История молекулярной биологии начинается в 1930-х годах с сближения различных, ранее отдельных биологических и физических дисциплин: биохимии , генетики , микробиологии , вирусологии и физики . В надежде понять жизнь на ее самом фундаментальном уровне многие физики и химики также проявили интерес к тому, что впоследствии стало молекулярной биологией .
В современном смысле молекулярная биология пытается объяснить явления жизни, исходя из свойств макромолекул , которые их порождают. Две категории макромолекул, в частности, находятся в центре внимания молекулярного биолога: 1) нуклеиновые кислоты , среди которых наиболее известной является дезоксирибонуклеиновая кислота (или ДНК), составляющая генов , и 2) белки , которые являются активными агентами живых организмов. . Таким образом, одним из определений сферы молекулярной биологии является характеристика структуры, функций и взаимоотношений между этими двумя типами макромолекул. Этого относительно ограниченного определения будет достаточно, чтобы позволить нам установить дату так называемой «молекулярной революции» или, по крайней мере, установить хронологию ее наиболее фундаментальных событий.
В своих самых ранних проявлениях молекулярная биология (название было придумано Уорреном Уивером из Фонда Рокфеллера в 1938 году [1]) представляла собой идею физического и химического объяснения жизни, а не последовательную дисциплину. После появления менделевской хромосомной теории наследственности в 1910-х годах и развития теории атома и квантовой механики в 1920-х годах такие объяснения казались вполне достижимыми. Уивер и другие поощряли (и финансировали) исследования на стыке биологии, химии и физики, в то время как выдающиеся физики, такие как Нильс Бор и Эрвин Шредингер, обратили свое внимание на биологические спекуляции. Однако в 1930-е и 1940-е годы было совершенно неясно, какие междисциплинарные исследования принесут плоды (если таковые вообще будут иметь место); работы в области коллоидной химии , биофизики и радиационной биологии , кристаллографии и других новых областей казались многообещающими.
В 1940 году Джордж Бидл и Эдвард Татум продемонстрировали существование точной взаимосвязи между генами и белками. [2] В ходе своих экспериментов, связывающих генетику с биохимией, они переключились от основы генетики дрозофилы к более подходящему модельному организму , грибу Neurospora ; создание и использование новых модельных организмов станет постоянной темой в развитии молекулярной биологии. В 1944 году Освальд Эйвери , работавший в Институте Рокфеллера в Нью-Йорке , продемонстрировал, что гены состоят из ДНК [3] (см. эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти ). В 1952 году Альфред Херши и Марта Чейз подтвердили, что генетический материал бактериофага , вируса, поражающего бактерии, состоит из ДНК [4] (см. эксперимент Херши-Чейза ). В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик открыли двойную спиральную структуру молекулы ДНК на основе открытий Розалинды Франклин . [5] В 1961 году Франсуа Жакоб и Жак Моно продемонстрировали, что продукты определенных генов регулируют экспрессию других генов, воздействуя на определенные участки на краю этих генов. Они также выдвинули гипотезу о существовании посредника между ДНК и ее белковыми продуктами, который они назвали информационной РНК . [6] Между 1961 и 1965 годами была определена связь между информацией, содержащейся в ДНК, и структурой белков: существует код, генетический код , который создаёт соответствие между последовательностью нуклеотидов в последовательности ДНК и рядом аминокислоты в белках.
В апреле 2023 года ученые на основе новых данных пришли к выводу, что Розалинда Франклин внесла свой вклад и «равноправного игрока» в процесс открытия ДНК, а не наоборот, как могло быть представлено впоследствии, после момента открытия. [7] [8] [9]
Главные открытия молекулярной биологии произошли всего за двадцать пять лет. Потребовалось еще пятнадцать лет, прежде чем новые, более сложные технологии, объединенные сегодня под названием генная инженерия , позволили изолировать и охарактеризовать гены, особенно генов очень сложных организмов.
Если оценить молекулярную революцию в контексте биологической истории, легко заметить, что она является кульминацией длительного процесса, начавшегося с первых наблюдений с помощью микроскопа. Целью этих первых исследователей было понять функционирование живых организмов, описывая их организацию на микроскопическом уровне. С конца XVIII века характеристика химических молекул, из которых состоят живые существа, стала уделять все больше внимания, наряду с зарождением в XIX веке физиологической химии , разработанной немецким химиком Юстусом фон Либихом , и последующим зарождением биохимии. в начале 20-х годов благодаря другому немецкому химику Эдуарду Бюхнеру . Между молекулами, изучаемыми химиками, и крошечными структурами, видимыми под оптическим микроскопом , такими как клеточное ядро или хромосомы, существовала неясная зона, «мир игнорируемых измерений», как его назвал физик-химик Вольфганг. Оствальд . Этот мир населен коллоидами — химическими соединениями, структура и свойства которых до конца не изучены.
