stringtranslate.com

Производство белка

Центральная догма, изображающая транскрипцию кода ДНК в код РНК и белков на втором этапе, охватывающем производство белка.
Центральная догма , изображающая транскрипцию кода ДНК в код РНК и белков на втором этапе, охватывающем производство белка.

Производство белка — это биотехнологический процесс создания определенного белка . Обычно этого достигают путем манипулирования экспрессией генов в организме таким образом, чтобы он экспрессировал большое количество рекомбинантного гена . Это включает транскрипцию рекомбинантной ДНК в информационную РНК ( мРНК ), трансляцию мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге сворачиваются в функциональные белки и могут быть направлены в определенные субклеточные или внеклеточные места. [1]

Системы производства белка (также известные как системы экспрессии ) используются в науках о жизни , биотехнологии и медицине . В исследованиях молекулярной биологии используются многочисленные белки и ферменты, многие из которых происходят из систем экспрессии; в частности, ДНК-полимераза для ПЦР , обратная транскриптаза для анализа РНК, эндонуклеазы рестрикции для клонирования и для создания белков, которые проверяются при открытии лекарств, в качестве биологических мишеней или самих потенциальных лекарств. Существуют также важные применения систем экспрессии в промышленной ферментации , в частности, в производстве биофармацевтических препаратов , таких как человеческий инсулин , для лечения диабета и производства ферментов .

Системы производства белка

Обычно используемые системы производства белка включают системы, полученные из бактерий , [2] [3] дрожжей , [4] [5] бакуловирусов / насекомых , [6] клеток млекопитающих , [7] [8] и, в последнее время, нитчатых грибов, таких как Myceliophthora thermophila. . [9] Когда биофармацевтические препараты производятся с использованием одной из этих систем, связанные с процессом примеси, называемые белками клеток-хозяев, также попадают в конечный продукт в следовых количествах. [10]

Клеточные системы

Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как « комбинация вектора экспрессии , его клонированной ДНК и хозяина для вектора, которая обеспечивает контекст, позволяющий функционировать чужеродному гену в клетке-хозяине, что то есть производить белки на высоком уровне ». [11] [12] Сверхэкспрессия — это аномально и чрезмерно высокий уровень экспрессии генов , который приводит к выраженному фенотипу , связанному с геном . [13] [14] [ нужны разъяснения ]

Существует множество способов введения чужеродной ДНК в клетку для экспрессии, и для экспрессии можно использовать множество различных клеток-хозяев — каждая система экспрессии имеет определенные преимущества и недостатки. Системы экспрессии обычно обозначаются хозяином и источником ДНК или механизмом доставки генетического материала. Например, обычными хозяевами являются бактерии (такие как E. coli , B. subtilis ), дрожжи (такие как S. cerevisiae [5] ) или эукариотические клеточные линии . Обычными источниками ДНК и механизмами доставки являются вирусы (например, бакуловирус , ретровирус , аденовирус ), плазмиды , искусственные хромосомы и бактериофаг (например, лямбда ). Лучшая система экспрессии зависит от задействованного гена , например, Saccharomyces cerevisiae часто предпочтительнее для белков, требующих значительной посттрансляционной модификации . Линии клеток насекомых или млекопитающих используются, когда требуется сплайсинг мРНК, подобный человеческому. Тем не менее, бактериальная экспрессия имеет то преимущество, что позволяет легко производить большие количества белка, что необходимо для рентгеновской кристаллографии или экспериментов по ядерному магнитному резонансу для определения структуры.

Поскольку бактерии являются прокариотами , они не оснащены полным ферментативным механизмом для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного сворачивания. Следовательно, мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые трудно восстановить без жестких денатурирующих средств и последующего трудоемкого рефолдинга белков.

Чтобы решить эти проблемы, были разработаны системы экспрессии с использованием нескольких эукариотических клеток для приложений, требующих, чтобы белки были конформированы, как в эукариотических организмах, или близки к ним: клетки растений (например, табака), насекомых или млекопитающих (например, крупного рогатого скота) трансфицируются генами и культивируют в суспензии и даже в виде тканей или целых организмов для получения полностью свернутых белков. Однако системы экспрессии in vivo у млекопитающих имеют низкий выход и другие ограничения (затраты времени, токсичность для клеток-хозяев и т. д.). Чтобы объединить высокую урожайность/продуктивность и масштабируемые белковые свойства бактерий и дрожжей, а также передовые эпигенетические особенности систем растений, насекомых и млекопитающих, разрабатываются другие системы производства белка с использованием одноклеточных эукариотов (т.е. непатогенных клеток Leishmania ).

