stringtranslate.com

Производство белка

Центральная догма, описывающая транскрипцию кода ДНК в код РНК и далее в белки на втором этапе, охватывающем производство белка.
Центральная догма, описывающая транскрипцию кода ДНК в код РНК и далее в белки на втором этапе, охватывающем производство белка.

Производство белка — это биотехнологический процесс создания определенного белка . Обычно он достигается путем манипуляции экспрессией гена в организме таким образом, чтобы он экспрессировал большие количества рекомбинантного гена . Это включает в себя транскрипцию рекомбинантной ДНК в информационную РНК ( мРНК ), трансляцию мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в функциональные белки и могут быть направлены на определенные субклеточные или внеклеточные области. [1]

Системы производства белка (также известные как системы экспрессии ) используются в науках о жизни , биотехнологии и медицине . Молекулярно-биологические исследования используют многочисленные белки и ферменты, многие из которых получены из систем экспрессии; в частности, ДНК-полимераза для ПЦР , обратная транскриптаза для анализа РНК, эндонуклеазы рестрикции для клонирования и для создания белков, которые проверяются при разработке лекарств в качестве биологических мишеней или как сами потенциальные лекарства. Существуют также важные приложения для систем экспрессии в промышленной ферментации , в частности, в производстве биофармацевтических препаратов, таких как человеческий инсулин для лечения диабета , и для производства ферментов .

Системы производства белка

Обычно используемые системы производства белка включают те, которые получены из бактерий , [2] [3] дрожжей , [4] [5] бакуловирусов / насекомых , [6] клеток млекопитающих , [7] [8] и, в последнее время, нитчатых грибов, таких как Myceliophthora thermophila . [9] Когда биофармацевтические препараты производятся с помощью одной из этих систем, связанные с процессом примеси, называемые белками клетки-хозяина, также попадают в конечный продукт в следовых количествах. [10]

Системы на основе клеток

Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как « комбинация вектора экспрессии , его клонированной ДНК и хозяина для вектора, которые обеспечивают контекст, позволяющий чужеродному гену функционировать в клетке-хозяине, то есть производить белки на высоком уровне ». [11] [12] Сверхэкспрессия — это ненормально и чрезмерно высокий уровень экспрессии гена , который производит выраженный фенотип , связанный с геном . [13] [14] [ необходимо разъяснение ]

Существует множество способов введения чужеродной ДНК в клетку для экспрессии, и для экспрессии можно использовать множество различных клеток-хозяев — каждая система экспрессии имеет свои преимущества и недостатки. Системы экспрессии обычно называются хозяином и источником ДНК или механизмом доставки генетического материала. Например, распространенными хозяевами являются бактерии (такие как E. coli , B. subtilis ), дрожжи (такие как S. cerevisiae [5] ) или эукариотические клеточные линии . Распространенными источниками ДНК и механизмами доставки являются вирусы (такие как бакуловирус , ретровирус , аденовирус ), плазмиды , искусственные хромосомы и бактериофаг (такой как лямбда ). Лучшая система экспрессии зависит от задействованного гена , например, Saccharomyces cerevisiae часто предпочитают для белков, которые требуют значительной посттрансляционной модификации . Линии клеток насекомых или млекопитающих используются, когда требуется подобный человеческому сплайсинг мРНК. Тем не менее, бактериальная экспрессия имеет преимущество в том, что она позволяет легко производить большие количества белка, что необходимо для экспериментов с рентгеновской кристаллографией или ядерным магнитным резонансом для определения структуры.

Поскольку бактерии являются прокариотами , они не оснащены полным набором ферментативных механизмов для выполнения требуемых посттрансляционных модификаций или молекулярной укладки. Следовательно, многодоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде включений, которые трудно восстановить без жестких денатурантов и последующего громоздкого рефолдинга белков.

