Протеин C , также известный как аутопротромбин IIA и фактор свертывания крови XIV , [5] : 6822 [6] является зимогеном , то есть неактивным ферментом. Активированная форма играет важную роль в регуляции антикоагуляции , воспаления и гибели клеток , а также в поддержании проницаемости стенок кровеносных сосудов у людей и других животных. Активированный белок C ( APC ) выполняет эти операции в первую очередь путем протеолитической инактивации белков Factor V a и Factor VIII a . APC классифицируется как сериновая протеаза , поскольку содержит остаток серина в своем активном центре . [7] : 35 У людей белок C кодируется геном PROC , который находится на хромосоме 2. [8]
Зимогенная форма белка C — это витамин K -зависимый гликопротеин , циркулирующий в плазме крови . Его структура представляет собой двухцепочечный полипептид, состоящий из легкой цепи и тяжелой цепи, соединенных дисульфидной связью . [8] : 4673 Зимоген белка C активируется, когда он связывается с тромбином , другим белком, активно участвующим в свертывании крови, и активация белка C в значительной степени стимулируется наличием тромбомодулина и рецепторов эндотелиального белка C (EPCR). Из-за роли EPCR активированный белок C обнаруживается в основном вблизи эндотелиальных клеток (т. е. тех, которые составляют стенки кровеносных сосудов), и именно на эти клетки и лейкоциты (белые кровяные клетки) влияет APC. [7] : 34 [9] : 3162 Из-за решающей роли, которую играет протеин С в качестве антикоагулянта , люди с дефицитом протеина С или какой-либо формой резистентности к АПС страдают от значительного повышения риска образования опасных тромбов ( тромбоза ).
Исследования клинического использования рекомбинантной формы человеческого активированного протеина C (rhAPC), известного как Drotrecogin alfa-activated , под торговой маркой Xigris от Eli Lilly and Company , были окружены противоречиями. Eli Lilly провела агрессивную маркетинговую кампанию для продвижения его использования для людей с тяжелым сепсисом и септическим шоком и спонсировала Руководство по кампании Surviving Sepsis 2004 года . [10] Однако обзор Cochrane 2012 года показал, что его использование не может быть рекомендовано, поскольку оно не улучшает выживаемость и увеличивает риск кровотечения. [11] В октябре 2011 года Xigris был отозван с рынка Eli Lilly из-за более высокой смертности в исследовании среди взрослых. [12]
Антикоагулянтная роль протеина C в организме человека была впервые отмечена Сигерсом и др. в 1960 году, [13] которые дали протеину C его первоначальное название — аутопротромбин II-a . [5] : 6822 Протеин C был впервые выделен Йоханом Стенфло из плазмы крупного рогатого скота в 1976 году, и Стенфло определил, что это витамин К-зависимый белок . [14] Он назвал его протеином C, потому что это был третий белок («пик C»), который элюировался с ионообменного хроматографа на ДЭАЭ-сефарозе . В то время Сигерс искал факторы свертывания, зависимые от витамина K, необнаруживаемые с помощью анализов на свертываемость , которые измеряют глобальную функцию свертывания. Вскоре после этого Сигерс признал, что открытие Стенфло было идентичным его собственному. [5] : 6822 Активированный белок C был открыт позже в том же году, [15] а в 1977 году было впервые признано, что APC инактивирует фактор V a . [16] : 2382 [17] В 1980 году Вехар и Дэви обнаружили, что APC также инактивирует фактор VIII a , [18] и вскоре после этого белок S был признан Уокером в качестве кофактора . [19] В 1982 году семейное исследование Гриффина и др . впервые связало дефицит белка C с симптомами венозного тромбоза . [20] Гомозиготный дефицит белка C и последующие серьезные последствия для здоровья были описаны в 1984 году несколькими учеными. [21] : 1214 Клонирование кДНК белка C было впервые выполнено в 1984 году Бекманном и др. , которые создали карту гена, ответственного за выработку белка C в печени. [22] В 1987 году был проведен основополагающий эксперимент (Тейлор и др. ), в ходе которого было продемонстрировано, что активированный белок С предотвращает коагулопатию и смерть у бабуинов , которым вводили летальные концентрации E. coli . [16] : 2382 [23]
В 1993 году наследственная резистентность к АПК была обнаружена Дальбеком и соавторами и связана с семейной тромбофилией . [24] В 1994 году была отмечена относительно распространенная генетическая мутация, которая приводит к образованию фактора V Лейдена (Бертина и соавторы ). [25] Два года спустя АПК без Gla-домена была визуализирована с разрешением 2,8 ангстрем . [α] [5] Начиная с клинического испытания PROWESS 2001 года, [26] было признано, что многие симптомы сепсиса могут быть улучшены путем инфузии АПК, а показатели смертности у пациентов с сепсисом могут быть значительно снижены. [9] : 3161, 6 Ближе к концу того же года Дротрекогин альфа (активированный) , рекомбинантный человеческий активированный белок С, стал первым препаратом, одобренным FDA США для лечения тяжелого сепсиса . [27] В 2002 году журнал Science опубликовал статью, в которой впервые было показано, что белок C активирует рецептор-1, активируемый протеазой (PAR-1), и этот процесс объясняет модуляцию иммунной системы этим белком. [16] : 2382 [28]
Биологические инструкции для синтеза белка C у людей закодированы в гене, официально названном «белок C (инактиватор факторов свертывания Va и VIIIa)». Символ гена, одобренный Комитетом по номенклатуре генов HUGO, — «PROC» от « белок C » . Он расположен на второй хромосоме (2q13-q14) и состоит из девяти экзонов . [8] [16] : 2383 Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий белок C, имеет длину приблизительно 11 000 оснований. [8] : 4675
Человеческий белок C является витамин К-зависимым гликопротеином, структурно похожим на другие витамин К-зависимые белки, влияющие на свертываемость крови, [29] такие как протромбин , фактор VII , фактор IX и фактор X. [ 21] : 1215 Синтез белка C происходит в печени и начинается с одноцепочечной молекулы-предшественника: 32-аминокислотного N-концевого сигнального пептида, предшествующего пропептиду . [30] : S11 Белок C образуется при удалении дипептида Lys 198 и Arg 199 ; это вызывает превращение в гетеродимер с N -связанными углеводами на каждой цепи. Белок имеет одну легкую цепь (21 кДа ) и одну тяжелую цепь (41 кДа), соединенные дисульфидной связью между Cys 183 и Cys 319 .
Неактивный белок C состоит из 419 аминокислот в нескольких доменах : [16] : 2383 один домен Gla (остатки 43–88); спиральный ароматический сегмент (89–96); два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF) (97–132 и 136–176); активационный пептид (200–211); и домен сериновой протеазы, подобный трипсину (212–450). Легкая цепь содержит домены Gla- и EGF-подобные и ароматический сегмент. Тяжелая цепь содержит домен протеазы и активационный пептид. Именно в этой форме 85–90% белка C циркулирует в плазме в качестве зимогена , ожидая активации. [5] : 6822 Оставшийся зимоген белка C состоит из слегка модифицированных форм белка. Активация фермента происходит, когда молекула тромбина отщепляет активационный пептид от N-конца тяжелой цепи. [8] : 4673 [30] : S11 Активный центр содержит каталитическую триаду, типичную для сериновых протеаз (His 253 , Asp 299 и Ser 402 ). [16] : 2833
Домен Gla особенно полезен для связывания с отрицательно заряженными фосфолипидами для антикоагуляции и с EPCR для цитопротекции . Один конкретный экзосайт усиливает способность белка C эффективно инактивировать фактор V a . Другой необходим для взаимодействия с тромбомодулином. [16] : 2833