Бактериальные системы

кишечная палочка
E. coli — один из самых популярных хозяев для искусственной экспрессии генов.

E. coli является одним из наиболее широко используемых хозяев экспрессии, и ДНК обычно вводят в плазмидный вектор экспрессии. Методы сверхэкспрессии в E. coli хорошо разработаны и работают за счет увеличения количества копий гена или увеличения силы связывания промоторной области, что способствует транскрипции. [3]

Например, последовательность ДНК интересующего белка может быть клонирована или субклонирована в плазмиду с высоким числом копий, содержащую промотор lac (часто LacUV5 ), которая затем трансформируется в бактерию E. coli . Добавление IPTG ( аналога лактозы ) активирует lac-промотор и заставляет бактерии экспрессировать интересующий белок. [2]

Штаммы E. coli BL21 и BL21(DE3) — это два штамма, обычно используемые для производства белка. Как представители линии B, у них отсутствуют протеазы lon и OmpT , защищающие продуцируемые белки от деградации. Профаг DE3, обнаруженный в BL21 (DE3), обеспечивает РНК-полимеразу T7 (управляемую промотором LacUV5), что позволяет вместо этого использовать векторы с промотором T7. [15]

Коринебактерия

Непатогенные виды грамположительных коринебактерий используются для коммерческого производства различных аминокислот. Вид C.lutamicum широко используется для производства глутамата и лизина , [16] компонентов пищевых продуктов для человека, кормов для животных и фармацевтических продуктов.

Экспрессия функционально активного эпидермального фактора роста человека была осуществлена ​​в C. glutamicum [17] , что продемонстрировало потенциал промышленного производства белков человека. Экспрессированные белки могут быть нацелены на секрецию либо по общему секреторному пути (Sec), либо по пути транслокации двойного аргинина (Tat). [18]

В отличие от грамотрицательных бактерий , грамположительные Corynebacterium лишены липополисахаридов , которые действуют как антигенные эндотоксины у человека. [ нужна цитата ]

Псевдомонада флюоресценс

Непатогенные и грамотрицательные бактерии Pseudomonas fluorescens используются для получения высокого уровня рекомбинантных белков; обычно для разработки биотерапевтических препаратов и вакцин. P. fluorescens представляет собой метаболически универсальный организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и быструю разработку сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и успешно производить высокие титры активного растворимого белка. [19]

Эукариотические системы

Дрожжи

Системы экспрессии с использованием S. cerevisiae или Pichia Pastoris обеспечивают стабильное и длительное производство белков, которые обрабатываются аналогично клеткам млекопитающих, с высоким выходом в химически определенной среде белков. [4] [5]

Нитчатые грибы

Нитчатые грибы, особенно Aspergillus и Trichoderma , издавна используются для получения разнообразных промышленных ферментов из собственных геномов («нативные», «гомологичные») и из рекомбинантной ДНК («гетерологичные»). [9]

Совсем недавно Myceliophthora thermophila C1 была разработана в качестве платформы экспрессии для скрининга и производства нативных и гетерологичных белков. Система экспрессии C1 демонстрирует морфологию низкой вязкости в погруженной культуре, что позволяет использовать сложные среды для выращивания и продукции. C1 также не «гипергликозилирует» гетерологичные белки, как это обычно делают Aspergillus и Trichoderma . [9]

Клетки, инфицированные бакуловирусом

Инфицированные бакуловирусом клетки насекомых [20] ( штаммы Sf9 , Sf21 , High Five ) или клетки млекопитающих [21] ( HeLa , HEK 293 ) позволяют производить гликозилированные или мембранные белки, которые невозможно получить с использованием грибковых или бактериальных систем. [20] [6] Он полезен для производства белков в больших количествах. Гены не экспрессируются непрерывно, поскольку инфицированные клетки-хозяева в конечном итоге лизуются и умирают во время каждого цикла заражения. [22]

Нелитическая экспрессия клеток насекомых

Нелитическая экспрессия клеток насекомых является альтернативой литической системе экспрессии бакуловируса. При нелитической экспрессии векторы временно или стабильно трансфицируются в хромосомную ДНК клеток насекомых для последующей экспрессии генов. [23] [24] За этим следует отбор и скрининг рекомбинантных клонов. [25] Нелитическая система использовалась для обеспечения более высокого выхода белка и более быстрой экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с экспрессией клеток, инфицированных бакуловирусом. [24] Клеточные линии, используемые для этой системы, включают: Sf9 , Sf21 из клеток Spodoptera frugiperda , Hi-5 из клеток Trichoplusia ni , а также клетки Шнайдера 2 и клетки Шнайдера 3 из клеток Drosophila melanogaster . [23] [25] В этой системе клетки не лизируются, и можно использовать несколько режимов культивирования. [23] Кроме того, циклы производства белка воспроизводимы. [23] [24] Эта система дает однородный продукт. [24] Недостатком этой системы является необходимость дополнительного этапа скрининга для отбора жизнеспособных клонов . [25]

Раскопки

Системы экспрессии Leishmania tarentolae (не могут инфицировать млекопитающих) обеспечивают стабильное и длительное производство белков с высоким выходом в химически определенных средах. Полученные белки демонстрируют полностью эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование и образование дисульфидных связей. [ нужна цитата ]

Системы млекопитающих

Наиболее распространенными системами экспрессии у млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (CHO) и клетки эмбриональной почки человека (HEK). [26] [27] [28]

