Нейронный или мозговой органоид описывает искусственно выращенную in vitro ткань , напоминающую части человеческого мозга . Нейронные органоиды создаются путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в трехмерной культуре, которая может поддерживаться в течение многих лет. [1] [2] Мозг представляет собой чрезвычайно сложную систему гетерогенных тканей и состоит из разнообразного множества нейронов и глиальных клеток . Эта сложность сделала изучение мозга и понимание того, как он работает, сложной задачей в нейронауке, особенно когда речь идет о нейроразвивающихся и нейродегенеративных заболеваниях. Целью создания неврологической модели in vitro является изучение этих заболеваний в более определенных условиях. Эта трехмерная модель свободна от многих потенциальных ограничений in vivo . Различная физиология между человеческими и другими моделями млекопитающих ограничивает область исследований животных при неврологических расстройствах. Нейронные органоиды содержат несколько типов нервных клеток и имеют анатомические особенности, которые повторяют области нервной системы. [3] Некоторые нейральные органоиды наиболее похожи на нейроны коры головного мозга . В некоторых случаях сетчатка , спинной мозг , таламус и гиппокамп . [1] Другие нервные органоиды неуправляемы и содержат разнообразие нервных и не-нервных клеток. Стволовые клетки имеют потенциал для развития во многих различных типах тканей, и их судьба зависит от многих факторов. Ниже приведено изображение, показывающее некоторые химические факторы, которые могут привести к дифференциации стволовых клеток в различные нервные ткани; более подробная таблица создания специфической органоидной идентичности была опубликована. [3] Аналогичные методы используются на стволовых клетках, используемых для выращивания церебральных органоидов. [3]
Использование человеческих плюрипотентных стволовых клеток для создания in vitro нейронных органоидов позволяет исследователям анализировать текущие механизмы развития человеческой нервной ткани, а также изучать корни неврологических заболеваний человека. Нейронные органоиды являются исследовательским инструментом, используемым для понимания того, как работает патология заболеваний. Эти органоиды могут использоваться в экспериментах, для которых текущие методы in vitro слишком упрощены, в то же время они более применимы к людям, чем модели грызунов или других млекопитающих. Исторически основные прорывы в работе мозга были результатом изучения травм или расстройств в работе человеческого мозга. Модель человеческого мозга in vitro позволяет нам перейти на следующую волну в нашем понимании нервной системы человека. [1]
Эмбриоидное тело , выращенное из плюрипотентных стволовых клеток , используется для создания органоида . Эмбриоидные тела состоят из трех слоев: энтодермы , мезодермы и эктодермы , которые потенциально могут дифференцироваться в различные типы тканей.
Церебральный органоид может быть сформирован путем индуцирования дифференциации клеток эктодермы в церебральный органоид. [4] Общую процедуру можно разбить на 5 этапов. [1] [5] Сначала культивируются человеческие плюрипотентные стволовые клетки. Затем их культивируют в эмбриональное тело . Затем культура клеток индуцируется для формирования нейроэктодермы . Затем нейроэктодерма выращивается в капле матригеля . Матригель обеспечивает питательными веществами, и нейроэктодерма начинает пролиферировать и расти. Репликация определенных областей мозга в аналогах церебрального органоида достигается путем добавления внеклеточных сигналов в среду органоида на разных стадиях развития; было обнаружено, что эти сигналы создают изменения в моделях дифференциации клеток, что приводит к повторению желаемой области мозга. [3] Ингибирование SMAD может использоваться в обычных процессах культивирования церебральных органоидов для генерации микроглии в церебральных органоидах. [6] Отсутствие сосудистой сети ограничивает размер органоида, который может вырасти. Это было основным ограничением в разработке органоидов. Использование вращающегося биореактора может улучшить доступность питательных веществ для клеток внутри органоида для улучшения развития органоида. [7] Вращающиеся биореакторы все чаще используются в клеточных культурах и приложениях для роста тканей. Реактор способен обеспечить более быстрое время удвоения клеток , увеличенное расширение клеток и увеличенные компоненты внеклеточного матрикса по сравнению со статически культивируемыми клетками. [8]
Было показано, что церебральные органоиды, выращенные с использованием метода 3D-культивирования в вращающемся биореакторе, дифференцируются в различные типы нервной ткани, такие как зрительный бокал, гиппокамп, вентральные части телеэнцефалона и дорсальная кора. [9] Кроме того, было показано, что органоиды человеческого мозга могут внутренне развивать интегрированные светочувствительные зрительные бокалы. [10]
Нейральные стволовые/прогениторные клетки уникальны, поскольку они способны к самообновлению и являются мультипотентными. Это означает, что они могут генерировать нейроны и глиальные клетки, которые являются двумя основными компонентами нервной системы. Судьба этих клеток контролируется несколькими факторами, которые влияют на процесс дифференциации. Пространственное расположение и временные атрибуты нейральных прогениторных клеток могут влиять на то, образуют ли клетки нейроны или глиальные клетки. Дальнейшая дифференциация затем контролируется внеклеточными условиями и клеточной сигнализацией. [11] Точные условия и стимулы, необходимые для дифференциации нейральных прогениторных клеток в определенные нервные ткани, такие как ткань гиппокампа, зрительный нерв, кора головного мозга и т. д., неизвестны. Считается, что церебральные органоиды можно использовать для изучения механизмов развития этих процессов. [7]
Чтобы проверить, дифференцируются ли нейральные клетки-предшественники и стволовые клетки в определенные нервные ткани, можно протестировать несколько генных маркеров. Два маркера, которые присутствуют на плюрипотентных стадиях, — это OCT4 и NANOG . Эти два маркера уменьшаются в ходе развития органоида. Нейронные маркеры идентичности, которые отмечают успешную нейронную индукцию, SOX1 и PAX6 , повышаются во время развития органоида. Эти изменения в экспрессии подтверждают аргумент в пользу самоуправляемой дифференциации церебральных органоидов. [1] Также можно протестировать маркеры переднего и заднего мозга. Маркеры переднего мозга FOXG1 и SIX3 высоко экспрессируются на протяжении всего развития органоида. Однако маркеры заднего мозга EGR2 и ISL1 показывают раннее присутствие, но снижение на более поздних стадиях. Этот дисбаланс в сторону развития переднего мозга аналогичен расширению ткани переднего мозга в процессе развития человеческого мозга. [1] Чтобы проверить, развиваются ли органоиды еще дальше в региональную спецификацию, были протестированы генные маркеры для коры головного мозга и затылочной доли . Многие регионы, имеющие маркер переднего мозга FOXG1 , обозначающий их как регионы с морфологией коры головного мозга, также были положительными для маркера EMX1, который указывает на дорсальную корковую идентичность. Эти конкретные регионы могут быть еще более подробно определены маркерами AUTS2 , TSHZ2 и LMO4, причем первый представляет кору головного мозга, а два последующих представляют затылочную долю. [1] Генетические маркеры для гиппокампа, вентральной части переднего мозга и сосудистого сплетения также присутствуют в церебральных органоидах, однако общие структуры этих регионов еще не сформированы.
Органоиды головного мозга также обладают функциональными нейронами коры головного мозга. Эти нейроны должны формироваться на радиально организованной корковой пластинке. Маркер TBR1 присутствует в препластине, предшественнике корковой пластинки, и присутствует вместе с MAP2 , нейрональным маркером, в 30-дневных органоидах головного мозга. Эти маркеры указывают на базальный нейронный слой, похожий на препластину. Эти клетки также апикально примыкают к нейтральной зоне и являются рилин + положительными, что указывает на присутствие клеток Кахаля-Ретциуса. Клетки Кахаля-Ретциуса важны для формирования архитектуры корковой пластинки. [7] Корковая пластинка обычно формируется изнутри наружу, так что нейроны, рожденные позже, мигрируют в верхние поверхностные слои. Эта организация также присутствует в органоидах головного мозга на основе тестирования генетических маркеров. Нейроны, которые рождаются рано, имеют маркер CTIP2 и расположены рядом с клетками препластины, демонстрирующими TBR1. Поздние нейроны с маркерами SATB2 и BRN2 расположены в поверхностном слое, дальше от препластины, чем ранние нейроны, что предполагает формирование слоя кортикальной пластинки. Кроме того, после 75 дней формирования церебральные органоиды показывают рудиментарную краевую зону, бедную клетками область. Формирование слоистой кортикальной пластинки является очень базовым в церебральных органоидах и предполагает, что органоиду не хватает сигналов и факторов, чтобы вызвать формирование организации слоев II-VI. [1] Однако церебральные органоидные нейроны могут образовывать аксоны, как показано окрашиванием GFP . Было показано, что аксоны, маркированные GFP, имеют сложное ветвление и образование конуса роста. Кроме того, визуализация с использованием кальциевого красителя показала, что церебральные органоиды имеют колебания Ca 2+ и спонтанные выбросы кальция в отдельных клетках. Сигнализация кальция может быть усилена с помощью глутамата и ингибирована с помощью тетродотоксина . [1]
В DishBrain выращенные клетки человеческого мозга были интегрированы в цифровые системы для игры в симуляцию Pong с помощью электрофизиологической стимуляции и записи. Клетки «показали значительно улучшенную производительность в Pong », когда были воплощены в виртуальном игровом мире. [12] [13] [14]
Не до конца понятно, как отдельные локализованные ткани, образованные стволовыми клетками, способны координироваться с окружающими тканями, чтобы развиться в целый орган. [15] Однако было показано, что большая часть дифференцировки тканей требует взаимодействия с окружающими тканями и зависит от факторов диффузной индукции, которые либо подавляют, либо стимулируют различную дифференцировку и физическую локализацию. [15] Дифференциация церебральных органоидов несколько локализована. Ранее упомянутые маркеры для переднего и заднего мозга физически локализованы, появляясь в кластерах. Это говорит о том, что локальные стимулы высвобождаются, как только одна или несколько клеток дифференцируются в определенный тип, а не случайным образом по всей ткани. Маркеры для подспецифичности корковых долей, префронтальной коры и затылочной доли также физически локализованы. Однако гиппокамп и вентральные клетки переднего мозга физически не локализованы и случайным образом расположены по церебральному органоиду. [1] У церебральных органоидов отсутствуют кровеносные сосуды, и они ограничены в размере поглощением питательных веществ в самых внутренних клетках. Вращающиеся биореакторы и передовые методы создания 3D-каркасов способны увеличивать размер органоидов, хотя интеграция систем доставки питательных веществ in vitro, вероятно, станет толчком к следующему крупному скачку в развитии церебральных органоидов. [16]
Церебральные органоиды имеют потенциал функционировать в качестве модели, с помощью которой можно изучать заболевания и экспрессию генов. [17] Однако необходимы диагностические инструменты для оценки ткани церебральных органоидов и создания органоидов, моделирующих рассматриваемое заболевание или состояние развития. [18] Транскриптомный анализ использовался в качестве анализа для изучения патологии церебральных органоидов, полученных от отдельных пациентов. [19] Кроме того, анализы TUNEL использовались в исследованиях в качестве оценочного маркера апоптоза в церебральных органоидах. [20] Другие анализы, используемые для анализа церебральных органоидов, включают следующее:
Церебральные органоиды могут быть использованы для изучения экспрессии генов посредством генетических модификаций. [17] Степень, в которой эти генетические модификации присутствуют во всем органоиде, зависит от того, на какой стадии развития находится церебральный органоид, когда производятся эти генетические модификации; чем раньше производятся эти модификации, например, когда церебральный органоид находится на стадии одной клетки, тем более вероятно, что эти модификации затронут большую часть клеток в церебральном органоиде. [17] Степень, в которой эти генетические модификации присутствуют в церебральном органоиде, также зависит от процесса, с помощью которого производятся эти генетические модификации. Если генетическая информация вводится в геном одной клетки церебрального органоида с помощью машины, то генетическая модификация останется присутствующей в клетках, полученных в результате репликации. [17] Crispr/Cas 9 — это метод, с помощью которого можно производить эту долговременную генетическую модификацию. [17] Система, включающая использование транспозонов, также была предложена в качестве средства для создания долговременных генетических модификаций; Однако степень, в которой транспозоны могут взаимодействовать с клеточным геномом, может различаться от клетки к клетке, что может привести к различной экспрессивности между клетками церебральных органоидов. [17] Однако, если генетическая модификация осуществляется посредством вставки «генетического груза» (например, с помощью аденоассоциированного вируса / методов электропорации ), то было обнаружено, что генетическая модификация становится менее заметной с каждым раундом деления клеток в церебральных органоидах. [17]
Использование вычислительных методов было призвано помочь улучшить процесс культивирования церебральных органоидов; разработка вычислительных методов также была призвана обеспечить необходимые подробные визуализации различных компонентов церебрального органоида (таких как клеточные связи), которые текущие методы не в состоянии обеспечить. [18] Программирование, предназначенное для моделирования подробной морфологии церебральных органоидов, пока не существует. [18]
Существует множество потенциальных применений для использования церебральных органоидов, таких как потенциал судьбы клеток , клеточная заместительная терапия и специфические для типа клеток геномные анализы. [16] Церебральные органоиды также предоставляют уникальную возможность узнать время развития нервных тканей и могут использоваться в качестве инструмента для изучения различий между видами. [16] Другие потенциальные применения церебральных органоидов включают: [16]
Морфогенез тканей в отношении церебральных органоидов охватывает то, как формируются нервные органы у позвоночных . Церебральные органоиды могут служить инструментами in vitro для изучения формирования, модуляции его и дальнейшего понимания механизмов, контролирующих его. [16]
Органоиды мозга могут помочь в изучении миграции клеток . Нейронные глиальные клетки охватывают широкий спектр нервных клеток, некоторые из которых движутся вокруг нейронов. Факторы, которые управляют их движениями, а также нейронами в целом, можно изучать с помощью органоидов мозга. [4]
Клональное отслеживание линии является частью картирования судьбы , где линия дифференцированных тканей отслеживается до плюрипотентных предшественников. Высвобождаемые локальные стимулы и механизм дифференциации могут быть изучены с использованием церебральных органоидов в качестве модели. [16] Генетические модификации в церебральных органоидах могут служить средством для выполнения отслеживания линии. [17]
Церебральные органоиды могут быть использованы для выращивания определенных областей мозга и трансплантации их в области нейродегенерации в качестве терапевтического лечения. [21] [22] Они могут сливаться с сосудистой системой хозяина и быть иммунологически молчаливыми. [23] В некоторых случаях геномы этих церебральных органоидов сначала должны быть отредактированы. [19] Недавние исследования смогли добиться успешной трансплантации и интеграции церебральных органоидов в мозг мыши; развитие клеточной дифференциации и васкуляризации также наблюдалось после трансплантации. [24] Церебральные органоиды могут служить основой для трансплантации и восстановления в человеческом мозге из-за сходства в структуре. [24]
Органоиды мозга могут использоваться в качестве простых моделей сложных мозговых тканей для изучения эффектов лекарств и их скрининга на предмет первоначальной безопасности и эффективности. Тестирование новых лекарств для неврологических заболеваний также может быть результатом этого метода применения методов скрининга лекарств с высокой пропускной способностью к органоидам мозга. [19]
Органоиды могут быть использованы для изучения развития мозга , например, для выявления и исследования генетических переключателей, которые оказывают на него значительное влияние. [25] [26] [27] Это может быть использовано для профилактики и лечения определенных заболеваний [28] (см. ниже), а также для других целей, таких как понимание генетических факторов недавней эволюции мозга (или происхождения людей и эволюционных отличий от других обезьян), [29] [30] [31] улучшение человека и повышение интеллекта , выявление пагубных воздействий экспозомов (и защита от них) или улучшение продолжительности здоровой работы мозга .
Органоиды могут быть использованы для изучения важнейших ранних стадий развития мозга, тестирования лекарств и, поскольку они могут быть созданы из живых клеток, изучения отдельных пациентов. [32] Кроме того, разработка васкуляризированных церебральных органоидов может быть использована для исследования терапии инсульта в будущем. [33]
Было показано, что вирус Зика оказывает тератогенное действие, вызывая дефекты в неврологическом развитии плода. Церебральные органоиды использовались в исследованиях для того, чтобы понять процесс, посредством которого вирус Зика поражает мозг плода и, в некоторых случаях, вызывает микроцефалию. [19] [20] Было обнаружено, что церебральные органоиды, инфицированные вирусом Зика, меньше по размеру, чем их неинфицированные аналоги, что отражает микроцефалию плода. [19] [20] Повышенный апоптоз был также обнаружен в церебральных органоидах, инфицированных вирусом Зика. [34] Другое исследование показало, что популяции нейральных клеток-предшественников (NPC) были значительно сокращены в этих образцах. Двумя методами, с помощью которых популяции NPC были сокращены, были увеличение гибели клеток и снижение пролиферации клеток. В этих инфицированных органоидах была выявлена повышенная регуляция рецептора TLR3 . Было показано, что ингибирование этого рецептора TLR3 частично останавливает некоторые эффекты, вызванные вирусом Зика. [35] Кроме того, было обнаружено, что размер просвета увеличился в органоидах, инфицированных вирусом Зика. [19] [20] Результаты, полученные при изучении церебральных органоидов, инфицированных вирусом Зика на разных стадиях созревания, позволяют предположить, что раннее воздействие на развивающийся плод может привести к большей вероятности неврологических врожденных дефектов, связанных с вирусом Зика. [20]
Также было показано, что кокаин оказывает тератогенное воздействие на развитие плода. Церебральные органоиды использовались для изучения того, какие изоформы ферментов необходимы для неврологических дефектов плода, вызванных употреблением кокаина во время беременности. [19] Одним из этих ферментов была определена изоформа цитохрома P450 CYP3A5 . [19]
В одном случае церебральный органоид, выращенный у пациента с микроцефалией, продемонстрировал связанные симптомы и показал, что, по-видимому, причиной является чрезмерно быстрое развитие, за которым следует более медленный рост мозга. Микроэнцефалия — это состояние развития, при котором мозг остается недостаточно большим, что приводит к недостаточному размеру головы и слабости. Микроцефалия не подходит для мышиных моделей, которые не воспроизводят это состояние. [32] Считается, что первичная форма заболевания вызвана гомозиготной мутацией в гене микроцефалина . Заболевание трудно воспроизвести на мышиных моделях, поскольку у мышей отсутствуют стадии развития для увеличенной коры головного мозга , которые есть у людей. Естественно, заболевание, которое влияет на это развитие, было бы невозможно продемонстрировать на модели, у которой его изначально нет. [36] Чтобы использовать церебральные органоиды для моделирования микроцефалии человека, одна группа исследователей взяла фибробласты кожи пациента и перепрограммировала их с помощью четырех хорошо известных факторов перепрограммирования. К ним относятся OCT4 , SOX2 , MYC и KLF4 . Перепрограммированный образец удалось клонировать в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Клетки были культивированы в церебральный органоид в соответствии с процессом, описанным в разделе создания церебрального органоида ниже. Полученный органоид имел уменьшенное количество нейронных клеток-предшественников и меньшие ткани. Кроме того, ткани, полученные от пациента, показали меньшее количество и меньшую частоту нейроэпителиальных тканей, состоящих из предшественников, уменьшенное количество радиальных глиальных стволовых клеток и увеличенное количество нейронов. Эти результаты предполагают, что основной механизм микроцефалии вызван клетками, преждевременно дифференцирующимися в нейроны, что оставляет дефицит радиальных глиальных клеток. [1]
Патология болезни Альцгеймера также была смоделирована с помощью церебральных органоидов. [37] Плюрипотентные стволовые клетки пораженных людей использовались для создания мозговых органоидов, а затем сравнивались с контрольными моделями, синтезированными от здоровых людей. Было обнаружено, что в пораженных моделях наблюдались структуры, похожие на структуры бляшек, вызванных амилоидными бета-белками и нейрофибриллярными клубками , которые вызывают симптомы заболевания. [38] Предыдущие попытки смоделировать это так точно оказались безуспешными, поскольку препараты, разрабатываемые на основе эффективности в доклинических мышиных моделях, не демонстрировали никакого эффекта в испытаниях на людях. [39]
Церебральные органоиды также могут быть использованы для изучения расстройств аутистического спектра. [40] В одном исследовании церебральные органоиды были культивированы из клеток, полученных от пациентов с макроцефалией РАС. [40] Было обнаружено, что эти церебральные органоиды отражают характеристики, типичные для фенотипа макроцефалии, связанного с РАС, обнаруженного у пациентов. [40] Культивируя церебральные органоиды от пациентов с РАС с макроцефалией, можно было установить связи между определенными мутациями генов и фенотипической экспрессией. [40] Аутизм также изучался путем сравнения здоровых и пораженных синтезированных мозговых органоидов. [41] Наблюдение за двумя моделями показало сверхэкспрессию фактора транскрипции FOXG1 , который производил большее количество ГАМКергических ингибирующих нейронов в пораженных моделях. Значимость этого использования мозговых органоидов заключается в том, что оно внесло большую поддержку в гипотезу о дисбалансе возбуждающих/ингибирующих факторов [42], которая, если ее истинность будет доказана, могла бы помочь определить мишени для лекарств, чтобы можно было лечить это состояние.
Область эпигенетики и то, как метилирование ДНК может влиять на развитие РАС, также представляли интерес в последние годы. Традиционный метод изучения посмертных нейронных образцов людей с РАС создает много проблем, поэтому церебральные органоиды были предложены в качестве альтернативного метода изучения потенциального влияния, которое эпигенетические механизмы могут оказывать на развитие аутизма. Такое использование модели церебрального органоида для изучения РАС и эпигенетических паттернов может дать представление о временных рамках эпигенетического развития. Однако важно отметить, что условия, в которых культивируются церебральные органоиды, могут влиять на экспрессию генов и, следовательно, влиять на наблюдения, сделанные с использованием этой модели. Кроме того, существует обеспокоенность по поводу изменчивости церебральных органоидов, культивируемых из одного и того же образца. [43] Также необходимы дальнейшие исследования степени и точности, с которой церебральные органоиды воспроизводят эпигенетические паттерны, обнаруженные в первичных образцах. [43]
Преждевременное гипоксическое повреждение остается сложным для изучения из-за ограниченной доступности тканей человеческого плода мозга и неадекватных животных моделей для изучения кортикогенеза человека. Церебральный органоид может быть использован для моделирования пренатальной патофизиологии и для сравнения восприимчивости различных типов нервных клеток к гипоксии во время кортикогенеза. Промежуточные предшественники, по-видимому, особенно страдают из-за развернутого пути реакции белка. [44] Также было замечено, что гипоксия приводит к апоптозу в церебральных органоидах, причем наружная радиальная глия и нейробласты/незрелые нейроны особенно страдают. [45]
Традиционные способы изучения глиобластом имеют ограничения. Одним из примеров таких ограничений может быть ограниченная доступность образцов. Из-за этих проблем, которые возникают при использовании более традиционного подхода, церебральные органоиды использовались в качестве альтернативного средства для моделирования развития рака мозга. В одном исследовании церебральные органоиды были смоделированы для отображения опухолеподобных качеств с использованием CRISPR CAS-9. В этих генетически измененных моделях наблюдалось повышенное деление клеток. Церебральные органоиды также использовались в моделях мышей для изучения опухолегенеза и инвазивности. В то же время на рост рака мозга влияют факторы окружающей среды, которые пока не воспроизводятся в моделях церебральных органоидов. Было показано, что церебральные органоиды дают представление о нарушении регуляции генов, ответственных за развитие опухолей. [34]
Рассеянный склероз — это аутоиммунное воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему. Экологические и генетические факторы способствуют развитию рассеянного склероза, однако этиология этого состояния неизвестна. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от здоровых людей, а также от пациентов с рассеянным склерозом были выращены в церебральные органоиды, создав инновационную человеческую модель этого заболевания. [46]
Церебральные органоиды предпочтительнее, чем их аналоги в 3D-культуре клеток, потому что они могут лучше отражать структуру человеческого мозга, и потому что, в определенной степени, они могут отражать развитие неокортекса плода в течение длительного периода времени. Хотя церебральные органоиды имеют большой потенциал, их культивирование и развитие сопряжены с ограничениями и областями для улучшения. [34] Например, создание одного церебрального органоида занимает несколько месяцев, а методы, используемые для их анализа, также требуют много времени. [24] Кроме того, церебральные органоиды не имеют структур, типичных для человеческого мозга, таких как гематоэнцефалический барьер. [34] Это ограничивает типы заболеваний, которые можно изучать. Другие ограничения включают:
До недавнего времени считалось, что центральная часть органоидов некротизируется из -за того, что кислород и питательные вещества не могут достичь этой самой внутренней области. [33] [18] Это накладывает ограничения на физиологическую применимость церебральных органоидов. [18] Из-за этого недостатка кислорода и питательных веществ нейронные клетки-предшественники ограничены в своем росте. [47] Однако недавние открытия показывают, что в процессе культивирования церебрального органоида некротического центра можно избежать, используя жидкостные устройства для увеличения воздействия среды на органоид. [18]
Было обнаружено, что структура церебральных органоидов в разных культурах является изменчивой; процедура стандартизации для обеспечения единообразия еще не стала общепринятой практикой. [33] Будущие шаги по пересмотру производства церебральных органоидов будут включать создание методов для обеспечения стандартизации генерации церебральных органоидов. [33] Один из таких предложенных шагов включает регулирование состава и толщины геля, в котором культивируются церебральные органоиды; это может способствовать большей надежности в производстве церебральных органоидов. [18] Кроме того, изменчивость в генерации церебральных органоидов вводится из-за различий в используемых стволовых клетках. [19] Эти различия могут возникать из-за различных методов производства или различий хозяина. [19] Повышенный метаболический стресс также был обнаружен внутри органоидов. Было обнаружено, что этот метаболический стресс ограничивает специфичность органоидов. [6] Будущие шаги по оптимизации культивирования органоидов включают анализ более одного образца за раз. [24]
На данный момент развитие зрелых синапсов в церебральных органоидах ограничено из-за используемых сред. [33] Кроме того, хотя было показано, что некоторые электрофизиологические свойства развиваются в церебральных органоидах, было показано, что культивирование отдельных и различных областей органоидов ограничивает созревание этих электрофизиологических свойств. Моделирование электрофизиологических нейроразвивающих процессов, типичных для развития на более поздней стадии нейроразвития, таких как синаптогенез , пока не предлагается в моделях церебральных органоидов. [6] Поскольку церебральные органоиды отражают то, что происходит во время нейроразвития плода, возникли опасения по поводу того, как в них проявляются заболевания с поздним началом. Будущие усовершенствования включают разработку способа воспроизведения нейродегенеративных заболеваний в церебральных органоидах. [24]
Возникли этические опасения в связи с использованием церебральных органоидов в качестве модели заболевания из-за потенциальной возможности испытывать такие ощущения, как боль, или обладать способностью развивать сознание . [ 48] В настоящее время это маловероятно, учитывая простоту синтезированных моделей по сравнению со сложностью человеческого мозга; однако было показано, что модели реагируют на световую стимуляцию, [49] поэтому существующие модели имеют некоторую возможность реагировать на некоторые стимулы.
Предпринимаются шаги по разрешению серой зоны, такие как симпозиум 2018 года в Оксфордском университете, где эксперты в этой области, философы и юристы встретились, чтобы попытаться прояснить этические проблемы, связанные с новой технологией. [50] Аналогичным образом, такие проекты, как Brainstorm из Университета Кейс Вестерн, направлены на наблюдение за прогрессом в этой области путем мониторинга лабораторий, работающих с мозговыми органоидами, чтобы попытаться начать «создание философской основы», на которой могли бы строиться будущие руководящие принципы и законодательство. [51]
Кроме того, «гуманизация» животных моделей была поднята как тема для беспокойства при трансплантации органоидов, полученных из человеческих стволовых клеток, в другие животные модели. [47] Например, потенциальные будущие проблемы этого типа были описаны, когда органоиды ткани человеческого мозга были трансплантированы крысятам , которые, по-видимому, были высокофункциональными, созревали и интегрировались с мозгом крысы. Такие модели могут быть использованы для моделирования развития человеческого мозга и, как было показано, для исследования заболеваний (и их потенциальных методов лечения), но могут быть спорными . [52] [53] [54]
Таблица 1: Протоколы для генерации органоидов мозга