Успехи молекулярной биологии обусловлены исследованием этого неизвестного мира с помощью новых технологий, разработанных химиками и физиками: дифракция рентгеновских лучей , электронная микроскопия , ультрацентрифугирование и электрофорез . Эти исследования выявили структуру и функцию макромолекул.
Вехой в этом процессе стала работа Лайнуса Полинга в 1949 году, которая впервые связала специфическую генетическую мутацию у пациентов с серповидно-клеточной анемией с продемонстрированным изменением отдельного белка — гемоглобина в эритроцитах гетерозиготных или гомозиготных людей.
Развитие молекулярной биологии является также столкновением двух дисциплин, добившихся значительного прогресса в течение первых тридцати лет двадцатого века: биохимии и генетики. Первый изучает структуру и функции молекул, из которых состоят живые существа. Между 1900 и 1940 годами были описаны центральные процессы обмена веществ : процесс пищеварения и всасывания питательных элементов, полученных с пищей, таких как сахара. Каждый из этих процессов катализируется определенным ферментом . Ферменты — это белки, подобные антителам, присутствующим в крови, или белкам, ответственным за мышечные сокращения. В результате изучение белков, их структуры и синтеза стало одной из основных задач биохимиков.
Вторая дисциплина биологии, получившая развитие в начале 20 века, — генетика. После повторного открытия законов Менделя посредством исследований Гуго де Фриза , Карла Корренса и Эриха фон Чермака в 1900 году, эта наука начала формироваться благодаря принятию Томасом Хантом Морганом в 1910 году модельного организма для генетических исследований. , знаменитая плодовая мушка ( Drosophila melanogaster ). Вскоре после этого Морган показал, что гены локализованы в хромосомах. После этого открытия он продолжил работу с дрозофилой и вместе с многочисленными другими исследовательскими группами подтвердил важность этого гена в жизни и развитии организмов. Тем не менее химическая природа генов и механизмы их действия оставались загадкой. Молекулярные биологи посвятили себя определению структуры и описанию сложных отношений между генами и белками.
Развитие молекулярной биологии было не просто плодом какой-то внутренней «необходимости» в истории идей, но было характерно историческим явлением со всеми его неизвестными, неуловимыми и непредвиденными обстоятельствами: замечательные достижения в физике в начале XX века. XX век выявил относительную запоздалость развития биологии, которая стала «новым рубежом» в поисках знаний об эмпирическом мире. Более того, развитие теории информации и кибернетики в 1940-х годах, в ответ на военные нужды, принесло в новую биологию значительное количество плодотворных идей и особенно метафор.
Выбор бактерий и их вируса, бактериофага, в качестве моделей для изучения фундаментальных механизмов жизни был почти естественным — это мельчайшие из известных живых организмов — и в то же время плодом индивидуального выбора. Эта модель обязана своим успехом, прежде всего, известности и организованности Макса Дельбрюка , немецкого физика, который смог создать динамичную исследовательскую группу, базирующуюся в США, исключительной сферой деятельности которой было изучение бактериофагов. : группа фагов . [10]
Группа фагов представляла собой неформальную сеть биологов, которые проводили фундаментальные исследования в основном бактериофага Т4 и внесли большой плодотворный вклад в генетику микробов и истоки молекулярной биологии в середине 20 века. В 1961 году Сидней Бреннер , один из первых членов группы фагов, сотрудничал с Фрэнсисом Криком , Лесли Барнеттом и Ричардом Уоттс-Тобином в Кавендишской лаборатории в Кембридже для проведения генетических экспериментов , которые продемонстрировали основную природу генетического кода белков . [11] Эти эксперименты, проведенные с мутантами гена rIIB бактериофага Т4, показали, что для гена, кодирующего белок, три последовательных основания ДНК гена определяют каждую последующую аминокислоту белка. Таким образом, генетический код представляет собой триплетный код, где каждый триплет (называемый кодоном) определяет определенную аминокислоту. Они также обнаружили, что кодоны не перекрываются друг с другом в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что такая последовательность считывается с фиксированной начальной точки. В 1962–1964 годах исследователи фага Т4 предоставили возможность изучить функцию практически всех генов, необходимых для роста бактериофага, в лабораторных условиях. [12] [13] Этим исследованиям способствовало открытие двух классов условно летальных мутантов . Один класс таких мутантов известен как янтарные мутанты . [14] Другой класс условно-летальных мутантов называется термочувствительными мутантами . [15] Исследования этих двух классов мутантов привели к значительному пониманию многочисленных фундаментальных биологических проблем. Таким образом, было достигнуто понимание функций и взаимодействий белков, участвующих в механизме репликации ДНК , репарации ДНК и рекомбинации ДНК . Кроме того, было получено понимание процессов, посредством которых вирусы собираются из компонентов белка и нуклеиновых кислот (молекулярный морфогенез ). Также была выяснена роль терминирующих кодонов цепи . В одном примечательном исследовании использовались янтарные мутанты, дефектные по гену, кодирующему основной головной белок бактериофага Т4. [16] Этот эксперимент предоставил убедительные доказательства широко распространенной, но до 1964 года все еще недоказанной «гипотезы последовательности», согласно которой аминокислотная последовательность белка определяется нуклеотидной последовательностью гена .определение белка. Таким образом, это исследование продемонстрировало коллинеарность гена с кодируемым им белком.