Бесклеточные системы

Бесклеточное производство белков осуществляется in vitro с использованием очищенной РНК-полимеразы, рибосом, тРНК и рибонуклеотидов. Эти реагенты могут быть получены экстракцией из клеток или из клеточной системы экспрессии. Из-за низкого уровня экспрессии и высокой стоимости бесклеточных систем более широко используются клеточные системы. [29]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Греслунд С., Нордлунд П., Вайгельт Дж., Холлберг Б.М., Брэй Дж., Гилеади О. и др. (февраль 2008 г.). «Производство и очистка белка». Природные методы . 5 (2): 135–46. doi :10.1038/nmeth.f.202. ПМК  3178102 . ПМИД  18235434.
  2. ^ ab Baneyx F (октябрь 1999 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli». Современное мнение в области биотехнологии . 10 (5): 411–21. дои : 10.1016/s0958-1669(99)00003-8. ПМИД  10508629.
  3. ^ аб Розано, Герман; Чеккарелли, Эдуардо (17 апреля 2014 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Escherichia coli: достижения и проблемы». Границы микробиологии . 5 : 172. дои : 10.3389/fmicb.2014.00172 . ПМК 4029002 . ПМИД  24860555. 
  4. ^ аб Крегг Дж. М., Черегино Дж. Л., Ши Дж., Хиггинс Д. Р. (сентябрь 2000 г.). «Экспрессия рекомбинантного белка в Pichia Pastoris». Молекулярная биотехнология . 16 (1): 23–52. дои : 10.1385/МБ:16:1:23 . PMID  11098467. S2CID  35874864.
  5. ^ abc Малис Н., Уишарт Дж.А., Оливер С.Г., Маккарти Дж.Э. (2011). «Продуцирование белка в Saccharomyces cerevisiae для исследований системной биологии». Методы системной биологии . Методы энзимологии. Том. 500. стр. 197–212. дои : 10.1016/B978-0-12-385118-5.00011-6. ISBN 9780123851185. ПМИД  21943899.
  6. ^ аб Кост Т.А., Кондри Дж.П., Джарвис Д.Л. (май 2005 г.). «Бакуловирус как универсальные векторы для экспрессии белков в клетках насекомых и млекопитающих». Природная биотехнология . 23 (5): 567–75. дои : 10.1038/nbt1095. ПМЦ 3610534 . ПМИД  15877075. 
  7. ^ Россер М.П., ​​Ся В., Хартселл С., Маккаман М., Чжу Ю., Ван С., Харви С., Брингманн П., Кобб Р.Р. (апрель 2005 г.). «Транзиторная трансфекция CHO-K1-S с использованием бессывороточной среды в суспензии: система быстрой экспрессии белков млекопитающих». Экспрессия и очистка белков . 40 (2): 237–43. дои : 10.1016/j.pep.2004.07.015. ПМИД  15766864.
  8. ^ Лакнер А., Гента К., Коппенштайнер Х., Хербачек И., Хольцманн К., Шпигл-Крейнекер С., Бергер В., Груш М. (сентябрь 2008 г.). «Бицистронный бакуловирусный вектор для временной и стабильной экспрессии белка в клетках млекопитающих». Аналитическая биохимия . 380 (1): 146–8. дои : 10.1016/j.ab.2008.05.020. ПМИД  18541133.
  9. ^ abc Виссер Х., Йоостен В., Пунт П.Дж., Гусаков А.В., Олсон П.Т., Йостен Р. и др. (июнь 2011 г.). «Разработка зрелой грибковой технологии и платформы для производства промышленных ферментов на основе изолята Myceliophthora thermophila, ранее известного как Chrysosporium Lucnowense C1». Промышленная биотехнология . 7 (3): 214–223. дои : 10.1089/инд.2011.7.214. Aspergillus и Trichoderma в настоящее время являются основными родами грибов, используемых для производства промышленных ферментов.
  10. ^ Ван, Син; Хантер, Алан К.; Мозье, Нед М. (15 июня 2009 г.). «Белки клеток-хозяев в разработке биологических препаратов: идентификация, количественный анализ и оценка риска». Биотехнология и биоинженерия . 103 (3): 446–458. дои : 10.1002/бит.22304 . ISSN  0006-3592. PMID  19388135. S2CID  22707536.
  11. ^ «Определение: система выражений» . Интернет-медицинский словарь . Центр онкологического образования, Университет Ньюкасла-апон-Тайн: Cancerweb. 13 ноября 1997 г. Проверено 10 июня 2008 г.
  12. ^ «Система выражения - определение». Биология онлайн . Биология-Online.org. 03.10.2005 . Проверено 10 июня 2008 г.
  13. ^ «чрезмерное выражение». Оксфордский живой словарь . Издательство Оксфордского университета. 2017. Архивировано из оригинала 10 февраля 2018 года . Проверено 18 мая 2017 г. Производство аномально большого количества вещества, кодируемого определенным геном или группой генов; появление в фенотипе в аномально высокой степени признака или эффекта, приписываемого определенному гену.
  14. ^ «Сверхэкспрессия». Словарь терминов, посвященных раку, NCI . Национальный институт рака при Национальных институтах здравоохранения. 2 февраля 2011 г. Проверено 18 мая 2017 г. сверхэкспрессировать. В биологии — создавать слишком много копий белка или другого вещества. Сверхэкспрессия определенных белков или других веществ может играть роль в развитии рака.
  15. ^ Чон, Х; Барбе, В; Ли, Швейцария; Валлене, Д; Ю, Д.С.; Чой, С.Х.; Кулу, А; Ли, Юго-Запад; Юн, Ш.; Каттолико, Л; Хур, КГ; Парк, HS; Сегуранс, Б; Ким, Южная Каролина; О, ТК; Ленский, Р.Э.; Стьюдер, ФРВ; Дэгелен, П; Ким, Дж. Ф. (11 декабря 2009 г.). «Последовательности генома штаммов Escherichia coli B REL606 и BL21 (DE3)». Журнал молекулярной биологии . 394 (4): 644–52. дои : 10.1016/j.jmb.2009.09.052. ПМИД  19786035.
  16. ^ Бринкрольф К., Шредер Дж., Пюлер А., Таух А. (сентябрь 2010 г.). «Регуляторный репертуар транскрипции Corynebacterium Glutamicum: реконструкция сети, контролирующей пути, участвующие в производстве лизина и глутамата». Журнал биотехнологии . 149 (3): 173–82. doi : 10.1016/j.jbiotec.2009.12.004. ПМИД  19963020.
  17. ^ Дате М, Итая Х, Мацуи Х, Кикучи Ю (январь 2006 г.). «Секреция эпидермального фактора роста человека Corynebacterium glutamicum». Письма по прикладной микробиологии . 42 (1): 66–70. дои : 10.1111/j.1472-765x.2005.01802.x . ПМИД  16411922.
  18. ^ Мейснер Д., Фоллштедт А., ван Дийл Дж. М., Фрейдл Р. (сентябрь 2007 г.). «Сравнительный анализ твин-аргинин (Tat)-зависимой секреции белка гетерологичного модельного белка (GFP) у трех различных грамположительных бактерий». Прикладная микробиология и биотехнология . 76 (3): 633–42. дои : 10.1007/s00253-007-0934-8. PMID  17453196. S2CID  6238466.
  19. ^ Retallack DM, Джин Х, Чу Л (февраль 2012 г.). «Надежное производство белка в системе экспрессии Pseudomonas fluorescens». Экспрессия и очистка белков . 81 (2): 157–65. дои : 10.1016/j.pep.2011.09.010. ПМИД  21968453.
  20. ^ ab Альтманн Ф., Штаудахер Э., Уилсон И.Б., Мерц Л. (февраль 1999 г.). «Клетки насекомых как хозяева для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов». Гликоконъюгатный журнал . 16 (2): 109–23. дои : 10.1023/А: 1026488408951. PMID  10612411. S2CID  34863069.
  21. ^ Кост Т.А., Кондри Дж.П. (октябрь 1999 г.). «Рекомбинантные бакуловирусы как векторы экспрессии для клеток насекомых и млекопитающих». Современное мнение в области биотехнологии . 10 (5): 428–33. дои : 10.1016/S0958-1669(99)00005-1. ПМИД  10508635.
  22. ^ Инь Дж, Ли Г, Рен Икс, Херрлер Г (январь 2007 г.). «Выберите то, что вам нужно: сравнительная оценка преимуществ и ограничений часто используемых систем экспрессии чужеродных генов». Журнал биотехнологии . 127 (3): 335–47. doi : 10.1016/j.jbiotec.2006.07.012. ПМИД  16959350.
  23. ^ abcd Дайринг, Шарлотта (2011). «Оптимизация системы экспрессии S2 дрозофилы для производства терапевтических вакцин». Журнал биообработки . 10 (2): 28–35. дои : 10.12665/j102.dyring.
  24. ^ abcd Ольчак М, Ольчак Т (декабрь 2006 г.). «Сравнение различных сигнальных пептидов для секреции белков в нелитической системе клеток насекомых». Аналитическая биохимия . 359 (1): 45–53. дои : 10.1016/j.ab.2006.09.003. ПМИД  17046707.
  25. ^ abc МакКэрролл Л., Кинг Лос-Анджелес (октябрь 1997 г.). «Стабильные культуры клеток насекомых для производства рекомбинантных белков». Современное мнение в области биотехнологии . 8 (5): 590–4. дои : 10.1016/s0958-1669(97)80034-1. ПМИД  9353223.
  26. ^ Аб Чжу Дж (01 сентября 2012 г.). «Экспрессия белков клеток млекопитающих для биофармацевтического производства». Достижения биотехнологии . 30 (5): 1158–70. doi :10.1016/j.biotechadv.2011.08.022. ПМИД  21968146.
  27. ^ abcd Almo SC, Love JD (июнь 2014 г.). «Лучше и быстрее: улучшения и оптимизация производства рекомбинантного белка млекопитающих». Современное мнение в области структурной биологии . Новые конструкции и экспрессия белков / Последовательности и топология. 26 : 39–43. дои : 10.1016/j.sbi.2014.03.006. ПМЦ 4766836 . ПМИД  24721463. 
  28. ^ Хакер Д.Л., Баласубраманиан С. (июнь 2016 г.). «Производство рекомбинантного белка из стабильных линий и пулов клеток млекопитающих». Современное мнение в области структурной биологии . Новые конструкции и экспрессия белков • Последовательности и топология. 38 : 129–36. doi :10.1016/j.sbi.2016.06.005. ПМИД  27322762.
  29. ^ Розенблюм Г., Куперман Б.С. (январь 2014 г.). «Двигатель вне шасси: бесклеточный синтез белка и его использование». Письма ФЭБС . 588 (2): 261–8. doi :10.1016/j.febslet.2013.10.016. ПМК 4133780 . ПМИД  24161673. 

дальнейшее чтение

Внешние ссылки

Библиотечные ресурсы о
производстве белка
  • Ресурсы в вашей библиотеке
  • Ресурсы в других библиотеках