Для решения этих проблем были разработаны системы экспрессии с использованием нескольких эукариотических клеток для приложений, требующих, чтобы белки были конформны как в эукариотических организмах или ближе к ним: клетки растений (например, табака), насекомых или млекопитающих (например, крупного рогатого скота) трансфицируются генами и культивируются в суспензии и даже как ткани или целые организмы, чтобы производить полностью свернутые белки. Однако системы экспрессии млекопитающих in vivo имеют низкий выход и другие ограничения (затраты времени, токсичность для клеток-хозяев,..). Чтобы объединить высокую урожайность/продуктивность и масштабируемые белковые характеристики бактерий и дрожжей, а также передовые эпигенетические характеристики систем растений, насекомых и млекопитающих, разрабатываются другие системы производства белков с использованием одноклеточных эукариот (например, непатогенных клеток ' Leishmania ').

Бактериальные системы

Escherichia coli
E. coli — один из самых популярных хозяев для искусственной экспрессии генов.

E. coli является одним из наиболее широко используемых хозяев экспрессии, и ДНК обычно вводится в вектор экспрессии плазмиды . Методы сверхэкспрессии в E. coli хорошо разработаны и работают за счет увеличения числа копий гена или увеличения силы связывания промоутерной области, таким образом, способствуя транскрипции. [3]

Например, последовательность ДНК для интересующего белка может быть клонирована или субклонирована в плазмиду с большим числом копий, содержащую промотор lac (часто LacUV5 ), который затем трансформируется в бактерию E. coli . Добавление IPTG ( аналога лактозы ) активирует промотор lac и заставляет бактерию экспрессировать интересующий белок. [2]

Штаммы E. coli BL21 и BL21(DE3) — два штамма, которые обычно используются для производства белка. Как члены линии B, они лишены протеаз lon и OmpT , защищающих полученные белки от деградации. Профаг DE3, обнаруженный в BL21(DE3), обеспечивает РНК-полимеразу T7 (управляемую промотором LacUV5), что позволяет использовать векторы с промотором T7. [15]

Коринебактерии

Непатогенные виды грамположительных коринебактерий используются для коммерческого производства различных аминокислот. Вид C. glutamicum широко используется для производства глутамата и лизина , [16] компонентов человеческой пищи, кормов для животных и фармацевтических продуктов.

Экспрессия функционально активного человеческого эпидермального фактора роста была проведена в C. glutamicum , [17] таким образом, продемонстрировав потенциал для промышленного производства человеческих белков. Экспрессированные белки могут быть направлены на секрецию либо через общий секреторный путь (Sec), либо через путь транслокации двойного аргинина (Tat). [18]

В отличие от грамотрицательных бактерий , грамположительные коринебактерии не имеют липополисахаридов , которые действуют как антигенные эндотоксины у людей. [ необходима цитата ]

Pseudomonas флуоресцентная

Непатогенные и грамотрицательные бактерии Pseudomonas fluorescens используются для производства рекомбинантных белков на высоком уровне; обычно для разработки биотерапевтических препаратов и вакцин. P. fluorescens — это метаболически универсальный организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и быструю разработку сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и успешно производить высокие титры активного растворимого белка. [19]

Эукариотические системы

Дрожжи

Системы экспрессии, использующие либо S. cerevisiae , либо Pichia pastoris, обеспечивают стабильное и длительное производство белков, которые обрабатываются аналогично клеткам млекопитающих, с высоким выходом, в химически определенных средах белков. [4] [5]

Мицелиальные грибы

Мицелиальные грибы, особенно Aspergillus и Trichoderma , уже давно используются для производства разнообразных промышленных ферментов из их собственных геномов («нативные», «гомологичные») и из рекомбинантной ДНК («гетерологичные»). [9]

Совсем недавно Myceliophthora thermophila C1 была разработана в качестве платформы экспрессии для скрининга и производства нативных и гетерологичных белков. Система экспрессии C1 демонстрирует морфологию с низкой вязкостью в погруженной культуре, что позволяет использовать сложные среды роста и производства. C1 также не «гипергликозилирует» гетерологичные белки, как это обычно делают Aspergillus и Trichoderma . [9]