Географическая панорама развития новой биологии была обусловлена прежде всего предшествующими работами. США, где генетика развивалась наиболее быстро, и Великобритания, где одновременно проводились как генетические, так и биохимические исследования на весьма продвинутом уровне, были в авангарде. Германия, колыбель революций в физике, с лучшими умами и самыми передовыми генетическими лабораториями в мире, должна была сыграть первостепенную роль в развитии молекулярной биологии. Но история распорядилась иначе: приход нацистов в 1933 году – и, в менее радикальной степени, ужесточение тоталитарных мер в фашистской Италии – вызвали эмиграцию большого числа ученых-евреев и неевреев. Большинство из них бежали в США или Великобританию, что дало дополнительный импульс научному динамизму этих стран. Эти движения в конечном итоге с самого начала сделали молекулярную биологию поистине международной наукой.
Изучение ДНК является центральной частью молекулярной биологии.
Работая в 19 веке, биохимики первоначально выделили ДНК и РНК (смешанные вместе) из ядер клеток. Они относительно быстро оценили полимерную природу своих изолятов «нуклеиновой кислоты», но лишь позже осознали, что нуклеотиды бывают двух типов — один содержит рибозу , а другой — дезоксирибозу . Именно это последующее открытие привело к идентификации и названию ДНК как вещества, отличного от РНК.
Фридрих Мишер (1844–1895) открыл в 1869 году вещество, которое он назвал «нуклеином». Несколько позже он выделил чистый образец материала, ныне известного как ДНК, из спермы лосося, а в 1889 году его ученик Рихард Альтманн дал ему название "нуклеиновая кислота". Было обнаружено, что это вещество существует только в хромосомах.
В 1919 году Фебус Левен из Института Рокфеллера определил компоненты (четыре основания, сахар и фосфатную цепь) и показал, что компоненты ДНК связаны в порядке фосфат-сахар-основание. Он назвал каждую из этих единиц нуклеотидом и предположил, что молекула ДНК состоит из цепочки нуклеотидных единиц, связанных между собой фосфатными группами, которые являются «основой» молекулы. Однако Левен считал, что цепочка короткая и основания повторяются в одном и том же фиксированном порядке. Торбьорн Касперссон и Эйнар Хаммерстен показали, что ДНК представляет собой полимер.
В 1927 году Николай Кольцов предположил, что унаследованные черты будут наследоваться через «гигантскую наследственную молекулу», которая будет состоять из «двух зеркальных нитей, которые будут воспроизводиться полуконсервативным образом, используя каждую нить в качестве шаблона». [17] Макс Дельбрюк , Николай Тимофеев-Ресовский и Карл Г. Циммер опубликовали в 1935 году результаты, предполагающие, что хромосомы представляют собой очень большие молекулы, структуру которых можно изменить под воздействием рентгеновских лучей , и что, изменив таким образом их структуру, было возможно изменить наследственные характеристики, управляемые этими хромосомами. В 1937 году Уильям Эстбери получил первые рентгенограммы ДНК. Он не смог предложить правильную структуру, но образцы показали, что ДНК имеет регулярную структуру, и поэтому можно было бы сделать вывод, что это за структура.
В 1943 году Освальд Теодор Эйвери и группа ученых обнаружили, что черты, присущие «гладкой» форме пневмококка, могут быть переданы «шероховатой» форме той же бактерии, просто сделав доступной убитую «гладкую» (S) форму. к живой «грубой» (R) форме. Совершенно неожиданно живые бактерии R Pneumococcus трансформировались в новый штамм S-формы, а переданные S-характеристики оказались наследуемыми. Эйвери называл средство передачи черт преобразующим принципом ; он определил ДНК как преобразующий принцип, а не белок , как считалось ранее. По сути, он повторил эксперимент Фредерика Гриффита . В 1953 году Альфред Херши и Марта Чейз провели эксперимент ( эксперимент Херши-Чейза ), который показал на фаге Т2 , что ДНК является генетическим материалом (Херши разделил Нобелевскую премию с Лурией).