Посттрансляционные модификации . Человеческий белок C имеет по крайней мере пять типов посттрансляционных модификаций : (1) гамма- карбоксилирование первых девяти остатков глутаминовой кислоты в последовательности белка. Это событие модификации выполняется витамин К-зависимой микросомальной карбоксилазой. Полный набор Gla необходим для придания полной активности белку C. (2) бета- гидроксилирование Asp71 в одном из двух EGF-подобных доменов для получения эритро-L-бета-гидрокси-аспартата (bHA). Модификация необходима для функциональной активности, как было продемонстрировано путем мутации Asp71 в Glu. (3) N-связанное гликозилирование в трех возможных сайтах гликозилирования. Сообщается, что плазменный человеческий белок C на 23% состоит из углеводов по весу. (4) Образование дисульфида. (5) Множественные протеолитические расщепления полипептидного остова для удаления 18-аминокислотного сигнального пептида , 24-аминокислотного пропептида, а затем расщепления по аминокислотам 155-156 и 157-158 для получения двухцепочечной структуры циркулирующего зимогена. [31]
Активация белка C в значительной степени стимулируется тромбомодулином и рецептором эндотелиального белка C (EPCR), последний из которых в основном обнаруживается на эндотелиальных клетках (клетках внутри кровеносных сосудов). Присутствие тромбомодулина ускоряет активацию на несколько порядков, [7] : 34 , а EPCR ускоряет активацию в 20 раз. Если любой из этих двух белков отсутствует в образцах мышей , мышь умирает от чрезмерного свертывания крови, еще находясь в эмбриональном состоянии. [32] : 1983 [33] : 43335 На эндотелии APC играет важную роль в регуляции свертывания крови, воспаления и гибели клеток ( апоптоз ). [34] : 28S Из-за ускоряющего эффекта тромбомодулина на активацию белка C, можно сказать, что белок активируется не тромбином, а комплексом тромбин-тромбомодулин (или даже тромбин-тромбомодулин-EPCR). [16] : 2381 После перехода в активную форму APC может оставаться или не оставаться связанным с EPCR, к которому он имеет примерно такое же сродство, как и белок зимоген. [9] : 3162
Протеин C в форме зимогена присутствует в нормальной плазме крови взрослого человека в концентрациях от 65 до 135 МЕ / дл . Активированный белок C обнаруживается на уровнях примерно в 2000 раз ниже этого. [9] : 3161 Легкий дефицит белка C соответствует уровням в плазме выше 20 МЕ/дл, но ниже нормального диапазона. Умеренно тяжелый дефицит описывает концентрацию в крови от 1 до 20 МЕ/дл; тяжелый дефицит дает уровни белка C ниже 1 МЕ/дл или неопределяемые. Уровни белка C у здорового доношенного ребенка в среднем составляют 40 МЕ/дл. Концентрация белка C увеличивается до шести месяцев, когда средний уровень составляет 60 МЕ/дл; уровень остается низким в детстве, пока не достигнет уровня взрослого после подросткового возраста . [21] : 1216 Период полураспада активированного белка C составляет около 15 минут. [5] : 6823
Пути белка C представляют собой специфические химические реакции, которые контролируют уровень экспрессии APC и его активность в организме. [7] : 34 Белок C является плейотропным , с двумя основными классами функций: антикоагуляцией и цитопротекцией (его прямым воздействием на клетки). Какую функцию выполняет белок C, зависит от того, остается ли APC связанным с EPCR после его активации; антикоагулянтные эффекты APC возникают, когда он этого не делает. В этом случае белок C функционирует как антикоагулянт, необратимо протеолитически инактивируя Фактор V a и Фактор VIII a , превращая их в Фактор V i и Фактор VIII i соответственно. Когда активированный белок C все еще связан с EPCR, он выполняет свои цитопротекторные эффекты, действуя на эффекторный субстрат PAR-1, активируемый протеазой рецептор-1 . В некоторой степени антикоагулянтные свойства APC не зависят от его цитопротекторных свойств, в том смысле, что экспрессия одного пути не зависит от существования другого. [9] : 3162 [34] : 26S
Активность белка C может быть подавлена путем снижения количества либо доступного тромбомодулина, либо EPCR. Это может быть сделано воспалительными цитокинами , такими как интерлейкин-1β (IL-1β) и фактор некроза опухоли-α (TNF-α). Активированные лейкоциты высвобождают эти воспалительные медиаторы во время воспаления, ингибируя создание как тромбомодулина, так и EPCR, и вызывая их отщепление от эндотелиальной поверхности. Оба эти действия подавляют активацию белка C. Сам тромбин также может оказывать влияние на уровни EPCR. Кроме того, белки, высвобождаемые из клеток, могут препятствовать активации белка C, например, эозинофил , что может объяснить тромбоз при гиперэозинофильной болезни сердца. [β] Белок C может быть повышен тромбоцитарным фактором 4 . Предполагается, что этот цитокин улучшает активацию белка C, образуя электростатический мостик между доменом Gla белка C и доменом гликозаминогликана (GAG) тромбомодулина, снижая константу Михаэлиса (KM ) для их реакции. [16] : 2386 [34] : 29S Кроме того, белок C ингибируется ингибитором белка C. [ 35] : 369
Белок C является основным компонентом антикоагуляции в организме человека. Он действует как зимоген сериновой протеазы : APC протеолизирует пептидные связи в активированном факторе V и факторе VIII (фактор V a и фактор VIII a ), и одна из аминокислот в связи - серин . [16] : 2381 Эти белки, которые инактивирует APC, фактор V a и фактор VIII a , являются высокопрокоагулянтными кофакторами в образовании тромбина , который является важнейшим элементом свертывания крови; вместе они являются частью протромбиназного комплекса . [34] : 26S Кофакторы в инактивации фактора V a и фактора VIII a включают белок S , фактор V, липопротеин высокой плотности , анионные фосфолипиды и гликосфинголипиды . [9] : 3161
Фактор V a связывается с протромбином и фактором X a , увеличивая скорость, с которой вырабатывается тромбин, на четыре порядка (10 000x). Таким образом, инактивация фактора V a практически останавливает выработку тромбина. Фактор VIII, с другой стороны, является кофактором в выработке активированного фактора X, который, в свою очередь, превращает протромбин в тромбин. Фактор VIII a усиливает активацию фактора X примерно в 200 000 раз. Из-за своей важности для свертывания крови фактор VIII также известен как антигемофильный фактор, а дефицит фактора VIII вызывает гемофилию A . [16] : 2382, 3
APC инактивирует фактор V a , производя три расщепления (Arg 306 , Arg 506 , Arg 679 ). Расщепления как в Arg 306 , так и в Arg 506 уменьшают притяжение молекулы к фактору X a , и хотя первый из этих участков расщепляется медленно, он совершенно необходим для функционирования фактора V. Белок S способствует этому процессу, катализируя протеолиз в Arg 306 , в котором домен A2 фактора V отделяется от остальной части белка. [36] Белок S также связывается с фактором X a , ингибируя последний от уменьшения инактивации фактора V a APC . [16] : 2386
Инактивация фактора VIII a не так хорошо изучена. Период полураспада фактора VIII a составляет всего около двух минут, если только фактор IX a не присутствует для его стабилизации. Некоторые подвергают сомнению значимость инактивации фактора VIII a посредством APC , и неизвестно, в какой степени фактор V и белок S являются кофакторами в его протеолизе. Известно, что APC действует на фактор VIII a, расщепляя его в двух местах, Arg 336 и Arg 562 , любого из которых достаточно, чтобы отключить фактор VIII a и преобразовать его в фактор VIII i . [16] : 2387
Когда APC связан с EPCR, он выполняет ряд важных цитопротекторных (т.е. защищающих клетки) функций, большинство из которых, как известно, требуют EPCR и PAR-1. Они включают регулирование экспрессии генов, противовоспалительные эффекты, антиапоптотические эффекты и защиту функции эндотелиального барьера. [9] : 3162
Обработка клеток APC показывает, что его модуляция экспрессии генов эффективно контролирует основные пути воспалительного и апоптотического поведения. Существует около 20 генов, которые активируются протеином C, и 20 генов, которые активируются отрицательно: первые, как правило, являются противовоспалительными и антиапоптотическими путями, в то время как последние, как правило, являются провоспалительными и проапоптотическими. Механизмы APC для изменения профилей экспрессии генов не очень хорошо изучены, но считается, что они, по крайней мере, частично включают ингибирующее действие на активность факторов транскрипции . [9] : 3162, 4 Важные белки, которые активирует APC, включают Bcl-2 , eNOS и IAP . APC вызывает значительное снижение регуляции p53 и Bax . [16] : 2388
APC оказывает противовоспалительное действие на эндотелиальные клетки и лейкоциты . APC влияет на эндотелиальные клетки, ингибируя высвобождение воспалительных медиаторов и снижая регуляцию молекул сосудистой адгезии . Это снижает адгезию лейкоцитов и инфильтрацию в ткани, а также ограничивает повреждение подлежащей ткани. APC поддерживает функцию эндотелиального барьера и снижает хемотаксис . APC ингибирует высвобождение медиаторов воспалительной реакции в лейкоцитах, а также эндотелиальных клетках, снижая реакцию цитокинов и, возможно, уменьшая системную воспалительную реакцию, такую как наблюдаемая при сепсисе . Исследования как на крысах, так и на людях продемонстрировали, что APC уменьшает вызванное эндотоксином повреждение легких и воспаление. [9] : 3164
Ученые признают антиапоптотические эффекты активированного белка C, но неясны точные механизмы, посредством которых ингибируется апоптоз. Известно, что APC является нейропротектором . Антиапоптоз достигается за счет снижения активации каспазы 3 и каспазы 8 , улучшения соотношения Bax/Bcl-2 и снижения регуляции p53. [16] : 2388
Активированный протеин C также обеспечивает большую защиту функции эндотелиального барьера. Разрушение эндотелиального барьера и соответствующее увеличение эндотелиальной проницаемости связаны с отеком , гипотензией и воспалением, все проблемы сепсиса. APC защищает функцию эндотелиального барьера, вызывая активацию PAR-1-зависимой сфингозинкиназы-1 и повышая регуляцию сфингозин-1-фосфата сфингозинкиназой . [9] : 3165
Несколько исследований показали, что протеолитическая активность APC способствует наблюдаемым цитопротекторным свойствам APC, но варианты, которые протеолитически неактивны, также способны регулировать образование PAR-активаторов тромбина и фактора Xa и проявлять цитопротекторные свойства in vitro и in vivo. [37] [38]
Генетический дефицит белка C в его легкой форме, связанной с простой гетерозиготностью , вызывает значительно повышенный риск венозного тромбоза у взрослых. Если плод гомозиготен или сложней гетерозиготен по дефициту, может наблюдаться молниеносная пурпура , тяжелое диссеминированное внутрисосудистое свертывание и одновременная венозная тромбоэмболия в утробе матери; [21] : 1214 это очень тяжело и обычно смертельно. [39] : 211s Удаление гена белка C у мышей вызывает гибель плода примерно во время рождения. Плоды мышей без белка C сначала развиваются нормально, но затем испытывают сильное кровотечение, коагулопатию , отложение фибрина и некроз печени. [9] : 3161
Частота дефицита протеина C среди бессимптомных лиц составляет от 1 на 200 до 1 на 500. Напротив, существенные симптомы дефицита обнаруживаются у 1 из 20 000 лиц. Расовых или этнических предубеждений не обнаружено. [21] : 1215
Было обнаружено не менее 177 мутаций, вызывающих заболевания в этом гене. [40] Резистентность к активированному протеину C возникает, когда APC не может выполнять свои функции. Это заболевание имеет схожие симптомы с дефицитом протеина C. Наиболее распространенная мутация, приводящая к резистентности к активированному протеину C среди европеоидов, находится в месте расщепления в факторе V для APC. Там Arg 506 заменяется на Gln, производя фактор V Лейден . Эта мутация также называется R506Q. [16] : 2382 Мутация, приводящая к потере этого места расщепления, фактически останавливает APC от эффективной инактивации как фактора V a, так и фактора VIII a . Таким образом, кровь человека слишком легко свертывается, и он постоянно находится в группе повышенного риска тромбоза. [41] : 3 У лиц, гетерозиготных по мутации фактора V Лейден , риск венозного тромбоза в 5–7 раз выше, чем в общей популяции. У гомозиготных субъектов риск в 80 раз выше. [7] : 40 Эта мутация также является наиболее распространенным наследственным риском венозного тромбоза среди европеоидной расы . [16] : 2382
Около 5% резистентности к APC не связаны с вышеуказанной мутацией и фактором V Лейдена . Другие генетические мутации вызывают резистентность к APC, но ни одна из них не вызывает ее в такой степени, как фактор V Лейдена . Эти мутации включают различные другие версии фактора V, спонтанное образование аутоантител, нацеленных на фактор V, и дисфункцию любого из кофакторов APC. [16] : 2387 Кроме того, некоторые приобретенные состояния могут снижать эффективность APC в выполнении его антикоагулянтных функций. [7] : 33 Исследования показывают, что от 20% до 60% пациентов с тромбофилией страдают от той или иной формы резистентности к APC. [7] : 37
Варфариновый некроз — это приобретенный дефицит белка C из-за лечения варфарином , который является антагонистом витамина K и сам по себе антикоагулянтом. Однако лечение варфарином может вызывать парадоксальные поражения кожи, похожие на те, что наблюдаются при фульминантной пурпуре. Вариант этой реакции проявляется в виде венозной гангрены конечностей , когда варфарин используется для лечения тромбоза глубоких вен, связанного с раком. В этих ситуациях варфарин можно возобновить в низкой дозировке, чтобы гарантировать, что дефицит белка C не проявится до того, как будут подавлены факторы свертывания крови витамина K II, IX и X. [39] : 211s
Активированный белок C расщепляет гистоны Plasmodium falciparum , которые высвобождаются во время инфекции: расщепление этих гистонов устраняет их провоспалительные эффекты. [42]
В ноябре 2001 года Управление по контролю за продуктами и лекарствами одобрило препарат Дротрекогин альфа-активированный (DrotAA) для клинического лечения взрослых, страдающих тяжелым сепсисом и имеющих высокий риск смерти. [43] : 1332 Дротрекогин альфа-активированный представляет собой рекомбинантную форму человеческого активированного белка C (rhAPC). Он продается под названием Xigris компанией Eli Lilly and Company , [27] : 224
Дротрекогин альфа-активированный был предметом значительных споров, пока он был одобрен для клинического применения, поскольку было обнаружено, что он увеличивает кровотечение, а не снижает смертность. [44] В октябре 2011 года rhAPC (Xigris) был отозван с рынка компанией Eli Lilly из-за более высокой смертности в исследовании среди взрослых. [12] [44]
APC изучался как способ лечения повреждения легких после того, как исследования показали, что у пациентов с повреждением легких сниженные уровни APC в определенных частях легких коррелируют с худшими результатами. [9] : 3167, 8 APC также рассматривался для использования в улучшении результатов лечения пациентов в случаях ишемического инсульта , неотложной медицинской ситуации, при которой артериальная закупорка лишает область мозга кислорода, вызывая гибель тканей. Многообещающие исследования показывают, что APC можно сочетать с единственным в настоящее время одобренным лечением, тканевым активатором плазминогена (tPA), для защиты мозга от очень вредных побочных эффектов tPA , в дополнение к предотвращению гибели клеток из-за недостатка кислорода ( гипоксии ). [45] : 211 Клиническое использование APC также было предложено для улучшения результатов трансплантации островков поджелудочной железы при лечении диабета I типа . [16] : 2392
Цепротин был одобрен для медицинского применения в Европейском Союзе в июле 2001 года. [46] Цепротин показан при молниеносной пурпуре и некрозе кожи, вызванном кумарином, у людей с тяжелым врожденным дефицитом протеина С. [46]
