Повреждение ДНК — это изменение химической структуры ДНК , например, разрыв цепи ДНК, отсутствие нуклеиновой кислоты в остове ДНК или химически измененное основание, например, 8-OHdG . Повреждение ДНК может происходить естественным путем или под воздействием факторов окружающей среды, но оно существенно отличается от мутации , хотя оба типа ошибок в ДНК . Повреждение ДНК — это аномальная химическая структура ДНК, тогда как мутация — это изменение последовательности пар оснований. Повреждения ДНК вызывают изменения в структуре генетического материала и мешают механизму репликации функционировать и работать должным образом. [1] Реакция на повреждение ДНК (DDR) — это сложный путь передачи сигнала, который распознает повреждение ДНК и инициирует клеточный ответ на повреждение. [2]
Повреждение ДНК и мутация имеют разные биологические последствия. Хотя большинство повреждений ДНК могут подвергаться репарации ДНК , такая репарация не является на 100% эффективной. Нерепарированные повреждения ДНК накапливаются в нереплицирующихся клетках, таких как клетки мозга или мышц взрослых млекопитающих, и могут вызывать старение. [3] [4] [5] (Также см. Теорию старения, связанную с повреждением ДНК .) В реплицирующихся клетках, таких как клетки, выстилающие толстую кишку, ошибки возникают при репликации прошлых повреждений в матричной цепи ДНК или во время репарации повреждений ДНК. Эти ошибки могут приводить к мутациям или эпигенетическим изменениям. [6] Оба этих типа изменений могут реплицироваться и передаваться последующим поколениям клеток. Эти изменения могут изменять функцию гена или регуляцию экспрессии гена и, возможно, способствовать прогрессированию рака.
На протяжении всего клеточного цикла существуют различные контрольные точки, которые гарантируют, что клетка находится в хорошем состоянии для перехода к митозу. Три основные контрольные точки находятся в G1/s, G2/m и в контрольной точке сборки веретена, регулирующей прохождение анафазы. Контрольные точки G1 и G2 включают сканирование поврежденной ДНК. [7] Во время фазы S клетка более уязвима к повреждению ДНК, чем в любой другой части клеточного цикла. Контрольная точка G2 проверяет поврежденную ДНК и полноту репликации ДНК.
Повреждение ДНК, которое происходит естественным образом, может быть результатом метаболических или гидролитических процессов. Метаболизм высвобождает соединения, которые повреждают ДНК, включая активные формы кислорода , активные формы азота , активные карбонильные формы, продукты перекисного окисления липидов и алкилирующие агенты , среди прочих, в то время как гидролиз расщепляет химические связи в ДНК. [8] Естественные окислительные повреждения ДНК возникают по меньшей мере 10 000 раз на клетку в день у людей и до 100 000 раз на клетку в день у крыс [9], как описано ниже.
Окислительное повреждение ДНК может привести к появлению более 20 типов измененных оснований [10] [11], а также к разрывам отдельных цепей. [12]
Другие типы эндогенных повреждений ДНК, приведенные ниже с указанием частоты их возникновения, включают депуринизацию , депиримидинацию , двухцепочечные разрывы , O6-метилгуанины и дезаминирование цитозина .
ДНК может быть повреждена также из-за факторов окружающей среды. Агенты окружающей среды, такие как ультрафиолетовый свет, ионизирующее излучение и генотоксичные химикаты. Репликационные вилки могут быть остановлены из-за поврежденной ДНК, а разрывы двухцепочечных молекул также являются формой повреждения ДНК. [13]
В приведенном ниже списке показаны некоторые частоты, с которыми ежедневно возникают новые естественные повреждения ДНК, обусловленные эндогенными клеточными процессами.
Другим важным эндогенным повреждением ДНК является M1dG , сокращение от (3-(2'-дезокси-бета-D-эритро-пентофуранозил)-пиримидо[1,2-a]-пурин-10(3H)-он). Выделение с мочой (вероятно, отражающее скорость появления) M1dG может быть в 1000 раз ниже, чем у 8-oxodG. [26] Однако более важной мерой может быть стационарный уровень в ДНК, отражающий как скорость появления, так и скорость восстановления ДНК. Устойчивый уровень M1dG выше, чем у 8-oxodG. [27] Это указывает на то, что некоторые повреждения ДНК, произведенные с низкой скоростью, могут быть трудно поддающимися восстановлению и оставаться в ДНК на высоком стационарном уровне. Как M1dG [28] , так и 8-oxodG [29] являются мутагенными .
Стационарные уровни повреждений ДНК представляют собой баланс между формированием и восстановлением. Было охарактеризовано более 100 типов окислительных повреждений ДНК, и 8-oxodG составляет около 5% окислительных повреждений ДНК в стабильном состоянии. [18] Хельбок и др. [14] подсчитали, что у молодых крыс было 24 000 окислительных аддуктов ДНК в стабильном состоянии на клетку, а у старых крыс — 66 000 аддуктов на клетку. Это отражает накопление повреждений ДНК с возрастом. Накопление повреждений ДНК с возрастом далее описано в теории повреждения ДНК при старении .
Свенберг и др. [30] измерили средние количества выбранных устойчивых эндогенных повреждений ДНК в клетках млекопитающих. Семь наиболее распространенных повреждений, которые они оценили, показаны в Таблице 1.
Оценивая устойчивые повреждения в определенных тканях крысы, Накамура и Свенберг [31] указали, что количество абазических участков варьируется от примерно 50 000 на клетку в печени, почках и легких до примерно 200 000 на клетку в мозге.
Белки, способствующие эндогенному повреждению ДНК, были идентифицированы в статье 2019 года как белки «повреждения» ДНК (DDP). [32] Механизмы DDP делятся на 3 кластера:
Человеческие гомологи DDP чрезмерно представлены в известных факторах, вызывающих рак, а их РНК в опухолях предсказывают сильный мутагенез и плохой прогноз. [32]
При наличии повреждения ДНК клетка может либо устранить повреждение, либо вызвать гибель клетки, если повреждение не поддается восстановлению.
Семь основных типов репарации ДНК и один путь толерантности к повреждениям, поражения, которые они устраняют, и точность репарации (или толерантности) показаны в этой таблице. Для краткого описания этапов репарации см. Механизмы репарации ДНК или см. каждый отдельный путь.
Схематическая диаграмма показывает роль недостаточной репарации ДНК в старении и раке, а также роль апоптоза в профилактике рака. Избыток естественного повреждения ДНК из-за унаследованного дефицита определенных ферментов репарации ДНК может вызвать преждевременное старение или повышенный риск рака (см. Расстройство, связанное с дефицитом репарации ДНК ). С другой стороны, способность запускать апоптоз при наличии избыточного нерепарированного повреждения ДНК имеет решающее значение для профилактики рака. [42]
Белки репарации ДНК часто активируются или индуцируются, когда ДНК получает повреждения. Однако чрезмерное повреждение ДНК может инициировать апоптоз (т. е. запрограммированную гибель клеток), если уровень повреждения ДНК превышает способность к восстановлению. Апоптоз может предотвратить мутагенез и прогрессирование рака в клетках с избыточным повреждением ДНК. [43]
Воспаление часто вызывается инфекцией, например, вирусом гепатита B (HBV), вирусом гепатита C (HCV) или Helicobacter pylori . Хроническое воспаление также является центральной характеристикой ожирения. [44] [45] [46] [47] Такое воспаление вызывает окислительное повреждение ДНК. Это происходит из-за индукции активных форм кислорода (ROS) различными внутриклеточными медиаторами воспаления. [48] [49] [50] Инфекции HBV и HCV, в частности, вызывают 10 000-кратное и 100 000-кратное увеличение внутриклеточной продукции ROS соответственно. [51] Индуцированные воспалением ROS, которые вызывают повреждение ДНК, могут вызывать апоптоз, [52] [53] но также могут вызывать рак, если процессы восстановления и апоптоза недостаточно защитны. [45]
Желчные кислоты , хранящиеся в желчном пузыре, высвобождаются в тонкий кишечник в ответ на жир в рационе. Более высокие уровни жира вызывают большее высвобождение. [54] Желчные кислоты вызывают повреждение ДНК, включая окислительное повреждение ДНК, двухцепочечные разрывы ДНК, анеуплоидию и разрывы хромосом. [55] Высокие нормальные уровни желчной кислоты дезоксихолевой кислоты вызывают апоптоз в клетках толстой кишки человека, [56] но также могут привести к раку толстой кишки, если репарация и апоптотическая защита недостаточны. [57]
Апоптоз служит защитным механизмом против образования опухолей. [58] Он предотвращает повышенный мутагенез, который может вызвать избыточное повреждение ДНК при репликации. [59]
По крайней мере 17 белков репарации ДНК, распределенных по пяти путям репарации ДНК, играют «двойную роль» в ответ на повреждение ДНК. При умеренных уровнях повреждения ДНК эти белки инициируют или способствуют восстановлению ДНК. Однако при наличии чрезмерных уровней повреждения ДНК они запускают апоптоз. [43]
Упаковка эукариотической ДНК в хроматин является барьером для всех основанных на ДНК процессов, требующих действия ферментов. Для большинства процессов репарации ДНК хроматин должен быть ремоделирован . У эукариот АТФ -зависимые комплексы ремоделирования хроматина и гистон-модифицирующие ферменты являются двумя факторами, которые действуют для выполнения этого процесса ремоделирования после повреждения ДНК. [60] Далее обычно следуют дальнейшие шаги по репарации ДНК, включающие несколько ферментов. Некоторые из первых ответов на повреждение ДНК с указанием их времени описаны ниже. Более полные описания путей репарации ДНК представлены в статьях, описывающих каждый путь. В путях репарации ДНК задействовано не менее 169 ферментов. [61]
Окисленные основания в ДНК образуются в клетках, обработанных красителем Hoechst, а затем подвергнутых микрооблучению светом с длиной волны 405 нм. [62] Такие окисленные основания могут быть восстановлены методом эксцизионной репарации оснований .