Бакуловирус-инфицированные клетки

Клетки насекомых, инфицированные бакуловирусом [20] ( штаммы Sf9 , Sf21 , High Five ) или клетки млекопитающих [21] ( HeLa , HEK 293 ), позволяют производить гликозилированные или мембранные белки, которые не могут быть получены с использованием грибковых или бактериальных систем. [20] [6] Это полезно для производства белков в больших количествах. Гены не экспрессируются непрерывно, поскольку инфицированные клетки-хозяева в конечном итоге лизируются и умирают во время каждого цикла инфекции. [22]

Нелитическая экспрессия клеток насекомых

Нелитическая экспрессия клеток насекомых является альтернативой литической системе экспрессии бакуловируса. При нелитической экспрессии векторы временно или стабильно трансфицируются в хромосомную ДНК клеток насекомых для последующей экспрессии генов. [23] [24] За этим следует отбор и скрининг рекомбинантных клонов. [25] Нелитическая система использовалась для получения более высокого выхода белка и более быстрой экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с экспрессией клеток, инфицированных бакуловирусом. [24] Клеточные линии, используемые для этой системы, включают: Sf9 , Sf21 из клеток Spodoptera frugiperda , Hi-5 из клеток Trichoplusia ni и клетки Schneider 2 и клетки Schneider 3 из клеток Drosophila melanogaster . [23] [25] С помощью этой системы клетки не лизируются, и можно использовать несколько режимов культивирования. [23] Кроме того, циклы производства белка воспроизводимы. [23] [24] Эта система дает однородный продукт. [24] Недостатком этой системы является необходимость дополнительного этапа скрининга для отбора жизнеспособных клонов . [25]

Экскавата

Системы экспрессии Leishmania tarentolae (не могут инфицировать млекопитающих) позволяют стабильно и долгосрочно производить белки с высоким выходом в химически определенных средах. Полученные белки демонстрируют полностью эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование и образование дисульфидных связей. [ необходима цитата ]

Системы млекопитающих

Наиболее распространенными системами экспрессии у млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (CHO) и эмбриональной почки человека (HEK). [26] [27] [28]

Бесклеточные системы

Бесклеточное производство белков осуществляется in vitro с использованием очищенной РНК-полимеразы, рибосом, тРНК и рибонуклеотидов. Эти реагенты могут быть получены путем экстракции из клеток или из клеточной системы экспрессии. Из-за низких уровней экспрессии и высокой стоимости бесклеточных систем, клеточные системы используются более широко. [29]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Грэслунд С., Нордлунд П., Вайгельт Дж., Холлберг Б.М., Брей Дж., Гилеади О. и др. (февраль 2008 г.). «Производство и очистка белков». Nature Methods . 5 (2): 135–46. doi :10.1038/nmeth.f.202. PMC  3178102. PMID  18235434 .
  2. ^ ab Baneyx F (октябрь 1999). "Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli". Current Opinion in Biotechnology . 10 (5): 411–21. doi :10.1016/s0958-1669(99)00003-8. PMID  10508629.
  3. ^ аб Розано, Герман; Чекарелли, Эдуардо (17 апреля 2014 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli: достижения и проблемы». Границы микробиологии . 5 : 172. дои : 10.3389/fmicb.2014.00172 . ПМК 4029002 . ПМИД  24860555. 
  4. ^ аб Крегг Дж. М., Черегино Дж. Л., Ши Дж., Хиггинс Д. Р. (сентябрь 2000 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Pichia Pastoris». Молекулярная биотехнология . 16 (1): 23–52. дои : 10.1385/МБ:16:1:23 . PMID  11098467. S2CID  35874864.
  5. ^ abc Malys N, Wishart JA, Oliver SG, McCarthy JE (2011). "Производство белка в Saccharomyces cerevisiae для системных биологических исследований". Методы в системной биологии . Методы в энзимологии. Т. 500. С. 197–212. doi :10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6. ISBN 9780123851185. PMID  21943899.
  6. ^ ab Kost TA, Condreay JP, Jarvis DL (май 2005 г.). «Бакуловирусы как универсальные векторы для экспрессии белков в клетках насекомых и млекопитающих». Nature Biotechnology . 23 (5): 567–75. doi :10.1038/nbt1095. PMC 3610534 . PMID  15877075. 
  7. ^ Россер MP, Ся W, Хартселл S, МакКаман M, Чжу Y, Ван S, Харви S, Брингманн P, Кобб RR (апрель 2005 г.). «Транзиентная трансфекция CHO-K1-S с использованием бессывороточной среды в суспензии: быстрая система экспрессии белков млекопитающих». Экспрессия и очистка белков . 40 (2): 237–43. doi :10.1016/j.pep.2004.07.015. PMID  15766864.
  8. ^ Лакнер А., Гента К., Коппенштайнер Х., Хербачек И., Хольцманн К., Шпигл-Крейнекер С., Бергер В., Груш М. (сентябрь 2008 г.). «Бицистронный бакуловирусный вектор для временной и стабильной экспрессии белка в клетках млекопитающих». Аналитическая биохимия . 380 (1): 146–8. дои : 10.1016/j.ab.2008.05.020. ПМИД  18541133.
  9. ^ abc Visser H, Joosten V, Punt PJ, Gusakov AV, Olson PT, Joosten R и др. (июнь 2011 г.). «Разработка зрелой грибковой технологии и производственной платформы для промышленных ферментов на основе изолята Myceliophthora thermophila, ранее известного как Chrysosporium lucknowense C1». Industrial Biotechnology . 7 (3): 214–223. doi :10.1089/ind.2011.7.214. Aspergillus и Trichoderma в настоящее время являются основными родами грибов, используемыми для производства промышленных ферментов.
  10. ^ Ван, Син; Хантер, Алан К.; Мозье, Нед М. (2009-06-15). «Белки клеток-хозяев в разработке биологических препаратов: идентификация, количественная оценка и оценка риска». Биотехнология и биоинженерия . 103 (3): 446–458. doi : 10.1002/bit.22304 . ISSN  0006-3592. PMID  19388135. S2CID  22707536.
  11. ^ "Определение: система выражения". Онлайновый медицинский словарь . Центр онкологического образования, Университет Ньюкасл-апон-Тайн: Cancerweb. 1997-11-13 . Получено 2008-06-10 .
  12. ^ "Система экспрессии - определение". Biology Online . Biology-Online.org. 2005-10-03 . Получено 2008-06-10 .
  13. ^ "сверхэкспрессия". Oxford Living Dictionary . Oxford University Press. 2017. Архивировано из оригинала 10 февраля 2018 г. Получено 18 мая 2017 г. Продукция аномально больших количеств вещества, которое кодируется определенным геном или группой генов; проявление в фенотипе в аномально высокой степени признака или эффекта, приписываемого определенному гену.
  14. ^ "overexpress". Словарь терминов, связанных с раком, NCI . Национальный институт рака при Национальных институтах здравоохранения. 2011-02-02 . Получено 18 мая 2017 г. overexpress В биологии — создавать слишком много копий белка или другого вещества. Сверхэкспрессия определенных белков или других веществ может играть роль в развитии рака.
  15. ^ Jeong, H; Barbe, V; Lee, CH; Vallenet, D; Yu, DS; Choi, SH; Couloux, A; Lee, SW; Yoon, SH; Cattolico, L; Hur, CG; Park, HS; Ségurens, B; Kim, SC; Oh, TK; Lenski, RE; Studier, FW; Daegelen, P; Kim, JF (11 декабря 2009 г.). "Последовательности геномов штаммов Escherichia coli B REL606 и BL21(DE3)". Журнал молекулярной биологии . 394 (4): 644–52. doi :10.1016/j.jmb.2009.09.052. PMID  19786035.
  16. ^ Brinkrolf K, Schröder J, Pühler A, Tauch A (сентябрь 2010 г.). «Транскрипционный регуляторный репертуар Corynebacterium glutamicum: реконструкция сети, контролирующей пути, вовлеченные в производство лизина и глутамата». Журнал биотехнологии . 149 (3): 173–82. doi :10.1016/j.jbiotec.2009.12.004. PMID  19963020.
  17. ^ Дата М, Итая Х, Мацуи Х, Кикучи Й (январь 2006 г.). «Секреция человеческого эпидермального фактора роста Corynebacterium glutamicum». Письма в прикладную микробиологию . 42 (1): 66–70. doi : 10.1111/j.1472-765x.2005.01802.x . PMID  16411922.
  18. ^ Meissner D, Vollstedt A, van Dijl JM, Freudl R (сентябрь 2007 г.). «Сравнительный анализ секреции белка, зависящего от двойного аргинина (Tat), гетерологичного модельного белка (GFP) в трех различных грамположительных бактериях». Applied Microbiology and Biotechnology . 76 (3): 633–42. doi :10.1007/s00253-007-0934-8. PMID  17453196. S2CID  6238466.
  19. ^ Retallack DM, Jin H, Chew L (февраль 2012 г.). «Надежное производство белка в системе экспрессии Pseudomonas fluorescens». Protein Expression and Purification . 81 (2): 157–65. doi :10.1016/j.pep.2011.09.010. PMID  21968453.
  20. ^ ab Altmann F, Staudacher E, Wilson IB, März L (февраль 1999). «Клетки насекомых как хозяева для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов». Glycoconjugate Journal . 16 (2): 109–23. doi :10.1023/A:1026488408951. PMID  10612411. S2CID  34863069.
  21. ^ Kost TA, Condreay JP (октябрь 1999 г.). «Рекомбинантные бакуловирусы как векторы экспрессии для клеток насекомых и млекопитающих». Current Opinion in Biotechnology . 10 (5): 428–33. doi :10.1016/S0958-1669(99)00005-1. PMID  10508635.
  22. ^ Yin J, Li G, Ren X, Herrler G (январь 2007 г.). «Выберите то, что вам нужно: сравнительная оценка преимуществ и ограничений часто используемых систем экспрессии для чужеродных генов». Журнал биотехнологии . 127 (3): 335–47. doi :10.1016/j.jbiotec.2006.07.012. PMID  16959350.
  23. ^ abcd Dyring, Charlotte (2011). «Оптимизация системы экспрессии S2 дрозофилы для производства терапевтических вакцин». BioProcessing Journal . 10 (2): 28–35. doi :10.12665/j102.dyring.
  24. ^ abcd Olczak M, Olczak T (декабрь 2006 г.). «Сравнение различных сигнальных пептидов для секреции белка в нелитической системе клеток насекомых». Аналитическая биохимия . 359 (1): 45–53. doi :10.1016/j.ab.2006.09.003. PMID  17046707.
  25. ^ abc McCarroll L, King LA (октябрь 1997 г.). "Стабильные культуры клеток насекомых для производства рекомбинантных белков". Current Opinion in Biotechnology . 8 (5): 590–4. doi :10.1016/s0958-1669(97)80034-1. PMID  9353223.
  26. ^ ab Zhu J (2012-09-01). "Экспрессия белка в клетках млекопитающих для биофармацевтического производства". Biotechnology Advances . 30 (5): 1158–70. doi :10.1016/j.biotechadv.2011.08.022. PMID  21968146.
  27. ^ abcd Almo SC, Love JD (июнь 2014 г.). «Лучше и быстрее: улучшения и оптимизация для производства рекомбинантных белков млекопитающих». Current Opinion in Structural Biology . Новые конструкции и экспрессия белков / Последовательности и топология. 26 : 39–43. doi :10.1016/j.sbi.2014.03.006. PMC 4766836 . PMID  24721463. 
  28. ^ Хакер DL, Баласубраманян S (июнь 2016 г.). «Производство рекомбинантного белка из стабильных линий и пулов клеток млекопитающих». Current Opinion in Structural Biology . Новые конструкции и экспрессия белков • Последовательности и топология. 38 : 129–36. doi :10.1016/j.sbi.2016.06.005. PMID  27322762.
  29. ^ Rosenblum G, Cooperman BS (январь 2014). «Двигатель из шасси: бесклеточный синтез белка и его применение». FEBS Letters . 588 (2): 261–8. Bibcode : 2014FEBSL.588..261R. doi : 10.1016/j.febslet.2013.10.016. PMC 4133780. PMID  24161673 . 

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
производстве белка
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках