограничено примерно 1000-кратным из-за ограниченной разрешающей способности видимого света. Хотя возможно большее увеличение, дополнительные детали объекта не разрешаются.
Альтернативы оптической микроскопии, в которых не используется видимый свет, включают сканирующую электронную микроскопию , просвечивающую электронную микроскопию и сканирующую зондовую микроскопию , что в результате позволяет добиться гораздо большего увеличения.
Существует два основных типа оптических микроскопов: простые микроскопы и сложные микроскопы. Простой микроскоп использует для увеличения оптическую силу одной линзы или группы линз. В составном микроскопе используется система линз (один набор увеличивает изображение, полученное другим), чтобы добиться гораздо большего увеличения объекта. Подавляющее большинство современных исследовательских микроскопов представляют собой составные микроскопы, тогда как некоторые более дешевые коммерческие цифровые микроскопы представляют собой простые однолинзовые микроскопы. Сложные микроскопы можно разделить на множество других типов микроскопов, которые различаются оптической конфигурацией, стоимостью и назначением.
Простой микроскоп использует линзу или набор линз для увеличения объекта только за счет углового увеличения, предоставляя зрителю вертикальное увеличенное виртуальное изображение . [1] [2] Использование одной выпуклой линзы или группы линз встречается в простых увеличительных устройствах, таких как увеличительное стекло , лупы и окуляры для телескопов и микроскопов.
В сложном микроскопе для сбора света используется линза, расположенная рядом с просматриваемым объектом (называемая объективом ) , которая фокусирует реальное изображение объекта внутри микроскопа (изображение 1). Затем это изображение увеличивается с помощью второй линзы или группы линз (называемых окуляром ) , что дает зрителю увеличенное перевернутое виртуальное изображение объекта (изображение 2). [3] Использование составной комбинации объектива и окуляра позволяет получить гораздо большее увеличение. Обычные составные микроскопы часто оснащены сменными объективами, что позволяет пользователю быстро регулировать увеличение. [3] Составной микроскоп также позволяет использовать более совершенные настройки освещения, такие как фазовый контраст .
Существует множество вариантов конструкции составного оптического микроскопа специализированного назначения. Некоторые из них представляют собой физические различия в конструкции, позволяющие специализироваться для определенных целей:
Остальные варианты микроскопа рассчитаны на разные способы освещения:
Цифровой микроскоп — это микроскоп, оснащенный цифровой камерой , позволяющей наблюдать образец с помощью компьютера . Микроскопы также могут частично или полностью управляться компьютером с различными уровнями автоматизации. Цифровая микроскопия позволяет лучше анализировать изображение микроскопа, например, измерять расстояния и площади, а также количественно определять флуоресцентные или гистологические пятна.
В продаже также имеются маломощные цифровые микроскопы, USB-микроскопы . По сути, это веб-камеры с мощным макрообъективом , которые обычно не используют просвет . Камера подключается непосредственно к USB- порту компьютера и отображает изображения прямо на мониторе. Они обеспечивают небольшое увеличение (приблизительно до 200×) без необходимости использования окуляров и по очень низкой цене. Мощное освещение обычно обеспечивается светодиодным источником или источниками, расположенными рядом с объективом камеры.
Цифровая микроскопия с очень низким уровнем освещенности, позволяющая избежать повреждения уязвимых биологических образцов, доступна с использованием чувствительных цифровых камер с функцией подсчета фотонов . Было продемонстрировано, что источник света, создающий пары запутанных фотонов , может минимизировать риск повреждения наиболее светочувствительных образцов. В этом применении призрачной визуализации к фотонно-разреженной микроскопии образец освещается инфракрасными фотонами, каждый из которых пространственно коррелирует с запутанным партнером в видимом диапазоне для эффективного получения изображения с помощью камеры, подсчитывающей фотоны. [7]
Самые ранние микроскопы представляли собой увеличительные стекла с одной линзой и ограниченным увеличением, которые возникли, по крайней мере, еще в эпоху широкого использования линз в очках в 13 веке. [8]
Сложные микроскопы впервые появились в Европе около 1620 года [9] [10], в том числе один, продемонстрированный Корнелисом Дреббелем в Лондоне (около 1621 года), и один, выставленный в Риме в 1624 году. [11] [12]
Фактический изобретатель сложного микроскопа неизвестен, хотя за прошедшие годы было сделано много заявлений. К ним относятся утверждения голландского мастера очков Йоханнеса Захариассена, появившиеся через 35 [13] лет после их появления, о том, что его отец, Захариас Янссен , изобрел составной микроскоп и/или телескоп еще в 1590 году. Показания Йоханнеса, которые некоторые считают сомнительными, [14] [15] [16] отодвигают дату изобретения настолько далеко назад, что Захария в то время был ребенком, что приводит к предположению, что для того, чтобы утверждение Йоханнеса было правдой, составной микроскоп должен был быть изобретен Дедушка Йоханнеса, Ганс Мартенс. [17] Другое утверждение состоит в том, что конкурент Янссена, Ганс Липперши (который подал заявку на первый патент на телескоп в 1608 году), также изобрел составной микроскоп. [18] Другие историки указывают на голландского новатора Корнелиса Дреббеля с его составным микроскопом 1621 года. [11] [12]
Галилео Галилея иногда называют изобретателем сложного микроскопа. После 1610 года он обнаружил, что может близко сфокусировать свой телескоп, чтобы рассмотреть мелкие объекты, такие как мухи, крупным планом [19] и/или может смотреть не с той стороны в обратном направлении, чтобы увеличить мелкие объекты. [20] Единственным недостатком было то, что его телескоп длиной 2 фута пришлось удлинить до 6 футов, чтобы рассмотреть объекты, находящиеся так близко. [21] Увидев составной микроскоп, построенный Дреббелем, выставленный в Риме в 1624 году, Галилей построил свою собственную улучшенную версию. [11] [12] В 1625 году Джованни Фабер придумал название « микроскоп» для составного микроскопа, который Галилей представил Академии деи Линчеи в 1624 году [22] (Галилей называл его « оккиолино » или « маленьким глазом »). Фабер придумал название от греческих слов μικρόν (микрон), означающих «маленький», и σκοπεῖν (скопеин), означающих «смотреть», имя, которое должно быть аналогом «телескопа», еще одного слова, придуманного линсианцами. [23]
Христиан Гюйгенс , еще один голландец, в конце 17 века разработал простую окулярную систему с двумя линзами, которая была ахроматически исправлена, что стало огромным шагом вперед в развитии микроскопа. Окуляр Гюйгенс производится и по сей день, но он имеет небольшой размер поля зрения и другие незначительные недостатки.
Антони ван Левенгуку (1632–1724) приписывают то, что он привлек внимание биологов к микроскопу, хотя простые увеличительные линзы производились уже в 16 веке. Самодельные микроскопы Ван Левенгука представляли собой простые микроскопы с одной очень маленькой, но прочной линзой. Они были неудобны в использовании, но позволяли ван Левенгуку видеть подробные изображения. Потребовалось около 150 лет оптических разработок, прежде чем составной микроскоп смог обеспечить изображение того же качества, что и простые микроскопы ван Левенгука, из-за трудностей с настройкой нескольких линз. В 1850-х годах Джон Леонард Ридделл , профессор химии Тулейнского университета , изобрел первый практичный бинокулярный микроскоп, проводя одно из самых ранних и обширных американских микроскопических исследований холеры . [25] [26]
Хотя базовые технологии и оптика микроскопов существуют уже более 400 лет, гораздо позже были разработаны методы освещения образцов для получения высококачественных изображений, видимых сегодня.
В августе 1893 года Август Келер разработал освещение Келера . Этот метод освещения образца обеспечивает чрезвычайно равномерное освещение и преодолевает многие ограничения старых методов освещения образца. До появления келерова освещения изображение источника света, например нити лампочки , всегда было видно на изображении образца.
Нобелевская премия по физике была присуждена голландскому физику Фрицу Цернике в 1953 году за разработку фазово-контрастного освещения, позволяющего получать изображения прозрачных образцов. Используя интерференцию , а не поглощение света, можно получить изображения чрезвычайно прозрачных образцов, таких как живые клетки млекопитающих , без необходимости использования методов окрашивания. Всего два года спустя, в 1955 году, Жорж Номарски опубликовал теорию дифференциально-интерференционно-контрастной микроскопии, еще одного метода визуализации, основанного на интерференции .
Современная биологическая микроскопия во многом зависит от разработки флуоресцентных зондов для определенных структур внутри клетки. В отличие от обычной микроскопии в просветленном свете, при флуоресцентной микроскопии образец освещается через объектив узким набором длин волн света. Этот свет взаимодействует с флуорофорами в образце, которые затем излучают свет с большей длиной волны . Именно этот излучаемый свет и составляет изображение.
С середины 20-го века химические флуоресцентные красители, такие как DAPI , которые связываются с ДНК , используются для маркировки определенных структур внутри клетки. Более поздние разработки включают иммунофлуоресценцию , в которой используются флуоресцентно меченные антитела для распознавания определенных белков в образце, а также флуоресцентные белки, такие как GFP , которые живая клетка может экспрессировать , делая ее флуоресцентной.
Все современные оптические микроскопы, предназначенные для просмотра образцов в проходящем свете, имеют одни и те же основные компоненты светового пути. Кроме того, подавляющее большинство микроскопов имеют одинаковые «конструктивные» компоненты [27] (нумерация ниже соответствует изображению справа):
Окуляр , или окулярная линза, представляет собой цилиндр, содержащий две или более линз ; его функция — сфокусировать изображение для глаза. Окуляр вставляется в верхний конец тубуса корпуса. Окуляры взаимозаменяемы, и можно вставить множество разных окуляров с разной степенью увеличения. Типичные значения увеличения окуляров включают 5×, 10× (наиболее распространенный), 15× и 20×. В некоторых высокопроизводительных микроскопах оптическая конфигурация объектива и окуляра подобрана таким образом, чтобы обеспечить наилучшие оптические характеристики. Чаще всего это происходит с апохроматическими объективами.
Револьверная головка объектива, револьвер или вращающаяся носовая часть — это часть, в которой находится набор объективов. Это позволяет пользователю переключаться между объективами.
На нижнем конце типичного составного оптического микроскопа имеется одна или несколько линз объектива , которые собирают свет от образца. Объектив обычно находится в цилиндрическом корпусе, содержащем стеклянную одно- или многоэлементную составную линзу. Обычно в круглую носовую часть ввинчивается около трех объективов, которые можно вращать для выбора необходимой линзы объектива. Эти устройства спроектированы как парфокальные , что означает, что при смене одной линзы на другую в микроскопе образец остается в фокусе . Объективы микроскопа характеризуются двумя параметрами: увеличением и числовой апертурой . Первое обычно находится в диапазоне от 5× до 100×, а второе — от 0,14 до 0,7, что соответствует фокусным расстояниям от 40 до 2 мм соответственно. Объективы с более высоким увеличением обычно имеют более высокую числовую апертуру и меньшую глубину резкости получаемого изображения. Для некоторых высокопроизводительных объективов могут потребоваться подходящие окуляры для обеспечения наилучших оптических характеристик.
В некоторых микроскопах используются масляно-иммерсионные объективы или водо-иммерсионные объективы для большего разрешения при большом увеличении. Они используются с материалом с соответствующим индексом, таким как иммерсионное масло или вода, и соответствующим покровным стеклом между линзой объектива и образцом. Показатель преломления материала, соответствующего показателю, выше, чем у воздуха, что позволяет линзе объектива иметь большую числовую апертуру (более 1), так что свет передается от образца к внешней поверхности линзы объектива с минимальным преломлением. Могут быть достигнуты числовые апертуры до 1,6. [28] Большая числовая апертура позволяет собирать больше света, что делает возможным детальное наблюдение за более мелкими деталями. Масляно-иммерсионная линза обычно имеет увеличение от 40 до 100×.
Ручки регулировки перемещают предметный столик вверх и вниз с отдельной регулировкой грубой и точной фокусировки. Те же элементы управления позволяют микроскопу адаптироваться к образцам разной толщины. В старых моделях микроскопов колеса регулировки фокуса перемещали тубус микроскопа вверх или вниз относительно штатива и имели фиксированный предметный столик.
Вся оптическая сборка традиционно крепится к жесткому кронштейну, который, в свою очередь, крепится к прочной U-образной ножке для обеспечения необходимой жесткости. Угол рычага может регулироваться, что позволяет регулировать угол обзора.
Рама обеспечивает точку крепления для различных органов управления микроскопом. Обычно это включает в себя элементы управления фокусировкой, обычно большое колесо с накаткой для регулировки грубой фокусировки, а также меньшее колесо с накаткой для управления точной фокусировкой. Другими функциями могут быть элементы управления лампой и/или элементы управления для регулировки конденсатора.
Предмет представляет собой платформу под объективом, на которой поддерживается просматриваемый образец. В центре предметного столика находится отверстие, через которое проходит свет, освещающий образец. На столике обычно имеются кронштейны для крепления предметных стекол (прямоугольные стеклянные пластины типичными размерами 25×75 мм, на которых крепится препарат).
При увеличении более 100× перемещать предметное стекло вручную нецелесообразно. Механический предметный столик, типичный для микроскопов средней и более высокой стоимости, позволяет совершать небольшие перемещения предметного стекла с помощью ручек управления, которые перемещают образец/предметное стекло по желанию. Если в микроскопе изначально не было механического предметного столика, возможно, его можно будет добавить.
Все этапы перемещаются вверх и вниз для фокусировки. При использовании механического предметного столика слайды перемещаются по двум горизонтальным осям для позиционирования образца для изучения деталей образца.
Фокусировка начинается с меньшего увеличения, чтобы пользователь центрировал образец на предметном столике. Переход к более высокому увеличению требует перемещения предметного столика выше по вертикали для повторной фокусировки при большем увеличении, а также может потребоваться небольшая корректировка горизонтального положения образца. Регулировка горизонтального положения образца является причиной использования механического столика.
Из-за сложности подготовки образцов и размещения их на предметных стеклах детям лучше начинать с подготовленных предметных стекол, которые расположены по центру и легко фокусируются независимо от используемого уровня фокусировки.
Можно использовать множество источников света. Проще говоря, дневной свет направляется через зеркало . Однако большинство микроскопов имеют собственный регулируемый и управляемый источник света – часто галогенную лампу , хотя освещение с использованием светодиодов и лазеров становится все более распространенным. Подсветка Келера часто предусмотрена на более дорогих инструментах.
Конденсор представляет собой линзу, предназначенную для фокусировки света от источника освещения на образец. Конденсор может также включать в себя другие элементы, такие как диафрагма и/или фильтры, для управления качеством и интенсивностью освещения. Для таких методов освещения, как темное поле , фазовый контраст и дифференциально-интерференционно-контрастная микроскопия, дополнительные оптические компоненты должны быть точно выровнены на пути света.
Фактическая сила или увеличение составного оптического микроскопа является произведением оптической силы окуляра и объектива. Например, 10-кратное увеличение окуляра и 100-кратное увеличение объектива дают общее увеличение в 1000 раз. Модифицированные условия, такие как использование масла или ультрафиолетового света, могут повысить разрешение и обеспечить разрешение деталей при увеличении более 1000 раз.
Доступно множество методов, которые изменяют путь света для создания улучшенного контрастного изображения из образца. Основные методы повышения контрастности образца включают кросс-поляризованный свет , темное поле , фазовый контраст и дифференциально-интерференционное контрастное освещение. Недавний метод ( Sarfus ) сочетает в себе кросс-поляризованный свет и специальные слайды с усиленным контрастом для визуализации нанометрических образцов.
Современные микроскопы позволяют не просто наблюдать изображение образца в проходящем свете; Существует множество методов, которые можно использовать для извлечения других типов данных. Для большинства из них требуется дополнительное оборудование в дополнение к базовому составному микроскопу.
Оптическая микроскопия широко используется в микроэлектронике, нанофизике, биотехнологии, фармацевтических исследованиях, минералогии и микробиологии. [30]
Оптическая микроскопия используется для медицинской диагностики , область, называемая гистопатологией, когда речь идет о тканях, или при мазках свободных клеток или фрагментов тканей.
В промышленности широко распространены бинокулярные микроскопы. Помимо приложений, требующих истинного восприятия глубины , использование двойных окуляров снижает нагрузку на глаза , связанную с долгим рабочим днем на станции микроскопии. В некоторых приложениях полезны микроскопы с большим рабочим расстоянием или длиннофокусным расстоянием [31] . Возможно, предмет придется осмотреть за окном , или промышленные объекты могут представлять опасность для объекта. Такая оптика напоминает телескопы с возможностью близкой фокусировки. [32] [33]
Измерительные микроскопы используются для точных измерений. Есть два основных типа. Одна из них имеет градуированную сетку , позволяющую измерять расстояния в фокальной плоскости. [34] Другой (более старый) тип имеет простое перекрестие и микрометрический механизм для перемещения объекта относительно микроскопа. [35]
Очень маленькие портативные микроскопы нашли применение там, где лабораторный микроскоп был бы обузой. [36]
При очень большом увеличении в проходящем свете точечные объекты выглядят как размытые диски, окруженные дифракционными кольцами. Их называют дисками Эйри . Под разрешающей способностью микроскопа понимают способность различать два близко расположенных диска Эйри (или, другими словами, способность микроскопа выявлять соседние детали структуры как отдельные и отдельные). Именно эти эффекты дифракции ограничивают способность разрешать мелкие детали. На степень и величину дифракционных картин влияют как длина волны света (λ), преломляющие материалы , используемые для изготовления объектива, так и числовая апертура (NA) объектива. Поэтому существует конечный предел, за которым невозможно разрешить отдельные точки в объективном поле, известный как дифракционный предел . Предполагая, что оптические аберрации во всей оптической установке пренебрежимо малы, разрешение d можно определить как:
Обычно предполагается длина волны 550 нм, что соответствует зеленому свету. При использовании воздуха в качестве внешней среды высшая практическая ЧА составляет 0,95, а при использовании масла — до 1,5. На практике наименьшее значение d , которое можно получить с помощью обычных линз, составляет около 200 нм. Новый тип линз, использующий многократное рассеяние света, позволил улучшить разрешение до уровня ниже 100 нм. [37]
Доступно несколько методов для достижения разрешения, превышающего предел пропускаемого света, описанный выше. Голографические методы, описанные Куржоном и Булабуа в 1979 году, также способны преодолеть этот предел разрешения, хотя в их экспериментальном анализе разрешение было ограничено. [38]
Используя флуоресцентные образцы, доступны дополнительные методы. Примеры включают Vertico SMI , сканирующую оптическую микроскопию ближнего поля , в которой используются затухающие волны , и истощение стимулированного излучения . В 2005 году микроскоп, способный обнаруживать одну молекулу, был описан как учебное пособие. [39]
Несмотря на значительный прогресс за последнее десятилетие, методы преодоления дифракционного предела остаются ограниченными и специализированными.
Хотя большинство методов ориентированы на увеличение латерального разрешения, существуют также методы, которые позволяют анализировать чрезвычайно тонкие образцы. Например, методы Сарфуса помещают тонкий образец на поверхность, усиливающую контраст, и тем самым позволяют напрямую визуализировать пленки толщиной до 0,3 нанометра.
