Моноклональное антитело ( мАт , реже называемое моАт ) представляет собой антитело , полученное из клеточной линии , полученной путем клонирования уникальных лейкоцитов . Все последующие антитела, полученные таким образом, восходят к уникальной родительской клетке.
Моноклональные антитела могут иметь моновалентное сродство, связываясь только с одним и тем же эпитопом (частью антигена , которая распознается антителом). Напротив, поликлональные антитела связываются с несколькими эпитопами и обычно производятся несколькими различными линиями плазматических клеток, секретирующих антитела . Биспецифические моноклональные антитела также могут быть созданы путем увеличения терапевтических мишеней одного моноклонального антитела до двух эпитопов.
Можно производить моноклональные антитела, специфически связывающиеся практически с любым подходящим веществом; затем они могут служить для его обнаружения или очистки. Эта возможность стала исследовательским инструментом в биохимии , молекулярной биологии и медицине . Моноклональные антитела используются при диагностике таких заболеваний, как рак и инфекции [3] , а также терапевтически при лечении, например, рака и воспалительных заболеваний.
В начале 1900-х годов иммунолог Пауль Эрлих предложил идею Zauberkugel – « волшебной пули », задуманной как соединение, избирательно воздействующее на болезнетворный организм и способное доставлять токсин для этого организма. Это легло в основу концепции моноклональных антител и конъюгатов моноклональных лекарств. Эрлих и Эли Мечников получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1908 года за создание теоретической основы иммунологии.
К 1970-м годам были известны лимфоциты , продуцирующие одно антитело, в форме множественной миеломы – рака, поражающего В-клетки . Эти аномальные антитела или парапротеины использовались для изучения структуры антител, но получить идентичные антитела, специфичные к данному антигену , пока не удалось . [4] : 324 В 1973 году Джеррольд Швабер описал производство моноклональных антител с использованием гибридных клеток человека и мыши. [5] Эта работа по-прежнему широко цитируется среди тех, кто использует гибридомы человеческого происхождения . [6] В 1975 году Жоржу Келеру и Сезару Мильштейну удалось слить клеточные линии миеломы с В-клетками для создания гибридом, которые могли производить антитела, специфичные к известным антигенам и иммортализованные. [7] За это открытие они и Нильс Кай Йерне получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1984 году. [7]
В 1988 году Грегори Винтер и его команда впервые применили методы гуманизации моноклональных антител [8] , устранив реакции, которые многие моноклональные антитела вызывали у некоторых пациентов. К 1990-м годам исследования достигли прогресса в использовании моноклональных антител в терапевтических целях, а в 2018 году Джеймс П. Эллисон и Тасуку Хондзё получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие терапии рака путем ингибирования негативной иммунной регуляции с использованием моноклональных антител, которые предотвращают рак. тормозные связи. [9]
Переводческая работа, необходимая для реализации этих идей, принадлежит Ли Надлеру. Как поясняется в статье НИЗ: «Он был первым, кто открыл моноклональные антитела, направленные против антигенов, специфичных для В-клеток человека, и, по сути, все известные антигены, специфичные для В-клеток человека, были обнаружены в его лаборатории. трансляционный исследователь, поскольку он использовал эти моноклональные антитела для классификации человеческих В-клеточных лейкозов и лимфом, а также для создания терапевтических средств для пациентов. пациент с В-клеточной лимфомой)». [10]
Большая часть работ по производству моноклональных антител связана с производством гибридом, которое включает в себя идентификацию антигенспецифичных клеток плазмы/плазмобластов, которые продуцируют антитела, специфичные к интересующему антигену, и слияние этих клеток с клетками миеломы . [7] В-клетки кролика можно использовать для образования гибридомы кролика . [11] [12] Полиэтиленгликоль используется для слияния соседних плазматических мембран, [13] но уровень успеха низок, поэтому используется селективная среда, в которой могут расти только слитые клетки. Это возможно потому, что клетки миеломы утратили способность синтезировать гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (HGPRT) — фермент, необходимый для синтеза спасательных нуклеиновых кислот. Отсутствие HGPRT не является проблемой для этих клеток, если только не нарушается путь синтеза пуринов de novo . Воздействие на клетки аминоптерина ( аналога фолиевой кислоты , который ингибирует дигидрофолатредуктазу ) делает их неспособными использовать путь de novo и становятся полностью ауксотрофными по отношению к нуклеиновым кислотам , что требует дополнительных добавок для выживания.
Селективную культуральную среду называют средой HAT, поскольку она содержит гипоксантин , аминоптерин и тимидин . Эта среда является селективной для слитых ( гибридомных ) клеток. Неслитые клетки миеломы не могут расти, поскольку в них отсутствует HGPRT и, следовательно, они не могут реплицировать свою ДНК. Несросшиеся клетки селезенки не могут расти бесконечно из-за ограниченной продолжительности жизни. Только слитые гибридные клетки, называемые гибридомами, способны неограниченно расти в среде, поскольку партнерская клетка селезенки поставляет HGPRT, а партнер миеломы обладает свойствами, которые делают ее бессмертной (аналогично раковой клетке).
Эту смесь клеток затем разбавляют и выращивают клоны из одиночных родительских клеток в лунках для микротитрования. Антитела, секретируемые различными клонами, затем анализируются на их способность связываться с антигеном (с помощью такого теста, как ELISA или анализ на микрочипах антигенов) или иммунодот -блоттинга . Затем для будущего использования отбирается наиболее продуктивный и стабильный клон.
Гибридомы можно выращивать неограниченное время в подходящей среде для культивирования клеток. Их также можно вводить мышам (в брюшную полость , окружающую кишечник). Там они производят опухоли, выделяющие богатую антителами жидкость, называемую асцитической жидкостью.
Среду необходимо обогащать во время селекции in vitro , чтобы способствовать росту гибридомы. Этого можно достичь путем использования слоя питающих клеток фиброцитов или дополнительной среды, такой как бриклон. Можно использовать культуральные среды, кондиционированные макрофагами. Обычно предпочтительным является производство в клеточной культуре, поскольку метод асцита болезненный для животного. Там, где существуют альтернативные методы, асцит считается неэтичным . [14]
Недавно было разработано несколько технологий моноклональных антител, [15] таких как фаговый дисплей , [16] культура одиночных В-клеток, [17] амплификация одиночных клеток из различных популяций В-клеток [18] [19] [20] [21] [22] ] и технологии опроса одиночных плазматических клеток. В отличие от традиционной гибридомной технологии, новые технологии используют методы молекулярной биологии для амплификации тяжелых и легких цепей генов антител с помощью ПЦР и получения антител либо в бактериальных системах, либо в системах млекопитающих с помощью рекомбинантной технологии. Одно из преимуществ новых технологий применимо к нескольким животным, таким как кролик, лама, курица и другим обычным экспериментальным животным в лаборатории.
После получения либо образца среды культивируемых гибридом, либо образца асцитической жидкости необходимо экстрагировать желаемые антитела. Загрязнения образцов клеточных культур состоят в основном из компонентов среды, таких как факторы роста, гормоны и трансферрины . Напротив, образец in vivo , скорее всего, будет содержать антитела хозяина, протеазы , нуклеазы , нуклеиновые кислоты и вирусы . В обоих случаях могут присутствовать другие выделения гибридом, такие как цитокины . Также может быть бактериальное загрязнение и, как следствие, эндотоксины , выделяемые бактериями. В зависимости от сложности среды, необходимой для культивирования клеток, и, следовательно, от загрязнений, тот или иной метод ( in vivo или in vitro ) может оказаться предпочтительным.
Пробу сначала кондиционируют или готовят к очистке. Клетки, клеточный дебрис, липиды и свернувшийся материал сначала удаляют, как правило, центрифугированием с последующей фильтрацией через фильтр 0,45 мкм. Эти крупные частицы могут вызвать явление, называемое загрязнением мембраны, на более поздних стадиях очистки. Кроме того, концентрация продукта в образце может быть недостаточной, особенно в случаях, когда желаемое антитело продуцируется клеточной линией с низким уровнем секретации. Поэтому образец концентрируют ультрафильтрацией или диализом .
Большинство заряженных примесей обычно представляют собой анионы , такие как нуклеиновые кислоты и эндотоксины. Их можно разделить с помощью ионообменной хроматографии . [23] Либо катионообменная хроматография используется при достаточно низком pH , чтобы желаемое антитело связывалось с колонкой, в то время как анионы протекают через нее, либо анионообменная хроматография используется при достаточно высоком pH, чтобы желаемое антитело проходило через колонку, в то время как анионы связывались с это. Различные белки также можно разделить вместе с анионами на основе их изоэлектрической точки (pI). В белках изоэлектрическая точка (pI) определяется как pH, при котором белок не имеет суммарного заряда. Когда pH > pI, белок имеет суммарный отрицательный заряд, а когда pH < pI, белок имеет суммарный положительный заряд. Например, альбумин имеет pI 4,8, что значительно ниже, чем у большинства моноклональных антител, имеющих pI 6,1. Таким образом, при pH между 4,8 и 6,1 средний заряд молекул альбумина, вероятно, будет более отрицательным, тогда как молекулы моноклональных антител заряжены положительно, и, следовательно, их можно разделить. С другой стороны, трансферрин имеет pI 5,9, поэтому его нелегко отделить этим методом. Для хорошего разделения необходима разница в pI не менее 1.
Вместо этого трансферрин можно удалить с помощью эксклюзионной хроматографии . Этот метод является одним из наиболее надежных методов хроматографии. Поскольку мы имеем дело с белками, такие свойства, как заряд и сродство, не являются постоянными и меняются в зависимости от pH, поскольку молекулы протонируются и депротонируются, в то время как размер остается относительно постоянным. Тем не менее, он имеет такие недостатки, как низкое разрешение, низкая емкость и малое время элюирования .
Гораздо более быстрым одностадийным методом разделения является аффинная хроматография белков A/G . Антитело избирательно связывается с белком A/G, поэтому достигается высокий уровень чистоты (обычно >80%). Обычно суровые условия этого метода могут повредить легко повреждаемые антитела. Низкий pH может разорвать связи и удалить антитело из колонки. Помимо возможного воздействия на продукт, низкий уровень pH может привести к вытеканию белка A/G из колонки и появлению его в элюируемом образце. Доступны буферные системы для щадящего элюирования, в которых используются высокие концентрации соли, чтобы избежать воздействия на чувствительные антитела низкого pH. Стоимость также является важным фактором при использовании этого метода, поскольку иммобилизованный белок A/G является более дорогой смолой.
Для достижения максимальной чистоты за один этап можно провести аффинную очистку с использованием антигена для обеспечения специфичности антитела. В этом методе антиген, используемый для создания антитела, ковалентно присоединяется к агарозной подложке. Если антиген представляет собой пептид , его обычно синтезируют с концевым цистеином , что позволяет избирательно прикрепляться к белку-носителю, такому как KLH , во время разработки и поддерживать очистку. Затем среду, содержащую антитела, инкубируют с иммобилизованным антигеном либо в периодическом режиме, либо при пропускании антитела через колонку, где оно селективно связывается и может удерживаться, пока примеси смываются. Затем для извлечения очищенного антитела из носителя используют элюирование буфером с низким pH или более мягким буфером с высоким содержанием соли.
Гетерогенность продукта характерна для моноклональных антител и других рекомбинантных биологических продуктов и обычно вводится либо до начала экспрессии, либо после него во время производства. [ нужна цитата ]
Эти варианты обычно представляют собой агрегаты, продукты дезамидирования , варианты гликозилирования , окисленные боковые цепи аминокислот, а также присоединения аминокислот на амино- и карбоксильных концах. [24] Эти, казалось бы, незначительные структурные изменения могут повлиять на доклиническую стабильность и оптимизацию процесса, а также на терапевтическую эффективность, биодоступность и иммуногенность продукта . Общепринятый метод очистки технологических потоков моноклональных антител включает захват целевого продукта белком А , элюирование, подкисление для инактивации потенциальных вирусов млекопитающих с последующей ионной хроматографией сначала с анионными шариками , а затем с катионными шариками. [ нужна цитата ]
Вытесняющая хроматография использовалась для идентификации и характеристики этих часто невидимых вариантов в количествах, которые подходят для последующих схем доклинической оценки, таких как фармакокинетические исследования на животных. [25] [26] Знания, полученные на этапе доклинической разработки, имеют решающее значение для лучшего понимания качества продукции и обеспечивают основу для управления рисками и повышения гибкости регулирования. Недавняя инициатива Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов «Качество за счет дизайна» направлена на предоставление рекомендаций по разработке и облегчению проектирования продуктов и процессов, которые максимизируют эффективность и профиль безопасности, одновременно повышая технологичность продукта. [27]
Производство рекомбинантных моноклональных антител включает в себя технологии клонирования репертуара , CRISPR/Cas9 или технологии фагового / дрожжевого дисплея . [28] Инженерия рекомбинантных антител предполагает производство антител с использованием вирусов или дрожжей , а не мышей. Эти методы основаны на быстром клонировании сегментов гена иммуноглобулина для создания библиотек антител со слегка отличающимися аминокислотными последовательностями, из которых можно выбрать антитела с желаемой специфичностью. [29] Библиотеки фаговых антител представляют собой вариант библиотек фаговых антигенов. [30] Эти методы можно использовать для повышения специфичности, с которой антитела распознают антигены, их стабильности в различных условиях окружающей среды, их терапевтической эффективности и их обнаруживаемости в диагностических приложениях. [31] Камеры ферментации использовались для крупномасштабного производства антител.
Хотя мышиные и человеческие антитела структурно схожи, различий между ними было достаточно, чтобы вызвать иммунный ответ при введении мышиных моноклональных антител людям, что привело к их быстрому удалению из крови, а также к системным воспалительным эффектам и продукции человеческих антигенов. -мышиные антитела (НАМА).
Рекомбинантная ДНК исследуется с конца 1980-х годов с целью увеличения времени пребывания. В одном подходе, называемом «прививкой CDR», [32] ДНК мыши, кодирующая связывающую часть моноклонального антитела, объединяли с ДНК человека, продуцирующей антитела, в живых клетках. Экспрессия этой « химерной » или «гуманизированной» ДНК через культуру клеток дала частично мышиные, частично человеческие антитела. [33] [34]
С момента открытия возможности создания моноклональных антител ученые поставили перед собой цель создать полностью человеческие продукты, чтобы уменьшить побочные эффекты гуманизированных или химерных антител. Было предложено несколько успешных подходов: трансгенные мыши , [35] фаговый дисплей [16] и клонирование одиночных В-клеток. [15]
Моноклональные антитела дороже производить, чем небольшие молекулы, из-за сложных процессов и общего размера молекул, а также огромных затрат на исследования и разработки, связанные с доставкой нового химического соединения пациентам. Цены на них установлены таким образом, чтобы производители могли окупить обычно большие инвестиционные затраты, а там, где нет контроля над ценами, как, например, в США, цены могут быть выше, если они обеспечивают большую ценность. Семь исследователей из Питтсбургского университета пришли к выводу: «Годовая стоимость терапии моноклональными антителами в онкологии и гематологии примерно на 100 000 долларов выше, чем при других болезненных состояниях», сравнив их в расчете на одного пациента со стоимостью лечения сердечно-сосудистых или метаболических нарушений, иммунологии, инфекционных заболеваний, аллергия и офтальмология. [36]
Как только моноклональные антитела к данному веществу будут произведены, их можно будет использовать для обнаружения присутствия этого вещества. Белки можно обнаружить с помощью вестерн-блоттинга и иммунодот -блоттинга . В иммуногистохимии моноклональные антитела можно использовать для обнаружения антигенов в фиксированных срезах ткани, и аналогичным образом иммунофлуоресценцию можно использовать для обнаружения вещества либо в замороженных срезах ткани, либо в живых клетках.
Антитела также можно использовать для очистки целевых соединений от смесей методом иммунопреципитации .
Терапевтические моноклональные антитела действуют посредством множества механизмов, таких как блокирование функций целевых молекул, индуцирование апоптоза в клетках, экспрессирующих мишень, или путем модуляции сигнальных путей. [37] [38] [39]
Один из возможных методов лечения рака включает моноклональные антитела, которые связываются только с антигенами , специфичными для раковых клеток, и вызывают иммунный ответ против раковой клетки-мишени. Такие mAb можно модифицировать для доставки токсина , радиоизотопа , цитокина или другого активного конъюгата или для создания биспецифических антител , которые могут связываться своими Fab-областями как с целевым антигеном, так и с конъюгатом или эффекторной клеткой. Каждое интактное антитело может связываться с клеточными рецепторами или другими белками с помощью своей области Fc .
MAb, одобренные FDA для лечения рака, включают: [41]
Моноклональные антитела, используемые при аутоиммунных заболеваниях, включают инфликсимаб и адалимумаб , которые эффективны при ревматоидном артрите , болезни Крона , язвенном колите и анкилозирующем спондилите благодаря своей способности связываться и ингибировать TNF-α . [42] Базиликсимаб и даклизумаб ингибируют IL-2 на активированных Т-клетках и тем самым помогают предотвратить острое отторжение трансплантата почки. [42] Омализумаб ингибирует человеческий иммуноглобулин Е (IgE) и полезен при лечении аллергической астмы средней и тяжелой степени .
Моноклональные антитела для исследовательских целей можно найти непосредственно у поставщиков антител или с помощью специализированной поисковой системы, такой как CiteAb . Ниже приведены примеры клинически важных моноклональных антител.
В 2020 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США выдало разрешение на экстренное использование препаратов моноклональных антител бамланивимаб/этесевимаб и казиривимаб/имдевимаб, чтобы сократить количество госпитализаций, посещений отделений неотложной помощи и смертей. [44] [45] В сентябре 2021 года администрация Байдена закупила моноклональные антитела Regeneron на сумму 2,9 миллиарда долларов США по цене 2100 долларов США за дозу, чтобы ограничить дефицит. [47]
По состоянию на декабрь 2021 года тесты на нейтрализацию in vitro показали, что терапия моноклональными антителами (за исключением сотровимаба и тиксагевимаба/цилгавимаба ) вряд ли будет активна в отношении варианта Омикрон. [48]
В течение 2021–2022 годов два Кокрейновских обзора обнаружили недостаточно доказательств использования нейтрализующих моноклональных антител для лечения инфекций COVID-19. [49] [50] Обзоры относились только к людям, которые не были вакцинированы против COVID-19, и только к вариантам COVID-19, существовавшим во время исследований, а не к более новым вариантам, таким как Омикрон. [50]
В марте 2024 года пемивибарт , препарат на основе моноклональных антител, получил от FDA США разрешение на экстренное использование в качестве доконтактной профилактики для защиты некоторых лиц с умеренным и тяжелым иммунодефицитом от COVID-19. [51] [52]
Некоторые моноклональные антитела, такие как бевацизумаб и цетуксимаб , могут вызывать различные побочные эффекты. [53] Эти побочные эффекты можно разделить на распространенные и серьезные побочные эффекты. [54]
Некоторые распространенные побочные эффекты включают в себя:
Среди возможных серьезных побочных эффектов можно выделить: [55]