Фосфолипаза C ( PLC ) — это класс мембрано-ассоциированных ферментов , которые расщепляют фосфолипиды непосредственно перед фосфатной группой (см. рисунок). Чаще всего его считают синонимом человеческих форм этого фермента, которые играют важную роль в физиологии эукариотических клеток , в частности, в путях передачи сигнала . Роль фосфолипазы C в передаче сигнала заключается в расщеплении фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PIP 2 ) на диацилглицерол (DAG) и инозитол-1,4,5-трифосфат (IP 3 ), которые служат вторичными мессенджерами . Активаторы каждого PLC различаются, но обычно включают гетеротримерные субъединицы G-белка, протеинтирозинкиназы , малые G-белки , Ca 2+ и фосфолипиды. [1]
Существует тринадцать видов млекопитающих фосфолипазы C, которые классифицируются на шесть изотипов (β, γ, δ, ε, ζ, η) в соответствии со структурой. Каждый PLC имеет уникальный и перекрывающийся контроль над экспрессией и субклеточным распределением. Однако PLC не ограничивается млекопитающими и присутствует также в бактериях и Chromadorea.
Обширное число функций, выполняемых реакцией PLC, требует, чтобы она строго регулировалась и могла реагировать на множественные внеклеточные и внутриклеточные входы с соответствующей кинетикой. Эта потребность направляла эволюцию шести изотипов PLC у животных, каждый из которых имеет свой собственный режим регуляции. Пре-мРНК PLC также может подвергаться дифференциальному сплайсингу, так что у млекопитающего может быть до 30 ферментов PLC. [2]
Большинство бактериальных вариантов фосфолипазы C характеризуются как одна из четырех групп структурно родственных белков. Токсичные фосфолипазы C способны взаимодействовать с мембранами эукариотических клеток и гидролизовать фосфатидилхолин и сфингомиелин, что приводит к лизису клеток. [3]
Класс Chromadorea также использует фермент фосфолипазу C для регулирования высвобождения кальция. Фермент высвобождает инозитол 1,4,5-трифосфат (IP3) , который обозначает сигнальный путь, участвующий в активации овуляции, продвижении ооцита в сперматеку. Этот ген участвует в различных видах деятельности, таких как контроль ГТФазы, расщепление определенных молекул и связывание с малой ГТФазой. Он помогает бороться с бактериями и регулировать движение белков в клетках. Он обнаружен в выделительной системе, кишечнике, нервах и репродуктивных органах. Экспрессия фермента в сперматеке контролируется факторами транскрипции FOS-1 и JUN-1. [4]
У млекопитающих PLC имеют общую консервативную структуру ядра и отличаются другими доменами, специфичными для каждого семейства. Основной фермент включает в себя ствол расщепленной триозофосфатизомеразы (TIM) , домен гомологии плекстрина (PH) , четыре тандемных домена EF hand и домен C2 . [1] Ствол TIM содержит активный сайт, все каталитические остатки и сайт связывания Ca 2+ . Он имеет аутоингибиторную вставку, которая прерывает его активность, называемую линкером XY. Было показано, что линкер XY закрывает активный сайт, и при его удалении активируется PLC. [5]
Гены, кодирующие альфа-токсин ( Clostridium perfringens ) , Bacillus cereus PLC (BC-PLC) и PLC из Clostridium bifermentans и Listeria monocytogenes, были выделены, а нуклеотиды секвенированы. Последовательности имеют значительную гомологию, приблизительно 250 остатков, от N-конца. Альфа-токсин имеет дополнительные 120 остатков в C-конце. C-конец альфа-токсина был описан как «C2-подобный» домен, ссылаясь на домен C2, обнаруженный у эукариот, которые участвуют в передаче сигнала и присутствуют в фосфоинозитидной фосфолипазе C млекопитающих . [6]
Первичная катализируемая реакция PLC происходит на нерастворимом субстрате на границе раздела липид-вода. Остатки в активном центре сохраняются во всех изотипах PLC. У животных PLC селективно катализирует гидролиз фосфолипида фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата (PIP 2 ) на глицериновой стороне фосфодиэфирной связи. Происходит образование слабо связанного с ферментом промежуточного продукта, инозитол 1,2-циклического фосфодиэфира, и высвобождение диацилглицерина (DAG) . Затем промежуточный продукт гидролизуется до инозитол 1,4,5-трифосфата (IP 3 ) . [7] Таким образом, двумя конечными продуктами являются DAG и IP 3 . Кислотно-основной катализ требует двух консервативных остатков гистидина, а для гидролиза PIP 2 необходим ион Ca 2+ . Было отмечено, что активный центр Ca 2+ координируется с четырьмя кислотными остатками, и если какой-либо из остатков мутирует, то для катализа необходима большая концентрация Ca 2+ . [8]
Фосфоинозитид-специфическая фосфолипаза C (PLC) играет ключевую роль в процессах передачи сигналов в клетках. Когда клетки сталкиваются с сигналами, такими как гормоны или факторы роста, PLC расщепляет молекулу PIP2, чтобы произвести новые сигнальные молекулы. PIP2 — это тип молекулы, обнаруженной в клеточных мембранах. Когда клетки получают определенные сигналы извне, фермент PLC расщепляет PIP2 на более мелкие молекулы, которые затем отправляют сообщения внутри клетки. Различные типы PLC активируются по-разному, способствуя способности клеток реагировать на свое окружение.
Рецепторы, активирующие этот путь, в основном представляют собой рецепторы , сопряженные с G-белком, которые связаны с субъединицей Gαq , в том числе:
Другими, второстепенными активаторами, чем G αq, являются:
PLC расщепляет фосфолипид фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP 2 ) на диацилглицерол (DAG) и инозитол 1,4,5-трифосфат (IP 3 ). Таким образом, PLC оказывает глубокое влияние на истощение PIP 2 , который действует как мембранный якорь или аллостерический регулятор и агонист для многих липид-зависимых ионных каналов . [21] [22] PIP 2 также действует как субстрат для синтеза более редкого липида фосфатидилинозитол 3,4,5-трифосфата (PIP 3 ) , который отвечает за передачу сигналов во многих реакциях. [23] Следовательно, истощение PIP 2 реакцией PLC имеет решающее значение для регуляции локальных концентраций PIP 3 как в плазматической мембране, так и в ядерной мембране.
Два продукта реакции, катализируемой PLC, DAG и IP 3 , являются важными вторичными мессенджерами, которые контролируют разнообразные клеточные процессы и являются субстратами для синтеза других важных сигнальных молекул. Когда PIP 2 расщепляется, DAG остается связанным с мембраной, а IP 3 высвобождается в виде растворимой структуры в цитозоль . Затем IP 3 диффундирует через цитозоль, чтобы связаться с рецепторами IP 3 , в частности, с кальциевыми каналами в гладком эндоплазматическом ретикулуме (ER). Это приводит к увеличению цитозольной концентрации кальция, вызывая каскад внутриклеточных изменений и активности. [24] Кроме того, кальций и DAG вместе работают над активацией протеинкиназы C , которая затем фосфорилирует другие молекулы, что приводит к изменению клеточной активности. [24] Конечные эффекты включают вкус, стимулирование опухоли, а также экзоцитоз везикул, выработку супероксида из НАДФН-оксидазы и активацию JNK . [24] [25]
И DAG, и IP 3 являются субстратами для синтеза регуляторных молекул. DAG является субстратом для синтеза фосфатидной кислоты , регуляторной молекулы. IP 3 является лимитирующим скорость субстратом для синтеза полифосфатов инозитола, которые стимулируют множественные протеинкиназы, транскрипцию и процессинг мРНК. [26] Таким образом, регуляция активности PLC жизненно важна для координации и регуляции других ферментов путей, которые играют центральную роль в контроле клеточной физиологии.
Кроме того, фосфолипаза C играет важную роль в пути воспаления. Связывание агонистов, таких как тромбин , адреналин или коллаген , с рецепторами поверхности тромбоцитов может вызвать активацию фосфолипазы C для катализа высвобождения арахидоновой кислоты из двух основных мембранных фосфолипидов, фосфатидилинозитола и фосфатидилхолина . Затем арахидоновая кислота может перейти в циклооксигеназный путь (продуцирующий простогландины (PGE1, PGE2, PGF2), простациклины (PGI2) или тромбоксаны (TXA2)) и липоксигеназный путь (продуцирующий лейкотриены (LTB4, LTC4, LTD4, LTE4)). [27]
Бактериальный вариант Clostridium perfringens типа A продуцирует альфа-токсин. Токсин обладает активностью фосфолипазы C и вызывает гемолиз , летальность и дермонекроз. При высоких концентрациях альфа-токсин вызывает массивную деградацию фосфатидилхолина и сфингомиелина , производя диацилглицерол и церамид соответственно. Затем эти молекулы участвуют в путях передачи сигнала. [6] Сообщалось, что токсин активирует каскад арахидоновой кислоты в изолированной аорте крысы. [28] Сокращение, вызванное токсином, было связано с образованием тромбоксана A 2 из арахидоновой кислоты. Таким образом, вероятно, что бактериальный PLC имитирует действия эндогенного PLC в мембранах эукариотических клеток.