96-контактный зонд, используемый для проведения точечных анализов с дрожжевыми, грибковыми или бактериальными клетками
Отдельные микроорганизмы, помещенные на пластину, вырастут в отдельные колонии , каждая из которых будет клоном , генетически идентичным отдельному предковому организму (за исключением низкой, неизбежной скорости мутации ). Таким образом, пластину можно использовать либо для оценки концентрации организмов в жидкой культуре или подходящем разведении этой культуры с помощью счетчика колоний , либо для получения генетически чистых культур из смешанной культуры генетически различных организмов.
Существует несколько методов для высевания клеток. Один из методов известен как « штриховка ». В этом методе капля культуры на конце тонкой стерильной петли проволоки, иногда называемой инокулятором, наносится на поверхность агара, оставляя организмы позади, большее количество в начале штриха и меньшее количество в конце. В какой-то момент во время успешного «штриха» количество осажденных организмов будет таким, что в этой области вырастут отдельные индивидуальные колонии, которые можно будет удалить для дальнейшего культивирования, используя другую стерильную петлю.
Другой способ посева организмов, после штрихования, на агаровые пластины — это точечный анализ . Этот тип анализа часто используется для проверки жизнеспособности клеток и выполняется с помощью пиннеров (часто также называемых лягушачьими). Третий метод — использование стерильных стеклянных шариков для посева клеток. В этом методе клетки выращиваются в жидкой культуре, в которой небольшой объем пипеткой наносится на агаровую пластину, а затем распределяется с шариками. Посев реплик — это еще один метод, используемый для посева клеток на агаровые пластины. Эти четыре метода являются наиболее распространенными, но возможны и другие. Крайне важно работать в стерильных условиях , чтобы предотвратить загрязнение агаровых пластин. [1] Таким образом, посев часто выполняется в ламинарном шкафу или на рабочем столе рядом с бунзеновской горелкой . [2]
История
В 1881 году Фанни Гессе , работавшая лаборанткой у своего мужа Вальтера Гессе в лаборатории Роберта Коха , предложила агар в качестве эффективного загустителя, поскольку он уже некоторое время широко применялся в приготовлении джемов. [3]
Типы
Агаровая пластинка, просматриваемая в электронном счетчике колонийПример алгоритма обработки возможной бактериальной инфекции в случаях без специально запрошенных целей (небактерии, микобактерии и т. д.) с наиболее распространенными ситуациями и агентами, наблюдаемыми в условиях больницы Новой Англии. Для разных источников образцов используются разные агаровые пластины, как показано в верхнем левом квадранте.
Как и другие питательные среды , составы агара, используемые в чашках Петри, можно классифицировать как «определенные» или «неопределенные»; определенная среда синтезируется из отдельных химических веществ, необходимых организму, поэтому точный молекулярный состав известен, тогда как неопределенная среда изготавливается из натуральных продуктов, таких как дрожжевой экстракт , точный состав которых неизвестен. [4]
Чашки с агаром могут быть сформулированы как разрешающие, с намерением разрешить рост любых присутствующих организмов, или ограничительные или селективные, с намерением разрешить рост только определенного подмножества этих организмов. [5] Это может принимать форму требования к питанию, например, предоставление определенного соединения, такого как лактоза , в качестве единственного источника углерода и тем самым выбор только тех организмов, которые могут метаболизировать это соединение, или включение определенного антибиотика или другого вещества для выбора только тех организмов, которые устойчивы к этому веществу. Это в некоторой степени коррелирует с определенными и неопределенными средами; неопределенные среды, изготовленные из натуральных продуктов и содержащие неизвестное сочетание очень многих органических молекул, обычно более разрешающие с точки зрения удовлетворения потребностей более широкого спектра организмов. Напротив, определенные среды могут быть точно адаптированы для выбора организмов с определенными свойствами.
Агаровые пластины также могут быть индикаторными пластинами, в которых организмы не отбираются на основе роста, а вместо этого различаются по изменению цвета в некоторых колониях, обычно вызванному действием фермента на некоторое соединение, добавленное в среду. [6]
Чашки инкубируют от 12 часов до нескольких дней, в зависимости от проводимого теста.
Обычно используемые типы агаровых пластин включают:
Пластины с кровяным агаром (BAP) содержат кровь млекопитающих (обычно овцы или лошади), как правило, в концентрации 5–10%. BAP обогащены, и дифференциальные среды используются для изоляции прихотливых организмов и обнаружения гемолитической активности. β-Гемолитическая активность покажет лизис и полное переваривание содержимого эритроцитов, окружающего колонию. Примерами являются Streptococcus haemolyticus . α-Гемолиз вызовет только частичный лизис эритроцитов (клеточная мембрана останется нетронутой) и станет зеленым или коричневым из-за преобразования гемоглобина в метгемоглобин. Примером этого может быть Streptococcus viridans . γ-Гемолиз (или негемолитический) — это термин, относящийся к отсутствию гемолитической активности. [7] BAP также содержат мясной экстракт или дрожжевой экстракт , триптон , хлорид натрия и агар. [8]
Шоколадный агар
Шоколадный агар — это тип пластины кровяного агара, в которой клетки крови лизируются путем нагревания клеток до 80 °C. Он используется для выращивания прихотливых респираторных бактерий, таких как Haemophilus influenzae . Шоколадный агар назван так из-за своего цвета, и в пластине не содержится шоколада .
Агар CLED – агар с дефицитом цистеина , лактозы и электролитов – используется для выделения и дифференциации бактерий мочевыводящих путей, поскольку он подавляет размножение видов Proteus и позволяет различать бактерии, ферментирующие и неферментирующие лактозу.
Среда Гранада используется для выделения и дифференциации Streptococcus группы B , Streptococcus agalactiae из клинических образцов. Он растет в среде Гранада в виде красных колоний, и большинство сопутствующих бактерий ингибируются.
Агар Макконки — селективная и дифференциальная среда, используемая для дифференциации грамотрицательных бактерий, при этом подавляя рост грамположительных бактерий. Добавление желчных солей и кристаллического фиолетового в агар подавляет рост большинства грамположительных бактерий, делая агар Макконки селективным. Лактоза и нейтральный красный добавляются для дифференциации ферментирующих лактозу бактерий, которые образуют розовые колонии, от неферментирующих лактозу бактерий, которые образуют прозрачные колонии. Альтернативная среда, эозин-метиленовый синий, служит той же цели. [11]
Агар с маннитом и солью также является селективной и дифференциальной средой. Маннит указывает на организмы, которые ферментируют маннит: ферментация маннита производит молочную кислоту , снижая pH и окрашивая пластину в желтый цвет. Соль предназначена для отбора галофилов ; организмы, которые не выдерживают высокого содержания соли, не могут хорошо расти.
Агар Мюллера–Хинтона содержит мясной настой, пептон и крахмал и используется в основном для тестирования чувствительности к антибиотикам. Он может быть в форме кровяного агара.
Питательный агар обычно используется для роста нетребовательных организмов и наблюдения за производством пигмента. Он безопасен для использования в школьных научных лабораториях, поскольку он не способствует селективному росту патогенных бактерий.
Агар Онёза позволяет проводить более быструю бактериологическую диагностику, поскольку колонии сальмонелл и шигелл можно четко и надежно дифференцировать от других энтеробактерий. Выход сальмонелл из образцов кала, полученных при использовании этой среды, выше, чем при использовании агара ЛЕЙФСОНА или агара сальмонеллы–шигеллы .
Агар на основе фенилэтилового спирта селективен для видов стафилококков , одновременно подавляя рост грамотрицательных палочек (например, Escherichia coli , Shigella , Proteus и т. д.).
Агар R2A — неспецифическая среда, имитирующая воду, поэтому используется для анализа воды.
Триптический (триптический) соевый агар (TSA) — это среда общего назначения, получаемая путем ферментативного переваривания соевой муки и казеина . Часто является базовой средой для других типов агара; например, пластины кровяного агара изготавливаются путем обогащения пластин TSA кровью. Пластины TSA поддерживают рост многих полуприхотливых бактерий, включая некоторые виды Brucella , Corynebacterium , Listeria , Neisseria и Vibrio .
Агар ксилозы - лизина - дезоксихолата используется для культивирования образцов кала и содержит два индикатора. Он разработан для подавления грамположительных бактерий, в то время как рост грамотрицательных бацилл стимулируется. Колонии ферментеров лактозы выглядят желтыми. Он также используется для культивирования возможных сальмонелл , которые могут присутствовать в образце пищи. Большинство колоний сальмонелл образуют на нем черный центр.
Агар Сабуро используется для культивирования грибков и имеет низкий уровень pH , который подавляет рост большинства бактерий; он также содержит антибиотик гентамицин , который специфически подавляет рост грамотрицательных бактерий.
Агар на основе сенного настоя предназначен для культивирования слизевиков (которые не являются грибками).
Хромогенные агары позволяют распознать некоторые основные типы грибковых инфекций.
Вид снизу чашки Петри с агаром Сабуро и колонией Trichophyton rubrum var. rodhaini
ХРОМАгар ( хромогенный агар ) с его характерным проявлением некоторых основных грибковых патогенов.
Грибы ( аскомицеты ), растущие в аксенических культурах , каждая из которых представляет собой культуру одного выбранного организма и свободна от всех других организмов, что позволяет изучать культивируемый организм изолированно.
Среда для споруляции — это среда, используемая, когда необходимо сформировать споры. Она также может использоваться при работе с грибами или бактериями в зависимости от того, способен ли штамм образовывать споры.
Мега Плита
Чашка Петри размером 2' x 4', заполненная 14 л (литрами) агаровой среды, полученной из морских водорослей, созданной учеными Гарварда, которая использовалась для изучения того, как E. coli эволюционировала в устойчивость к антибиотикам. Мега-чашка также помогла изучить более уникальные концепции микробиологии, такие как параллельная эволюция, мутационный отбор, колониальная интерференция и т. д. [13]
^ ab Madigan M, Martinko J, ред. (2005). Brock Biology of Microorganisms (11-е изд.). Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.
^ Сандерс, Эрин Р. (11 мая 2012 г.). «Асептические лабораторные методы: методы посева». Журнал визуализированных экспериментов (63): e3064. doi :10.3791/3064. PMC 4846335. PMID 22617405. Архивировано из оригинала 14 ноября 2017 г. Получено 3 мая 2018 г.
^ "История агаровой пластины". Новости лаборатории . Архивировано из оригинала 11 февраля 2010 года . Получено 22.02.2010 .
^ Baron S; et al., ред. (1996). Медицинская микробиология Барона (4-е изд.). Медицинское отделение Техасского университета . ISBN0-9631172-1-1. (через книжную полку NCBI).
^ Райан К. Дж.; Рэй К. Г., ред. (2004). Sherris Medical Microbiology (4-е изд.). McGraw Hill. ISBN0-8385-8529-9.
^ "Индикаторные пластины" . Получено 12 июля 2018 г.
^ "Кровяной агар и протоколы гемолиза". Архивировано из оригинала 2012-02-02 . Получено 2014-10-28 .
^ «Кровяной агар — состав, приготовление, применение и фотографии», Microbiology Info.com
^ ab Фишер, Брюс; Харви, Ричард П.; Чамп, Памела К. (2007). Иллюстрированные обзоры Липпинкотта: Микробиология (серия иллюстрированных обзоров Липпинкотта) . Хагерствон, Мэриленд: Lippincott Williams & Wilkins. ISBN978-0-7817-8215-9.
^ Миллер, Дж. Х. (1972). Эксперименты по молекулярной генетике. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк.
^ Юнг, Бенджамин; Хойлат, Жиль Дж. (2022), "MacConkey Medium", StatPearls , Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, PMID 32491326 , получено 12 декабря 2022 г.
_cells.jpg/1280px-Candida_albicans_growing_as_yeast_cells_and_filamentous_(hypha)_cells.jpg)