8 октября 2014 года Нобелевская премия по химии была присуждена Эрику Бетцигу , Уильяму Мёрнеру и Стефану Хеллу за разработку флуоресцентной микроскопии сверхразрешения . [40] [41]
SMI (микроскопия с пространственно-модулированным освещением) представляет собой световой оптический процесс так называемой инженерии функции рассеяния точки (PSF). Это процессы, которые модифицируют PSF микроскопа подходящим образом, чтобы либо увеличить оптическое разрешение, чтобы максимизировать точность измерения расстояний до флуоресцентных объектов, которые малы по сравнению с длиной волны освещающего света, либо извлечь другие структурные параметры из нанометровом диапазоне. [42] [43]
SPDM (спектральная прецизионная дальняя микроскопия), основная технология локализационной микроскопии, представляет собой светооптический процесс флуоресцентной микроскопии, который позволяет измерять положение, расстояние и угол «оптически изолированных» частиц (например, молекул) значительно ниже теоретического предела разрешения световой микроскопии. «Оптически изолированный» означает, что в данный момент времени регистрируется только одна частица/молекула в области размера, определяемого обычным оптическим разрешением (обычно диаметром около 200–250 нм). Это возможно, когда все молекулы внутри такой области несут разные спектральные маркеры (например, разные цвета или другие полезные различия в излучении света разными частицами). [44] [45] [46] [47]
Многие стандартные флуоресцентные красители, такие как GFP , красители Alexa, красители Atto, Cy2/Cy3 и молекулы флуоресцеина, можно использовать для локализационной микроскопии при наличии определенных фотофизических условий. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически модифицируемые флуорофоры), для нановизуализации достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности. [48]
Трехмерная микроскопия со сверхвысоким разрешением со стандартными флуоресцентными красителями может быть достигнута путем сочетания локализационной микроскопии для стандартных флуоресцентных красителей SPDMphymod и структурированного освещения SMI. [49]
Истощение стимулированного излучения — простой пример того, как возможно более высокое разрешение, превышающее дифракционный предел, но оно имеет серьезные ограничения. STED — это метод флуоресцентной микроскопии, в котором используется комбинация световых импульсов для индукции флуоресценции в небольшой группе флуоресцентных молекул в образце. Каждая молекула создает на изображении световое пятно, ограниченное дифракцией, и центр каждого из этих пятен соответствует местоположению молекулы. Поскольку количество флуоресцирующих молекул невелико, пятна света вряд ли перекроются, и поэтому их можно точно разместить. Затем этот процесс повторяется много раз для создания изображения. Стефан Хелл из Института биофизической химии Макса Планка был награжден 10-й Немецкой премией будущего в 2006 году и Нобелевской премией по химии в 2014 году за разработку микроскопа STED и связанных с ним методологий. [50]
Чтобы преодолеть ограничения, налагаемые пределом дифракции видимого света, были разработаны другие микроскопы, использующие другие волны.
Важно отметить, что волны более высокой частоты имеют ограниченное взаимодействие с веществом, например, мягкие ткани относительно прозрачны для рентгеновских лучей, что приводит к появлению различных источников контраста и различных целевых применений.
Использование электронов и рентгеновских лучей вместо света обеспечивает гораздо более высокое разрешение — длина волны излучения короче, поэтому дифракционный предел ниже. Чтобы сделать коротковолновый зонд неразрушающим, была предложена и широко обсуждалась в литературе система визуализации атомным пучком ( атомный наноскоп ), но она пока не может конкурировать с традиционными системами визуализации.
СТМ и АСМ — это методы сканирования с использованием небольшого зонда, который сканирует поверхность образца. Разрешение в этих случаях ограничено размером зонда; Методы микрообработки позволяют производить зонды с радиусом кончика 5–10 нм.
Кроме того, в таких методах, как электронная или рентгеновская микроскопия, используется вакуум или частичный вакуум, что ограничивает их использование для живых и биологических образцов (за исключением сканирующего электронного микроскопа окружающей среды ). Камеры для образцов, необходимые для всех таких инструментов, также ограничивают размер выборки, и манипуляции с образцами усложняются. На изображениях, полученных этими методами, цвет не виден, поэтому некоторая информация теряется. Однако они необходимы при исследовании молекулярных или атомных эффектов, таких как старение алюминиевых сплавов или микроструктура полимеров .