В 1950-х годах три группы поставили перед собой цель определить структуру ДНК. Первая группа, которая начала свою деятельность, находилась в Королевском колледже Лондона , ее возглавлял Морис Уилкинс , а позже к ней присоединилась Розалинда Франклин . Другая группа, состоящая из Фрэнсиса Крика и Джеймса Уотсона, находилась в Кембридже . Третья группа находилась в Калифорнийском технологическом институте и возглавлялась Лайнусом Полингом . Крик и Уотсон построили физические модели, используя металлические стержни и шарики, в которые они включили известные химические структуры нуклеотидов, а также известное положение связей, соединяющих один нуклеотид с другим вдоль полимера. В Королевском колледже Морис Уилкинс и Розалинда Франклин исследовали рентгенограммы волокон ДНК. Из трех групп только лондонская группа смогла получить дифракционные картины хорошего качества и, таким образом, получить достаточные количественные данные о структуре.
В 1948 году Полинг обнаружил, что многие белки имеют спиральную (см. альфа-спираль ) форму. Полинг вывел эту структуру на основе рентгенограмм и попыток физически смоделировать эти структуры. (Позже Полинг также предположил неверную трехцепочечную спиральную структуру ДНК на основе данных Эстбери.) Даже из первоначальных данных дифракции ДНК Мориса Уилкинса было очевидно, что в этой структуре участвуют спирали. Но это понимание было только началом. Оставался вопрос о том, сколько нитей сходилось вместе, было ли это число одинаковым для каждой спирали, были ли основания направлены к оси спирали или от нее, и, в конечном счете, каковы были явные углы и координаты всех связей и атомов. Такие вопросы мотивировали усилия Уотсона и Крика по моделированию.
В своем моделировании Уотсон и Крик ограничились тем, что они считали химически и биологически разумным. Тем не менее широта возможностей была очень широка. Прорыв произошел в 1952 году, когда Эрвин Чаргафф посетил Кембридж и вдохновил Крика описанием экспериментов, которые Чаргафф опубликовал в 1947 году. Чаргафф заметил, что пропорции четырех нуклеотидов различаются между одним образцом ДНК и другим, но это касается определенных пар нуклеотиды — аденин и тимин, гуанин и цитозин — оба нуклеотида всегда присутствуют в равных пропорциях.
Используя дифракцию рентгеновских лучей , а также другие данные Розалинды Франклин и ее информацию о том, что основания спарены, Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик в 1953 году пришли к первой точной модели молекулярной структуры ДНК, которая была принята Розалиндой Франклин после проверки. [18] Об открытии было объявлено 28 февраля 1953 года; первая статья Уотсона/Крика появилась в журнале Nature 25 апреля 1953 года. Сэр Лоуренс Брэгг , директор Кавендишской лаборатории , где работали Уотсон и Крик, выступил с докладом в Медицинской школе больницы Гая в Лондоне в четверг, 14 мая 1953 года: результатом чего стала статья Ричи Колдера в лондонской газете News Chronicle в пятницу, 15 мая 1953 года, озаглавленная «Почему ты — ты. Ближайший секрет жизни». Эта новость дошла до читателей The New York Times на следующий день; Виктор К. МакЭлэни , исследуя свою биографию «Уотсон и ДНК: совершая научную революцию», нашел вырезку из шестиабзацной статьи «Нью-Йорк Таймс» , написанной в Лондоне и датированной 16 мая 1953 года, с заголовком «Форма». Единица жизни в камере сканируется». Статья была опубликована в раннем выпуске, а затем была удалена, чтобы освободить место для новостей, которые считались более важными. ( Впоследствии 12 июня 1953 года газета New York Times опубликовала более длинную статью). Газета для студентов Кембриджского университета также опубликовала собственную короткую статью об открытии в субботу, 30 мая 1953 года. Первоначальное заявление Брэгга на Сольвеевской конференции по белкам в Бельгии 8 апреля 1953 года осталось незамеченным прессой. В 1962 году Уотсон, Крик и Морис Уилкинс совместно получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за определение структуры ДНК.
Модель Уотсона и Крика сразу же после ее презентации вызвала большой интерес. Придя к выводу 21 февраля 1953 года, Уотсон и Крик сделали свое первое заявление 28 февраля. В влиятельной презентации 1957 года Крик изложил « центральную догму молекулярной биологии », которая предсказала взаимосвязь между ДНК, РНК и белков и сформулировал «гипотезу последовательности». Критическое подтверждение механизма репликации, подразумеваемого двойной спиральной структурой, последовало в 1958 году в форме эксперимента Мезельсона-Шталя . Работа Крика и его коллег показала, что генетический код основан на неперекрывающихся тройках оснований, называемых кодонами, а Хар Гобинд Хорана и другие вскоре после этого (1966) расшифровали генетический код . Эти открытия символизируют рождение молекулярной биологии .
Самые ранние работы в области структурной биологии РНК более или менее совпадали с работами по ДНК, проводившимися в начале 1950-х годов. В своей основополагающей статье 1953 года Уотсон и Крик предположили, что скученность Ван-дер-Ваальса 2`ОН-группой рибозы не позволит РНК принять двойную спиральную структуру, идентичную предложенной ими модели – то, что мы теперь знаем как ДНК B-формы. [19] Это вызвало вопросы о трехмерной структуре РНК: может ли эта молекула образовывать спиральную структуру того или иного типа, и если да, то как? Как и в случае с ДНК, ранние структурные работы над РНК были сосредоточены на выделении нативных полимеров РНК для дифракционного анализа волокон. Отчасти из-за неоднородности протестированных образцов первые дифракционные картины волокон обычно были неоднозначными и трудно поддающимися интерпретации. В 1955 году Марианна Грюнберг-Манаго и ее коллеги опубликовали статью, описывающую фермент полинуклеотидфосфорилазу , которая отщепляет фосфатную группу от нуклеотиддифосфатов, катализируя их полимеризацию. [20] Это открытие позволило исследователям синтезировать гомогенные нуклеотидные полимеры, которые они затем объединили для получения двухцепочечных молекул. Эти образцы дали наиболее легко интерпретируемые картины дифракции волокон, которые когда-либо были получены, что позволяет предположить упорядоченную спиральную структуру родственной двухцепочечной РНК, которая отличается от структуры, наблюдаемой в ДНК. Эти результаты проложили путь к серии исследований различных свойств и склонностей РНК. В конце 1950-х и начале 1960-х годов было опубликовано множество статей по различным темам структуры РНК, включая гибридизацию РНК-ДНК, [21] трехцепочечную РНК, [22] и даже мелкомасштабную кристаллографию динуклеотидов РНК - GC и АС – в примитивных спиралевидных расположениях. [23] Более углубленный обзор ранних работ в области структурной биологии РНК можно найти в статье Александра Рича « Эра пробуждения РНК: структурная биология РНК в ранние годы» . [24]
В середине 1960-х годов интенсивно изучалась роль тРНК в синтезе белка. К этому моменту рибосомы были вовлечены в синтез белка, и было показано, что цепь мРНК необходима для формирования этих структур. В публикации 1964 года Уорнер и Рич показали, что рибосомы, активные в синтезе белка, содержат молекулы тРНК, связанные в сайтах A и P, и обсудили идею о том, что эти молекулы способствуют реакции пептидилтрансферазы . [25] Однако, несмотря на значительные биохимические характеристики, структурные основы функции тРНК оставались загадкой. В 1965 году Холли и др. очистили и секвенировали первую молекулу тРНК, первоначально предположив, что она приняла структуру клеверного листа, основанную в основном на способности определенных областей молекулы образовывать структуры стебельковой петли. [26] Выделение тРНК оказалось первой крупной находкой в структурной биологии РНК. После публикации Роберта Холли многие исследователи начали работу по выделению тРНК для кристаллографических исследований, разрабатывая улучшенные методы выделения молекулы в процессе работы. К 1968 году несколько групп создали кристаллы тРНК, но они оказались ограниченного качества и не давали данных с разрешением, необходимым для определения структуры. [27] В 1971 году Ким и др. добились еще одного прорыва, создав кристаллы дрожжевой тРНК PHE , которые дифрагировали до разрешения 2–3 ангстрема с использованием спермина , природного полиамина , который связывался с тРНК и стабилизировал ее. [28] Однако, несмотря на наличие подходящих кристаллов, структура тРНК PHE не была сразу решена с высоким разрешением; скорее, потребовалась новаторская работа по использованию производных тяжелых металлов и гораздо больше времени, чтобы создать высококачественную карту плотности всей молекулы. В 1973 году Ким и др. создали карту молекулы тРНК размером 4 ангстрема, на которой они могли однозначно проследить весь остов. [29] Этому решению последуют многие другие, поскольку различные исследователи работали над уточнением структуры и, таким образом, более тщательно выяснением деталей спаривания оснований и взаимодействий при штабелировании, а также проверки опубликованной архитектуры молекулы.
Структура тРНК PHE примечательна в области структуры нуклеиновых кислот в целом, поскольку она представляет собой первое решение структуры длинноцепочечной нуклеиновой кислоты любого типа - РНК или ДНК - предшествовавшее решению Ричарда Э. Дикерсона B-. сформируют додекамер почти на десятилетие. [30] Кроме того, тРНК PHE продемонстрировал многие из третичных взаимодействий, наблюдаемых в архитектуре РНК, которые не будут классифицированы и более тщательно поняты в ближайшие годы, что обеспечивает основу для всех будущих структурных исследований РНК.
В течение значительного времени после появления первых структур тРНК область структуры РНК существенно не продвинулась вперед. Возможность изучения структуры РНК зависела от возможности выделить РНК-мишень. На протяжении многих лет это ограничивало область применения, отчасти потому, что другие известные мишени, например, рибосому, было значительно сложнее изолировать и кристаллизовать. Более того, поскольку другие интересные мишени РНК просто не были идентифицированы или не были достаточно изучены, чтобы считаться интересными, просто не хватало вещей для структурного изучения. Таким образом, в течение примерно двадцати лет после первоначальной публикации структуры тРНК PHE были решены структуры лишь нескольких других мишеней РНК, причем почти все из них принадлежали к семейству транспортных РНК. [31] Это досадное отсутствие масштабов в конечном итоге будет преодолено во многом благодаря двум крупным достижениям в исследованиях нуклеиновых кислот: идентификации рибозимов и способности производить их посредством транскрипции in vitro .
После публикации Тома Чеха , указывающей на то, что интрон группы I тетрахимены является автокаталитическим рибозимом, [32] и отчета Сидни Альтмана о катализе рибонуклеазой P РНК, [33] в конце 1980-х годов было идентифицировано несколько других каталитических РНК, [34 ] включая рибозим «головка молотка» . В 1994 году Маккей и др. опубликовали структуру «молотообразного комплекса РНК-ДНК-рибозим -ингибитор» с разрешением 2,6 ангстрема, в котором автокаталитическая активность рибозима нарушалась за счет связывания с ДНК-субстратом. [35] В конечном итоге было показано, что конформация рибозима, опубликованная в этой статье, является одним из нескольких возможных состояний, и хотя этот конкретный образец был каталитически неактивным, последующие структуры выявили его архитектуру активного состояния. За этой структурой последовала публикация Дженнифер Дудна структуры доменов P4-P6 интрона группы I Tetrahymena , фрагмента рибозима, первоначально прославленного Чехом. [36] Второе предложение в названии этой публикации — « Принципы упаковки РНК» — кратко демонстрирует ценность этих двух структур: впервые можно провести сравнение между хорошо описанными структурами тРНК и структурами глобулярных РНК, не относящихся к семейству переносчиков. . Это позволило построить структуру категоризации третичной структуры РНК. Теперь стало возможным предположить сохранение мотивов, складок и различных локальных стабилизирующих взаимодействий. Для более раннего обзора этих структур и их значений см. «Складки РНК: выводы из недавних кристаллических структур » Дудны и Ферре-Д'Амаре. [37]
В дополнение к достижениям в определении глобальной структуры с помощью кристаллографии, в начале 1990-х годов также было внедрено ЯМР как мощный метод в структурной биологии РНК. Совпадая с крупномасштабными структурами рибозимов, решаемыми кристаллографически, с помощью ЯМР был решен ряд структур малых РНК и РНК, образующих комплексы с лекарствами и пептидами. [38] Кроме того, ЯМР теперь использовался для исследования и дополнения кристаллических структур, примером чего является определение изолированной структуры мотива тетрапетлевого рецептора, опубликованное в 1997 году. [39] Подобные исследования позволили более точно охарактеризовать основание взаимодействия спаривания и укладки оснований, которые стабилизировали глобальные складки больших молекул РНК. Важность понимания мотивов третичной структуры РНК была пророчески хорошо описана Мишелем и Костой в их публикации, посвященной мотиву тетрапетли : «...не должно вызывать удивления, если самосворачивающиеся молекулы РНК будут интенсивно использовать только относительно небольшой набор третичных мотивов. Идентификация этих мотивов очень поможет моделированию предприятий, которое будет оставаться важным до тех пор, пока кристаллизация больших РНК остается сложной задачей». [40]
Возрождение структурной биологии РНК в середине 1990-х годов вызвало настоящий взрыв в области структурных исследований нуклеиновых кислот. С момента публикации структур «головка-молот» и P 4-6 в эту область было внесено множество крупных вкладов. Некоторые из наиболее примечательных примеров включают структуры интронов группы I и группы II [41] и рибосому , раскрытую Ненадом Баном и его коллегами в лаборатории Томаса Стейтца . [42] Первые три структуры были получены с использованием транскрипции in vitro , и тот факт, что ЯМР сыграл роль в исследовании частичных компонентов всех четырех структур, свидетельствует о незаменимости обоих методов для исследования РНК. Совсем недавно Нобелевская премия по химии 2009 года была присуждена Аде Йонат , Венкатраману Рамакришнану и Томасу Стейтцу за их структурные работы над рибосомой, продемонстрировавшие выдающуюся роль, которую структурная биология РНК сыграла в современной молекулярной биологии.
Белки были признаны отдельным классом биологических молекул в восемнадцатом веке Антуаном Фуркроем и другими. Члены этого класса (называемые «альбуминоиды», Eiweisskörper или matières albuminoides ) были признаны по их способности коагулировать или флокулировать при различных обработках, таких как тепло или кислота; хорошо известные примеры в начале девятнадцатого века включали белок яичного белка , альбумин сыворотки крови , фибрин и пшеничный глютен . Сходство между приготовлением яичных белков и свертыванием молока было признано еще в древние времена; например, название «белок» для белка яичного белка было придумано Плинием Старшим от латинского albus ovi (яичный белок).
По совету Йёнса Якоба Берцелиуса голландский химик Герхардус Йоханнес Мюлдер провел элементный анализ распространенных белков животного и растительного происхождения. К всеобщему удивлению, все белки имели почти одну и ту же эмпирическую формулу , примерно C 400 H 620 N 100 O 120 с отдельными атомами серы и фосфора. Мюльдер опубликовал свои открытия в двух статьях (1837, 1838) и выдвинул гипотезу о том, что существует одно основное вещество ( Грундштофф ) белков и что оно синтезируется растениями и усваивается из них животными в процессе пищеварения. Берцелиус был одним из первых сторонников этой теории и предложил название «белок» для этого вещества в письме от 10 июля 1838 г.
Название «белок», которое он предложил для органического оксида фибрина и альбумина , я хотел получить от [ греческого слова] πρωτειος, потому что он, по-видимому, является основным или основным веществом питания животных.
Малдер идентифицировал продукты деградации белка, такие как аминокислота лейцин , для которой он нашел (почти правильную) молекулярную массу 131 Да .
Минимальная молекулярная масса, предложенная анализами Малдера, составляла примерно 9 кДа , что в сотни раз больше, чем у других изучаемых молекул. Следовательно, химическая структура белков (их первичная структура ) была активной областью исследований до 1949 года, когда Фред Сэнгер секвенировал инсулин . (Правильная) теория о том, что белки представляют собой линейные полимеры аминокислот , связанных пептидными связями, была независимо и одновременно предложена Францем Хофмейстером и Эмилем Фишером на той же конференции в 1902 году. Однако некоторые ученые скептически относились к тому, что такие длинные макромолекулы могут быть стабильными в растворе. . В результате были предложены многочисленные альтернативные теории первичной структуры белков , например, коллоидная гипотеза о том, что белки представляют собой совокупности малых молекул, циклоловая гипотеза Дороти Ринч , дикетопиперазиновая гипотеза Эмиля Абдерхалдена и пиррол/пиперидиновая гипотеза Троэнсгарда (1942). . Большинству этих теорий было трудно объяснить тот факт, что в результате переваривания белков образуются пептиды и аминокислоты . Наконец, Теодор Сведберг с помощью аналитического ультрацентрифугирования показал, что белки представляют собой макромолекулы четко определенного состава (а не коллоидные смеси) . Возможность того, что некоторые белки представляют собой нековалентные ассоциации таких макромолекул, была показана Гилбертом Смитсоном Адэром (путем измерения осмотического давления гемоглобина ), а затем Фредериком М. Ричардсом в его исследованиях рибонуклеазы S. Масс-спектрометрия белков уже давно является полезным методом выявления посттрансляционных модификаций , а в последнее время и для исследования структуры белка.