Когда свет длиной 405 нм фокусируется вдоль узкой линии внутри ядра клетки, примерно через 2,5 секунды после облучения, фермент ремоделирования хроматина Alc1 достигает половины максимального набора на облученной микролинии. [63] Линия хроматина, которая была облучена, затем расслабляется, расширяясь из стороны в сторону в течение следующих 60 секунд. [63]
В течение 6 секунд после облучения светом 405 нм происходит полумаксимальное привлечение OGG1 к облученной линии. [62] OGG1 — это фермент, который удаляет окислительное повреждение ДНК 8-oxo-dG из ДНК. Удаление 8-oxo-dG во время репарации эксцизии основания происходит с периодом полураспада 11 минут. [18]
Ультрафиолетовый (УФ) свет вызывает образование повреждений ДНК, включая пиримидиновые димеры (такие как тиминовые димеры) и 6,4 фотопродукты. Эти типы «объемных» повреждений восстанавливаются путем эксцизионной репарации нуклеотидов .
После облучения УФ-светом DDB2 в комплексе с DDB1 , белком убиквитинлигазы CUL4A и белком RING finger ROC1 связывается с участками повреждения в хроматине. Ассоциация на уровне половины максимума происходит через 40 секунд. [64] PARP1 также связывается в течение этого периода. [65] Белок PARP1 прикрепляется как к DDB1, так и к DDB2, а затем PARylates (создает поли-АДФ рибозную цепь) на DDB2, который привлекает белок ремоделирования ДНК ALC1 . [65] ALC1 расслабляет хроматин в местах повреждения ДНК УФ-излучением. Кроме того, комплекс убиквитинлигазы E3 DDB1-CUL4A осуществляет убиквитинирование основных гистонов H2A, H3 и H4, а также белка репарации XPC, который был привлечен к месту повреждения ДНК. [66] XPC, при убиквитинировании, активируется и инициирует путь репарации эксцизии нуклеотидов . Несколько позже, через 30 минут после повреждения УФ, комплекс ремоделирования хроматина INO80 привлекается к месту повреждения ДНК, и это совпадает со связыванием дальнейших белков репарации эксцизии нуклеотидов, включая ERCC1 . [67]
Двухцепочечные разрывы (DSB) в определенных местах могут быть вызваны трансфекцией клеток плазмидой, кодирующей эндонуклеазу I-SceI ( самонаводящаяся эндонуклеаза ). Множественные DSB могут быть вызваны облучением сенсибилизированных клеток (меченых 5'-бром-2'-дезоксиуридином и красителем Hoechst) светом 780 нм. Эти DSB могут быть восстановлены с помощью точной гомологичной рекомбинационной репарации или менее точного пути репарации негомологичного соединения концов . Здесь мы описываем ранние этапы гомологичной рекомбинационной репарации (HRR).
После обработки клеток для введения DSB, стресс-активируемая протеинкиназа, c-Jun N-терминальная киназа (JNK) , фосфорилирует SIRT6 на серине 10. [68] Эта посттрансляционная модификация облегчает мобилизацию SIRT6 к участкам повреждения ДНК с полумаксимальным набором менее чем за секунду. [68] SIRT6 в этом участке необходим для эффективного набора поли (АДФ-рибоза) полимеразы 1 (PARP1) к месту разрыва ДНК и для эффективного восстановления DSB. [68] Белок PARP1 начинает появляться в DSB менее чем за секунду, с полумаксимальным накоплением в течение 1,6 секунды после возникновения повреждения. [69] Затем это позволяет наполовину максимально рекрутировать ферменты репарации ДНК MRE11 в течение 13 секунд и NBS1 в течение 28 секунд. [69] MRE11 и NBS1 выполняют ранние этапы пути HRR.
γH2AX, фосфорилированная форма H2AX, также участвует в ранних этапах репарации DSB. Гистоновый вариант H2AX составляет около 10% гистонов H2A в хроматине человека. [70] γH2AX (H2AX фосфорилированный по серину 139) можно обнаружить уже через 20 секунд после облучения клеток (с образованием двухцепочечного разрыва ДНК), а половина максимального накопления γH2AX происходит через одну минуту. [70] Степень хроматина с фосфорилированным γH2AX составляет около двух миллионов пар оснований в месте двухцепочечного разрыва ДНК. [70] Сам по себе γH2AX не вызывает деконденсацию хроматина, но в течение 30 секунд после облучения можно обнаружить белок RNF8 в ассоциации с γH2AX. [71] RNF8 опосредует обширную деконденсацию хроматина посредством его последующего взаимодействия с CHD4 , [72] компонентом комплекса ремоделирования нуклеосом и деацетилазы NuRD .
После быстрого ремоделирования хроматина могут активироваться контрольные точки клеточного цикла , чтобы завершить восстановление ДНК до того, как клеточный цикл начнется. Сначала две киназы , ATM и ATR , активируются в течение 5 или 6 минут после повреждения ДНК. За этим следует фосфорилирование белка контрольной точки клеточного цикла Chk1 , инициирующее его функцию, примерно через 10 минут после повреждения ДНК. [73]
Повреждение ДНК 8-oxo-dG не происходит случайным образом в геноме. В эмбриональных фибробластах мышей было обнаружено 2–5-кратное обогащение 8-oxo-dG в областях генетического контроля, включая промоторы , 5'-нетранслируемые области и 3'-нетранслируемые области по сравнению с уровнями 8-oxo-dG, обнаруженными в телах генов и в межгенных областях . [74] В эндотелиальных клетках легочной артерии крысы, когда 22 414 генов, кодирующих белок, были исследованы на предмет локализации 8-oxo-dG, большинство 8-oxo-dG (если они присутствовали) были обнаружены в областях промотора, а не в телах генов. [75] Среди сотен генов, на уровни экспрессии которых повлияла гипоксия, те, у которых был недавно приобретенный промотор 8-oxo-dG, были повышены , а те гены, промоторы которых потеряли 8-oxo-dG, были почти все понижены . [75]
Как было рассмотрено Ваном и др., [76] окисленный гуанин, по-видимому, играет несколько регуляторных ролей в экспрессии генов. В частности, когда окислительный стресс производит 8-oxo-dG в промоторе гена, окислительный стресс может также инактивировать OGG1 , фермент, который нацелен на 8-oxo-dG и обычно инициирует восстановление повреждений 8-oxo-dG. Неактивный OGG1, который больше не вырезает 8-oxo-dG, тем не менее нацелен и комплексируется с 8-oxo-dG и вызывает резкий (~70 o ) изгиб в ДНК. Это позволяет собрать транскрипционный инициирующий комплекс, повышающий регуляцию транскрипции связанного гена. [76] [77]
Когда 8-oxo-dG образуется в богатой гуанином, потенциальной G-квадруплекс-образующей последовательности (PQS) в кодирующей цепи промотора, активный OGG1 вырезает 8-oxo-dG и генерирует апуриновый/апиримидиновый сайт (AP-сайт). AP-сайт позволяет расплавить дуплекс, чтобы демаскировать PQS, принимая G-квадруплексную складку (структуру/мотив G4), которая играет регуляторную роль в активации транскрипции. [76] [78]
Когда 8-oxo-dG образует комплекс с активным OGG1, он может затем привлекать ремоделеры хроматина для модуляции экспрессии генов. Хромодоменовый геликазный ДНК-связывающий белок 4 (CHD4) , компонент комплекса (NuRD) , привлекается OGG1 к участкам окислительного повреждения ДНК. Затем CHD4 привлекает ферменты метилирования ДНК и гистонов, которые подавляют транскрипцию связанных генов. [76]
Окисление гуанина, особенно в сайтах CpG , может быть особенно важным для обучения и памяти. Метилирование цитозинов происходит в 60–90% сайтов CpG в зависимости от типа ткани. [79] В мозге млекопитающих ~62% CpG метилированы. [79] Метилирование сайтов CpG имеет тенденцию стабильно подавлять гены. [80] Более 500 из этих сайтов CpG деметилируются в ДНК нейронов во время формирования памяти и консолидации памяти в областях гиппокампа [81] [82] и поясной извилины [82] мозга. Как указано ниже, первым шагом в деметилировании метилированного цитозина в сайте CpG является окисление гуанина с образованием 8-oxo-dG.
Рисунок в этом разделе показывает сайт CpG, где цитозин метилируется с образованием 5-метилцитозина (5mC), а гуанин окисляется с образованием 8-оксо-2'-дезоксигуанозина (на рисунке это показано в таутомерной форме 8-OHdG). Когда эта структура формируется, фермент репарации эксцизии оснований OGG1 нацеливается на 8-OHdG и связывается с повреждением без немедленного вырезания. OGG1, присутствующий на сайте 5mCp-8-OHdG, рекрутирует TET1 , а TET1 окисляет 5mC, смежный с 8-OHdG. Это инициирует деметилирование 5mC. [83] TET1 является ключевым ферментом, участвующим в деметилировании 5mCpG. Однако TET1 способен воздействовать на 5mCpG только в том случае, если гуанин был сначала окислен с образованием 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-OHdG или его таутомера 8-оксо-dG), что приводит к образованию динуклеотида 5mCp-8-OHdG (см. рисунок в этом разделе). [83] Это инициирует путь деметилирования метилированного цитозина, что в конечном итоге приводит к неметилированному цитозину (см. окисление ДНК для получения дополнительных шагов по образованию неметилированного цитозина).
Установлено, что измененная экспрессия белка в нейронах, вызванная изменениями в метилировании ДНК (вероятно, контролируемая 8-оксо-dG-зависимым деметилированием участков CpG в промоторах генов в ДНК нейронов), играет центральную роль в формировании памяти. [84]
Двухцепочечные разрывы (DSB) в областях ДНК, связанных с нейронной активностью, производятся различными механизмами внутри и вокруг генома. Фермент топоизомераза II , или TOPIIβ, играет ключевую роль в образовании DSB, помогая в деметилировании или ослаблении гистонов, обернутых вокруг двойной спирали, для содействия транскрипции . [85] После того, как структура хроматина открыта, DSB с большей вероятностью накапливаются, однако это обычно восстанавливается TOPIIβ посредством его внутренней способности к лигированию, которая воссоединяет расщепленные концы ДНК. [85]
Неспособность TOPIIβ к религазе может иметь серьезные последствия для синтеза белка, где, как предполагается, «блокирование активности TOPIIβ изменяет экспрессию почти одной трети всех генов, регулируемых развитием», таких как нейронные немедленные ранние гены (IEG), участвующие в консолидации памяти . [85] [86] Быстрая экспрессия egr-1 , c-Fos и Arc IEG наблюдалась в ответ на повышенную нейронную активность в области гиппокампа мозга, где происходит обработка памяти. [87] В качестве превентивной меры против неспособности TOPIIβ молекулы восстановления DSB привлекаются двумя различными путями: факторами пути негомологичного соединения концов (NHEJ), которые выполняют функцию религирования, аналогичную функции TOPIIβ, и путем гомологичной рекомбинации (HR) , который использует неповрежденную сестринскую цепь в качестве шаблона для восстановления поврежденной цепи ДНК. [85] [88]
Стимуляция нейронной активности, как уже упоминалось ранее в отношении экспрессии IEG, является еще одним механизмом, посредством которого генерируются DSB. Изменения уровня активности использовались в исследованиях в качестве биомаркера для отслеживания перекрытия между DSB и повышенным метилированием гистона H3K4 в промоторных областях IEG. [85] [88] Другие исследования показали, что транспозируемые элементы (TE) могут вызывать DSB посредством эндогенной активности, которая включает использование ферментов эндонуклеазы для вставки и расщепления целевой ДНК в случайных местах. [89] [90]
В то время как накопление DSB, как правило, подавляет долговременную консолидацию памяти, процесс реконсолидации , напротив, зависит от DSB. Реконсолидация памяти включает в себя модификацию существующих воспоминаний, хранящихся в долговременной памяти. [91] Исследования с участием NPAS4 , гена, регулирующего нейропластичность в гиппокампе во время контекстного обучения и формирования памяти, выявили связь между делециями в кодирующей области и нарушениями вспоминания воспоминаний о страхе у трансгенных крыс. [85] Более того, фермент H3K4me3, который катализирует деметилирование гистона H3K4, был повышен в промоторной области гена NPAS4 во время процесса реконсолидации, в то время как нокдаун (нокдаун гена) того же фермента препятствовал реконсолидации. [85] Похожий эффект наблюдался в TOPIIβ, где нокдаун также нарушал реакцию памяти о страхе у крыс, что указывает на то, что DSB, наряду с ферментами, которые их регулируют, влияют на формирование памяти на нескольких этапах.
Накопление DSB в более широком смысле приводит к дегенерации нейронов, затрудняя функцию памяти и процессы обучения. Из-за отсутствия деления клеток и высокой метаболической активности нейроны особенно подвержены повреждению ДНК. [88] Кроме того, дисбаланс DSB и молекул восстановления ДНК для генов нейрональной активности был связан с развитием различных нейродегенеративных заболеваний человека, включая болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП) и боковой амиотрофический склероз (БАС). [88] У пациентов с болезнью Альцгеймера DSB накапливаются в нейронах на ранних стадиях и являются движущей силой потери памяти, ключевой характеристики заболевания. [88] Другими внешними факторами, которые приводят к повышению уровня зависимых от активности DSB у людей с БА, являются окислительное повреждение нейронов, которое может привести к большему количеству DSB, когда множественные поражения возникают близко друг к другу. Факторы окружающей среды, такие как вирусы и диета с высоким содержанием жиров, также связаны с нарушенной функцией молекул восстановления ДНК.
Одна из целевых терапий для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера включала подавление гена BRCA1 в мозге человека, первоначально протестированное на трансгенных мышах, у которых наблюдалось повышение уровней DSB и потеря памяти, что предполагает, что BRCA1 может «служить терапевтической мишенью для болезни Альцгеймера и связанной с ней деменции». [88] Аналогичным образом, белок ATM , участвующий в восстановлении ДНК и эпигенетических модификациях генома, положительно коррелирует с потерей нейронов в мозге больных болезнью Альцгеймера, что указывает на то, что этот белок является еще одним ключевым компонентом в неразрывно связанных процессах нейродегенерации, производства DSB и формирования памяти. [88]
Большинство повреждений можно устранить, не активируя систему реагирования на повреждения, однако более сложные повреждения активируют ATR и ATM, ключевые протеинкиназы в системе реагирования на повреждения. [92] Повреждение ДНК ингибирует M-CDK, которые являются ключевым компонентом перехода в митоз .
Во всех эукариотических клетках ATR и ATM являются протеинкиназами, которые обнаруживают повреждение ДНК. Они связываются с поврежденными участками ДНК и активируют Chk1 , Chk2 и, в клетках животных, p53 . Вместе эти белки составляют систему реагирования на повреждение ДНК. Некоторые повреждения ДНК не требуют привлечения ATR и ATM, только сложные и обширные повреждения требуют ATR и ATM. ATM и ATR требуются для NHEJ, HR, восстановления ICL и NER, а также стабильности репликативной вилки во время невозмущенной репликации ДНК и в ответ на блоки репликации. [2]
ATR рекрутируется для различных форм повреждений, таких как повреждение нуклеотидов, заторможенные репликационные вилки и двухцепочечные разрывы. ATM специально предназначен для ответа на повреждение при двухцепочечных разрывах. Комплекс MRN (состоящий из Mre11, Rad50 и Nbs1) формируется немедленно в месте двухцепочечного разрыва. Этот комплекс MRN рекрутирует ATM к месту повреждения. ATR и ATM фосфорилируют различные белки, которые участвуют в системе восстановления повреждений. Связывание ATR и ATM с поврежденными участками ДНК приводит к рекрутированию Chk1 и Chk2. Эти протеинкиназы посылают сигналы о повреждении в систему контроля клеточного цикла, чтобы задержать прогрессирование клеточного цикла. [13]
Chk1 приводит к выработке ферментов репарации ДНК. Chk2 приводит к обратимой остановке клеточного цикла. Chk2, как и ATR/ATM, может активировать p53, что приводит к постоянной остановке клеточного цикла или апоптозу.
Когда повреждений слишком много, запускается апоптоз, чтобы защитить организм от потенциально вредных клеток.7 p53, также известный как ген-супрессор опухолей, является основным регуляторным белком в системе реагирования на повреждение ДНК, который напрямую связывается с промоторами своих целевых генов. p53 действует в первую очередь на контрольной точке G1 (контролируя переход G1 в S), где он блокирует прогрессирование клеточного цикла. [7] Активация p53 может вызвать гибель клетки или постоянную остановку клеточного цикла. p53 также может активировать определенные пути восстановления, такие как NER. [92]
При отсутствии повреждения ДНК p53 регулируется Mdm2 и постоянно деградирует. При повреждении ДНК Mdm2 фосфорилируется, скорее всего, из-за ATM. Фосфорилирование Mdm2 приводит к снижению активности Mdm2, тем самым предотвращая деградацию p53. Нормальная, неповрежденная клетка обычно имеет низкие уровни p53, тогда как клетки, находящиеся в состоянии стресса и повреждения ДНК, будут иметь высокие уровни p53. [13]
p53 служит фактором транскрипции как для bax , проапоптотического белка, так и для p21 , ингибитора CDK. Ингибиторы CDK приводят к остановке клеточного цикла. Остановка клетки дает клетке время для восстановления повреждений, и если повреждения непоправимы, p53 привлекает bax для запуска апоптоза. [92]
p53 играет ключевую роль в росте раковых клеток. Поврежденные клетки ДНК с мутировавшим p53 имеют более высокий риск стать раковыми. Распространенные методы химиотерапии являются генотоксичными. Эти методы лечения неэффективны в отношении раковых опухолей с мутировавшим p53, поскольку у них нет функционирующего p53, который мог бы либо остановить, либо убить поврежденную клетку.
Одним из признаков того, что повреждения ДНК являются серьезной проблемой для жизни, является то, что процессы восстановления ДНК, справляющиеся с повреждениями ДНК, были обнаружены во всех клеточных организмах, в которых исследовалась репарация ДНК. Например, у бактерий регуляторная сеть, направленная на восстановление повреждений ДНК (называемая SOS-реакцией в Escherichia coli ), была обнаружена во многих видах бактерий. E. coli RecA, ключевой фермент в пути SOS-реакции, является определяющим членом повсеместного класса белков обмена цепями ДНК, которые необходимы для гомологичной рекомбинации, пути, который поддерживает целостность генома путем восстановления поврежденной ДНК. [93] Гены, гомологичные RecA и другим центральным генам в пути SOS-реакции, обнаружены почти во всех бактериальных геномах, секвенированных на сегодняшний день, охватывая большое количество типов, что предполагает как древнее происхождение, так и широкое распространение рекомбинационной репарации повреждений ДНК. [94] Эукариотические рекомбиназы, которые являются гомологами RecA, также широко распространены в эукариотических организмах. Например, у делящихся дрожжей и людей гомологи RecA способствуют дуплекс-дуплексному обмену цепями ДНК, необходимому для восстановления многих типов повреждений ДНК. [95] [96]
Другим признаком того, что повреждения ДНК являются серьезной проблемой для жизни, является то, что клетки вкладывают большие средства в процессы восстановления ДНК. Как указал Хоймейкерс, [4] восстановление только одного двухцепочечного разрыва может потребовать более 10 000 молекул АТФ , которые используются для сигнализации о наличии повреждения, генерации очагов восстановления и формирования (у людей) нуклеофиламента RAD51 (промежуточного звена в гомологичной рекомбинационной репарации). (RAD51 является гомологом бактериального RecA.) Если структурная модификация происходит во время фазы G1 репликации ДНК, контрольная точка G1-S останавливает или откладывает дальнейшее развитие клеточного цикла до того, как продукт войдет в фазу S. [1]
Дифференцированные соматические клетки взрослых млекопитающих обычно реплицируются редко или вообще не реплицируются. Такие клетки, включая, например, нейроны мозга и мышечные миоциты, имеют небольшой или нулевой оборот клеток. Нереплицирующиеся клетки обычно не генерируют мутации из-за ошибок репликации, вызванных повреждением ДНК. Эти нереплицирующиеся клетки обычно не вызывают рак, но они накапливают повреждения ДНК со временем, которые, вероятно, способствуют старению ( транскрибируемой цепи ДНК может блокировать транскрипцию, катализируемую РНК-полимеразой II. [97] Это будет мешать синтезу белка, кодируемого геном, в котором произошла блокировка.
). В нереплицирующейся клетке одноцепочечный разрыв или другой тип повреждения вBrasnjevic et al. [98] обобщили доказательства, показывающие, что одноцепочечные разрывы накапливаются с возрастом в мозге (хотя накопление различалось в разных областях мозга) и что одноцепочечные разрывы являются наиболее частыми устойчивыми повреждениями ДНК в мозге. Как обсуждалось выше, эти накопленные одноцепочечные разрывы, как ожидается, блокируют транскрипцию генов. В соответствии с этим, как было рассмотрено Hetman et al., [99] было идентифицировано 182 гена и показано, что они имеют сниженную транскрипцию в мозге людей старше 72 лет по сравнению с транскрипцией в мозге людей моложе 43 лет. Когда 40 конкретных белков были оценены в мышце крыс, большинство белков показали значительное снижение в процессе старения от 18 месяцев (взрослая крыса) до 30 месяцев (старая крыса). [100]
Другой тип повреждения ДНК, двухцепочечный разрыв, как было показано, вызывает гибель клеток (потерю клеток) через апоптоз . [101] Этот тип повреждения ДНК не будет накапливаться с возрастом, поскольку как только клетка погибнет через апоптоз, ее двухцепочечное повреждение исчезнет вместе с ней. Таким образом, поврежденные сегменты ДНК подрывают механизм репликации ДНК, поскольку эти измененные последовательности ДНК не могут быть использованы в качестве настоящих шаблонов для создания копий генетического материала. [1]
Когда ДНК повреждена, клетка реагирует различными способами, чтобы исправить повреждение и минимизировать последствия для клетки. Одним из таких ответов, особенно в эукариотических клетках, является задержка деления клетки — клетка останавливается на некоторое время в фазе G2, прежде чем перейти к остальной части клеточного цикла. Были проведены различные исследования, чтобы выяснить цель этой остановки G2, вызванной повреждением ДНК. Исследователи обнаружили, что клетки, которые преждевременно вытесняются из задержки, имеют более низкую жизнеспособность клеток и более высокие показатели поврежденных хромосом по сравнению с клетками, которые способны пройти полную остановку G2, что предполагает, что цель задержки — дать клетке время для восстановления поврежденных хромосом перед продолжением клеточного цикла. [102] Это обеспечивает правильное функционирование митоза.
Различные виды животных демонстрируют схожие механизмы клеточной задержки в ответ на повреждение ДНК, которое может быть вызвано воздействием рентгеновского излучения. Почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae были специально изучены, поскольку прогрессирование через клеточный цикл можно легко отследить с помощью ядерной морфологии. Изучая Saccharomyces cerevisiae , исследователи смогли узнать больше о генах, чувствительных к радиации (RAD), и о влиянии, которое мутации RAD могут оказывать на типичную реакцию задержки, вызванную повреждением клеточной ДНК. В частности, ген RAD9 играет решающую роль в обнаружении повреждения ДНК и остановке клетки в G2 до тех пор, пока повреждение не будет устранено.
Благодаря обширным экспериментам исследователи смогли пролить свет на роль, которую гены RAD играют в задержке деления клеток в ответ на повреждение ДНК. Когда растущие клетки дикого типа подвергаются воздействию различных уровней рентгеновского облучения в течение определенного периода времени, а затем анализируются с помощью анализа микроколоний , можно наблюдать различия в реакции клеточного цикла на основе того, какие гены мутируют в клетках. Например, в то время как необлученные клетки будут нормально проходить клеточный цикл, клетки, подвергшиеся рентгеновскому облучению, либо навсегда останавливаются (становятся нежизнеспособными), либо задерживаются в фазе G2, прежде чем продолжить деление в митозе, что еще раз подтверждает идею о том, что задержка G2 имеет решающее значение для восстановления ДНК. Однако штаммы rad, которые не способны к восстановлению ДНК, демонстрируют заметно иную реакцию. Например, клетки rad52, которые не могут восстанавливать двухцепочечные разрывы ДНК, имеют тенденцию навсегда останавливаться в G2 при воздействии даже очень низких уровней рентгеновского облучения и редко в конечном итоге проходят через более поздние стадии клеточного цикла. Это происходит потому, что клетки не могут восстановить повреждения ДНК и, таким образом, не входят в митоз. Различные другие мутанты rad демонстрируют схожие реакции при воздействии рентгеновского излучения.
Однако штамм rad9 демонстрирует совершенно другой эффект. Эти клетки не задерживаются в фазе G2 при воздействии рентгеновского облучения и в конечном итоге проходят через клеточный цикл без помех, прежде чем погибнуть. Это говорит о том, что ген RAD9, в отличие от других генов RAD, играет решающую роль в инициировании остановки G2. Для дальнейшего изучения этих результатов были проанализированы клеточные циклы штаммов с двойной мутацией. Мутантный штамм rad52 rad9, который является дефектным как в репарации ДНК, так и в остановке G2, не подвергается остановке клеточного цикла при воздействии рентгеновского облучения. Это говорит о том, что даже если повреждение ДНК не может быть восстановлено, если RAD9 отсутствует, клеточный цикл не будет задерживаться. Таким образом, невосстановленное повреждение ДНК является сигналом, который сообщает RAD9 остановить деление и остановить клеточный цикл в G2. Более того, существует дозозависимый ответ; По мере увеличения уровней рентгеновского облучения и последующего повреждения ДНК все больше клеток, независимо от имеющихся у них мутаций, останавливаются в фазе G2.
Другой и, возможно, более полезный способ визуализировать этот эффект — посмотреть на слайды фотомикроскопии. Первоначально слайды гаплоидных клеток RAD+ и rad9 в экспоненциальной фазе роста показывают простые, отдельные клетки, которые неотличимы друг от друга. Однако слайды выглядят совсем иначе после 10-часового воздействия рентгеновского излучения. Теперь слайды RAD+ показывают клетки RAD+, существующие в основном в виде двухпочковых микроколоний, что говорит о том, что деление клеток было остановлено. Напротив, слайды rad9 показывают клетки rad9, существующие в основном в виде 3–8 почковых колоний, и они кажутся меньше, чем клетки RAD+. Это еще одно доказательство того, что мутантные клетки RAD продолжали делиться и не обладают остановкой G2.
Однако есть доказательства того, что хотя ген RAD9 необходим для индуцирования остановки G2 в ответ на повреждение ДНК, давая клетке время на восстановление повреждения, на самом деле он не играет прямой роли в восстановлении ДНК. Когда клетки rad9 искусственно останавливаются в G2 с помощью MBC, яда микротрубочек, который предотвращает клеточное деление, а затем обрабатываются рентгеновским излучением, клетки способны восстанавливать свою ДНК и в конечном итоге продвигаться по клеточному циклу, разделяясь на жизнеспособные клетки. Таким образом, ген RAD9 не играет никакой роли в фактическом восстановлении поврежденной ДНК — он просто чувствует поврежденную ДНК и реагирует, задерживая деление клетки. Задержка, таким образом, опосредована механизмом контроля, а не физически поврежденной ДНК. [103]
С другой стороны, возможно, что существуют резервные механизмы, которые выполняют роль RAD9, когда он отсутствует. Фактически, некоторые исследования показали, что RAD9 действительно играет важную роль в восстановлении ДНК. В одном исследовании мутантные клетки rad9 и нормальные клетки в экспоненциальной фазе роста подвергались воздействию УФ-излучения и синхронизировались в определенных фазах клеточного цикла. После инкубации для восстановления ДНК степень димеризации пиримидина (которая является показателем повреждения ДНК) оценивалась с использованием чувствительных методов удлинения праймера. Было обнаружено, что удаление фотоповреждений ДНК было гораздо менее эффективным в мутантных клетках rad9, чем в нормальных клетках, что свидетельствует о том, что RAD9 участвует в восстановлении ДНК. Таким образом, роль RAD9 в восстановлении повреждений ДНК остается неясной. [104]
Независимо от этого, очевидно, что RAD9 необходим для обнаружения повреждения ДНК и остановки деления клеток. Предполагается, что RAD9 обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью, возможно, поэтому он играет роль в обнаружении повреждения ДНК. Когда ДНК повреждена, предполагается, что RAD9 образует комплекс с RAD1 и HUS1, и этот комплекс привлекается к местам повреждения ДНК. Именно таким образом RAD9 может оказывать свое действие.
Хотя функция RAD9 в первую очередь изучалась на почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae , многие механизмы контроля клеточного цикла схожи между видами. Таким образом, мы можем сделать вывод, что RAD9, вероятно, играет важную роль в реакции на повреждение ДНК и у людей.