Аргинилглициласпарагиновая кислота ( RGD ) является наиболее распространенным пептидным мотивом, ответственным за адгезию клеток к внеклеточному матриксу (ECM), обнаруженным у видов от Drosophila до человека. Белки клеточной адгезии, называемые интегринами, распознают и связываются с этой последовательностью, которая обнаружена во многих матричных белках, включая фибронектин , фибриноген , витронектин , остеопонтин и несколько других адгезивных внеклеточных матричных белков. [1] Открытие RGD и выяснение того, как RGD связывается с интегринами, привело к разработке ряда лекарственных препаратов и диагностических средств, [2] в то время как сам пептид повсеместно используется в биоинженерии . [3] В зависимости от применения и целевого интегрина, RGD может быть химически модифицирован или заменен аналогичным пептидом, который способствует клеточной адгезии.
RGD была идентифицирована как минимальная последовательность распознавания в фибронектине, необходимая для прикрепления клеток, Руослахти и Пиршбахером в начале 1980-х годов. Для этого авторы синтезировали различные пептиды на основе предполагаемого места прикрепления клеток фибронектина. Затем они соединили эти пептиды с пластиком, покрытым белком, и протестировали каждый на предмет активности, способствующей прикреплению клеток. Было обнаружено, что только те, которые содержали последовательность RGD, усиливают прикрепление клеток. Кроме того, они показали, что пептиды, содержащие RGD, способны ингибировать прикрепление клеток к субстратам, покрытым фибронектином, тогда как пептиды, не содержащие RGD, этого не делают. [4]
Эти фундаментальные исследования также идентифицировали клеточные рецепторы, которые распознают последовательность. В этих исследованиях использовался синтетический пептид, содержащий RGD, для выделения предполагаемых рецепторов, а затем было продемонстрировано, что липосомы, содержащие изолированные белки, могут связываться с фибронектином, во многом так же, как клетки с поверхностными рецепторами. [5] [6] Обнаруженные рецепторы позже были названы интегринами. [7] [8] Мотив RGD представлен несколько по-разному в разных белках, что позволяет многим интегринам, связывающим RGD, избирательно различать отдельные адгезионные белки. [9] [10]
Понимание молекулярной основы связывания с интегринами позволило разработать несколько препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и рака, включая эптифибатид , тирофибан и циленгитид . [11] [2] Эти препараты ингибируют связывание интегрина. Радиофармпрепараты ПЭТ, такие как флуциклатид, используют пептиды, содержащие RGD, для локализации опухолей, что позволяет проводить мониторинг рака. [12]
Эптифибатид и тирофибан являются антикоагулянтами, показанными для предотвращения тромбоза при острых ишемических коронарных синдромах. [13] [14] Эптифибатид дополнительно одобрен FDA для пациентов, перенесших чрескожное коронарное вмешательство . [15] Эти препараты блокируют активацию интегрина, ответственного за агрегацию тромбоцитов (αIIbβ3, также известного как гликопротеин IIb/IIIa ) в ответ на гликопротеины крови фибриноген и фактор фон Виллебранда . Эптифибатид (продаваемый как Интегрилин) представляет собой циклический (кольцевой) пептид из семи аминокислот, тогда как тирофибан представляет собой небольшую молекулу, разработанную для имитации химии и связывающей аффинности последовательности RGD. [16] [17]
Циленгитид , циклический пентапептид (RGDfV), является исследуемым препаратом, предназначенным для блокирования роста новых кровеносных сосудов в опухолях путем вмешательства в активацию интегрина αVβ3 . [18] Этот интегрин повышается в опухолевых и активированных эндотелиальных клетках. [19] Эта и другие антиангиогенные терапии зависят от прекращения кровоснабжения микросреды опухоли, что приводит к гипоксии и некрозу . [20] Циленгитид был оценен для лечения глиобластомы , но, как и в случае с другими антиангиогенными терапиями, не было показано, что он изменяет прогрессирование или улучшает выживаемость ни в отдельности, ни в сочетании со стандартными методами лечения. [21]
CEND-1, также известный как iRGD , представляет собой циклический пептид, который проникает в опухоли посредством связывания с рецепторами интегрина альфа V. [22] Он также связывает и активирует нейропилин-1 , что приводит к временному открытию опухоли и усилению доставки противораковых агентов в опухолевую ткань. В настоящее время он проходит клинические испытания на пациентах с солидными опухолями. [23]
Поскольку антиангиогенные методы лечения рака получили широкое распространение, возрос интерес к неинвазивному мониторингу ангиогенеза. Одной из наиболее широко изученных мишеней ангиогенеза является интегрин αVβ3. Радиоактивно меченые пептиды, содержащие RGD, демонстрируют высокое сродство и селективность к интегрину αVβ3 и исследуются в качестве инструментов для мониторинга ответа опухолей на лечение с помощью ПЭТ-визуализации . [24] К ним относятся 18 F-Galacto-RGD, 18 F-Fluciclatide-RGD, 18 F-RGD-K5, 68 Ga-NOTA-RGD, 68 Ga-NOTA-PRGD2, 18 F-Alfatide, 18 F-Alfatide II и 18 F-FPPRGD2. [19] [12] [24] В метаанализе исследований с использованием ПЭТ/КТ у пациентов с раком было показано, что этот диагностический метод может быть очень полезен для обнаружения злокачественных новообразований и прогнозирования краткосрочных результатов, хотя необходимы более масштабные исследования. [19]
Пептиды на основе RGD нашли множество применений в биологических исследованиях и медицинских устройствах. На рынке имеются культуральные планшеты, покрытые пептидами, имитирующими адгезионные мотивы белков ECM, которые способствуют длительному культивированию эмбриональных стволовых клеток человека. [25] RGD также является универсальным инструментом для создания многофункциональных «умных» материалов , таких как наночастицы, нацеленные на опухоли. [26] Кроме того, RGD широко используется в тканевой инженерии для содействия регенерации тканей. [3]
Традиционные методы доставки лекарств , такие как системная или местная доставка, связаны со многими проблемами, такими как низкая растворимость, нецелевые эффекты и невыгодная фармакокинетика . Наночастицы использовались для повышения растворимости и целевой доставки лекарства в нужную ткань, увеличения концентрации лекарства в месте действия и снижения концентрации лекарства в другом месте, тем самым увеличивая эффективность лекарства и уменьшая побочные эффекты. [27] [3] RGD использовался для нацеливания наночастиц, содержащих лекарства, на определенные типы клеток, особенно раковые клетки, экспрессирующие интегрин αvβ3. [3]
Многие исследовательские группы используют RGD для нацеливания химиотерапевтического доксорубицина на раковые клетки. Как и другие химиотерапевтические препараты этого класса, доксорубицин вызывает выпадение волос, тошноту, рвоту и миелосупрессию и может привести к кардиомиопатии и застойной сердечной недостаточности . Клинически доступный Доксил использует липосомы для снижения накопления доксорубицина в ткани миокарда, тем самым снижая кардиотоксичность. [28] Однако такие наночастицы полагаются на пассивное нацеливание опухолей с помощью эффекта EPR , который варьируется в зависимости от пациента и типа опухоли. [28] [29] Активные стратегии нацеливания направлены на увеличение транспорта лекарств в клетки для повышения эффективности и противодействия множественной лекарственной устойчивости. [28]
В дополнение к доксорубицину, RGD-конъюгированные наноматериалы использовались для доставки химиотерапевтических препаратов цисплатина , доцетаксела , паклитаксела , 5-фторурацила и гемцитабина к раковым клеткам. Такие наноматериалы также использовались для доставки комбинированных цитотоксических и сосудистых разрушающих терапий. [3]
В то время как генная терапия привлекла значительное внимание медицинского сообщества, особенно в области терапии рака, отсутствие безопасных и эффективных векторов доставки генов стало узким местом для клинического перевода. [30] Хотя вирусные векторы демонстрируют высокую эффективность трансфекции и защищают доставленные гены, существуют проблемы безопасности, связанные с иммунными реакциями на вирус. Было предложено много невирусных векторов, особенно катионные липиды и полимеры . Однако они демонстрируют низкую эффективность трансфекции по сравнению с вирусами. Поэтому RGD был связан с невирусными векторами для целевой доставки генетического материала в нужные клетки, тем самым увеличивая эффективность трансфекции . [30]
Тканевая инженерия направлена на замену утраченных или поврежденных тканей в организме. Успех таких усилий во многом зависит от способности направлять поведение клеток и стимулировать регенерацию тканей. Ключевой метод для этого использует лиганды, полученные из ECM, такие как RGD, для управления клеточным ответом на биоматериал , таким как присоединение, пролиферация и дифференциация. [31]
Высокий уровень сердечно-сосудистых заболеваний создает высокий спрос на трансплантаты для сосудистого шунтирования, особенно на трансплантаты малого диаметра, которые предотвращают окклюзию . [3] Было показано, что модификация сосудистых тканевых трансплантатов с помощью RGD подавляет адгезию тромбоцитов, улучшает клеточную инфильтрацию и усиливает эндотелизацию. [3] Также были предприняты попытки регенерировать поврежденные сердечные ткани путем наложения сердечных заплат после инфаркта миокарда. [32] Было показано, что добавление RGD на каркас сердечной ткани способствует адгезии клеток, предотвращает апоптоз и усиливает регенерацию тканей. [33] Пептид RGD также использовался для улучшения адгезии эндотелиальных клеток и пролиферации на синтетических сердечных клапанах. [34]
Дефекты костей или переломы могут возникать различными способами, включая травмы, новообразования, остеопороз или врожденные нарушения. Такие методы лечения, как аутотрансплантаты или аллотрансплантаты, страдают от недостатка донорских участков и вероятности инфекционных заболеваний соответственно. Поэтому существует значительный интерес к разработке тканевых костных конструкций, которые должны способствовать регенерации тканей. [35] Было показано, что покрытие имплантата RGD улучшает адгезию костных клеток, пролиферацию и выживаемость. Исследования in vivo таких покрытий дополнительно продемонстрировали улучшенную остеоинтеграцию . Модификация поверхности титанового имплантата белком, содержащим RGD, улучшает минерализацию кости и интеграцию имплантата и предотвращает отказ протеза. [34]
Повреждение роговицы вызывает значительное ухудшение зрения, наиболее распространенным методом лечения которого является аллотрансплантация роговицы. Однако донорские роговичные трансплантаты в дефиците и, как и другие тканевые трансплантаты, несут риск отторжения или инфекционного заболевания. [36] Таким образом, желательны варианты тканевой инженерии. В шелковых биоматериальных каркасах, которые воспроизводят иерархическую структуру роговицы , добавление RGD улучшает прикрепление клеток, выравнивание, пролиферацию и экспрессию белков ECM . [3] [36] Кроме того, RGD использовался для регенерации ретинального пигментированного эпителия. Эта ткань может быть получена из человеческих эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток , однако с неэффективной дифференциацией . Было показано, что RGD- альгинатные гидрогели улучшают получение ретинальной ткани из стволовых клеток. [3] [37]
RGD и другие биоактивные лиганды могут быть представлены на поверхности биоматериала в ряде различных пространственных расположений, и было продемонстрировано, что эти расположения оказывают значительное влияние на поведение клеток. В самоорганизующихся монослоях было обнаружено, что адгезия и пролиферация как эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), так и мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC) увеличивались в зависимости от плотности пептида RGD. Эти исследования также показали, что плотность RGD может изменять экспрессию интегрина, что, как постулируется, позволяет контролировать биохимические сигнальные пути. Дальнейшее исследование MSC на самоорганизующихся монослоях показало, что модуляция плотности RGD и сродства RGD к αvβ3 (за счет использования линейного и циклизованного RGD) может использоваться для контроля дифференциации MSC. [38] Также было оценено влияние презентации RGD на клетки в 3D-биоматериалах, которые более точно воспроизводят среду in vivo . В разлагаемых полиэтиленгликолевых гидрогелях длина капилляроподобных структур, образованных HUVEC, была прямо пропорциональна плотности RGD в гидрогеле. [38] [39] Кроме того, исследования в области нано-паттернинга показали, что, в то время как увеличение глобальной плотности RGD увеличивает прочность адгезии клеток до насыщения, увеличение локальной (микро/наномасштабной) плотности RGD не следует этой тенденции. [38]
RGD является наиболее широко используемым из большего класса клеточно-адгезивных пептидов. Эти короткие аминокислотные последовательности являются минимальным мотивом более крупного белка, который необходим для связывания с рецептором клеточной поверхности, который управляет клеточной адгезией. [40] Большинство (89%) опубликованных исследований биоматериалов, функционализированных клеточно-адгезивными пептидами, используют RGD, тогда как IKVAV и YIGSR используются в 6% и 4% этих исследований соответственно. [40] Клеточно-адгезивные пептиды, выделенные из фибронектина, включают RGD, RGDS, PHSRN и REDV. [41] [42] YIGSR и IKVAV выделены из ламинина, тогда как DGEA и GFOGER/GFPGER выделены из коллагена. [41] Искусственные аминокислотные последовательности, которые не имеют биологического сходства с белками ECM, также были синтезированы и включают α5β1-специфический пептид RRETAWA. [31] [43]
Линейные пептиды RGD страдают от низкой аффинности связывания, быстрой деградации протеазами и отсутствия специфичности к типу интегрина. [44] RGD можно циклизовать или превратить в циклическое соединение с помощью дисульфидных, тиоэфирных или жестких ароматических кольцевых линкеров. Это приводит к увеличению аффинности связывания и селективности для интегрина αVβ3 по сравнению с αIIBβ3. [44] [30] Например, было показано, что циклический пептид ACDCRGDCFCG, также известный как RGD4C, в 200 раз более эффективен, чем обычно используемые линейные пептиды RGD. [30] Структурная жесткость циклических пептидов RGD улучшает их связывающие свойства и предотвращает деградацию на высокочувствительном остатке аспарагиновой кислоты, тем самым увеличивая их стабильность. [30] Многие производные RGD препараты и диагностические средства циклизованы, включая Эптифибатид, Циленгитид, CEND-1 и 18 F-Галакто-RGD, а также 18 F-Флуциклатид-RGD. [13] [18]