Большинство белков трудно очистить в количествах, превышающих миллиграммы, даже используя самые современные методы. Поэтому ранние исследования были сосредоточены на белках, которые можно было очистить в больших количествах, например, белках крови , яичном белке , различных токсинах и пищеварительных/метаболических ферментах, полученных на скотобойнях . Многие методы очистки белков были разработаны во время Второй мировой войны в рамках проекта под руководством Эдвина Джозефа Кона по очистке белков крови, чтобы помочь солдатам выжить. В конце 1950-х годов компания Armor Hot Dog Co. очистила 1 кг (= один миллион миллиграммов) чистой бычьей панкреатической рибонуклеазы А и предоставила ее по низкой цене ученым всего мира. [43] Этот щедрый поступок сделал РНКазу А основным белком для фундаментальных исследований на следующие несколько десятилетий, что привело к получению нескольких Нобелевских премий.
Изучение сворачивания белка началось в 1910 году со знаменитой статьи Харриетт Чик и Си Джей Мартина , в которой они показали, что флокуляция белка состоит из двух различных процессов: осаждению белка из раствора предшествует другой процесс, называемый денатурацией. , при котором белок стал гораздо менее растворимым, потерял ферментативную активность и стал более химически активным. В середине 1920-х годов Тим Энсон и Альфред Мирски предположили, что денатурация является обратимым процессом. Это правильная гипотеза, которую некоторые ученые первоначально высмеивали как «разваривание яйца». Энсон также предположил, что денатурация представляет собой процесс с двумя состояниями («все или ничего»), в котором один фундаментальный молекулярный переход приводит к резким изменениям растворимости, ферментативной активности и химической реакционной способности; он далее отметил, что изменения свободной энергии при денатурации были намного меньшими, чем те, которые обычно происходят в химических реакциях. В 1929 году Сянь Ву выдвинул гипотезу, что денатурация — это разворачивание белка, чисто конформационное изменение, которое приводит к воздействию растворителя на боковые цепи аминокислот. Согласно этой (правильной) гипотезе, воздействие растворителя на алифатические и реактивные боковые цепи делало белок менее растворимым и более реакционноспособным, тогда как потеря специфической конформации приводила к потере ферментативной активности. Гипотеза Ву, хотя и считалась правдоподобной, не была сразу принята, поскольку о структуре белка и его ферментологии было известно так мало, а другие факторы могли объяснить изменения растворимости, ферментативной активности и химической реактивности. В начале 1960-х годов Крис Анфинсен показал, что сворачивание рибонуклеазы А было полностью обратимым и не требовало никаких внешних кофакторов, подтвердив «термодинамическую гипотезу» сворачивания белка о том, что свернутое состояние представляет собой глобальный минимум свободной энергии белка.
За гипотезой сворачивания белка последовали исследования физических взаимодействий, которые стабилизируют свернутые белковые структуры. Решающая роль гидрофобных взаимодействий была выдвинута Дороти Ринч и Ирвингом Ленгмюром как механизм, который может стабилизировать ее циклольные структуры. Хотя эта (правильная) гипотеза была поддержана Дж. Д. Берналом и другими, она была отвергнута вместе с гипотезой циклола, которая была опровергнута в 1930-х годах Лайнусом Полингом (среди других). Вместо этого Полинг отстаивал идею о том, что структура белка стабилизируется главным образом за счет водородных связей , идею, первоначально выдвинутую Уильямом Эстбери (1933). Примечательно, что неверная теория Полинга о Н-связях привела к созданию у него правильных моделей элементов вторичной структуры белков, альфа-спирали и бета-листа . Гидрофобное взаимодействие было восстановлено на должном уровне благодаря знаменитой статье Вальтера Каузмана о денатурации, опубликованной в 1959 году и частично основанной на работе Кая Линдерстрема-Ланга . Ионная природа белков была продемонстрирована Бьеррумом, Вебером и Арне Тизелиусом , но Линдерстрем-Ланг показал, что заряды обычно доступны растворителю и не связаны друг с другом (1949).
Вторичная и третичная структура глобулярных белков с низким разрешением первоначально исследовалась гидродинамическими методами, такими как аналитическое ультрацентрифугирование и двойное лучепреломление в потоке . Спектроскопические методы исследования структуры белка (такие как круговой дихроизм , флуоресценция, поглощение в ближнем ультрафиолетовом и инфракрасном диапазоне) были разработаны в 1950-х годах. Первые структуры белков с атомным разрешением были решены с помощью рентгеновской кристаллографии в 1960-х годах и с помощью ЯМР в 1980-х годах. По состоянию на 2019 год в Банке данных белков содержится более 150 000 структур белков с атомным разрешением. В последнее время криоэлектронная микроскопия крупных макромолекулярных ансамблей достигла атомного разрешения, а компьютерное предсказание структуры белка небольших белковых доменов приближается к атомному разрешению. [обновлять]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )