Митоген -активируемая протеинкиназа ( MAPK или MAP-киназа ) представляет собой тип протеинкиназы , специфичной к аминокислотам серину и треонину (т.е. серин/треонин-специфическая протеинкиназа ). МАРК участвуют в управлении клеточными реакциями на разнообразный набор стимулов, таких как митогены , осмотический стресс , тепловой шок и провоспалительные цитокины . Они регулируют функции клеток, включая пролиферацию , экспрессию генов , дифференцировку , митоз , выживание клеток и апоптоз . [1]
МАР-киназы обнаружены только у эукариот , но они довольно разнообразны и встречаются у всех животных, грибов и растений и даже у ряда одноклеточных эукариот. [ нужна цитата ]
МАРК относятся к группе киназ CMGC (CDK/MAPK/GSK3/CLK). Ближайшими родственниками МАРК являются циклинзависимые киназы (ЦДК). [2]
Первой открытой митоген-активируемой протеинкиназой была ERK1 ( MAPK3 ) у млекопитающих. Поскольку ERK1 и его близкий родственник ERK2 ( MAPK1 ) оба участвуют в передаче сигналов фактора роста, это семейство было названо «митоген-активируемым». С открытием других членов, даже из отдаленных организмов (например, растений), становится все более очевидным, что это название является неправильным, поскольку большинство МАРК на самом деле участвуют в реакции на потенциально вредные абиотические стрессовые стимулы (гиперосмос, окислительный стресс, повреждение ДНК, низкая осмолярность, инфекция и т. д.). Поскольку растения не могут «убежать» от стресса, наземные растения имеют самое большое количество генов MAPK на организм, когда - либо обнаруженное . Таким образом, роль киназ ERK1/2 млекопитающих как регуляторов клеточной пролиферации является не общей, а узкоспециализированной функцией.
Большинство MAPK имеют ряд общих характеристик, таких как активация, зависящая от двух событий фосфорилирования , трехуровневая архитектура путей и сходные сайты распознавания субстратов. Это «классические» MAP-киназы. Но есть также некоторые древние выбросы из группы, как показано выше, которые не имеют двойных сайтов фосфорилирования, образуют только двухуровневые пути и лишены функций, необходимых другим MAPK для связывания субстрата. Их обычно называют «атипичными» MAPK. [3] Пока неясно, образуют ли атипичные МАРК единую группу в отличие от классических. [ нужны разъяснения ]
Семейство киназ MAPK млекопитающих включает три подсемейства:
Как правило, ERK активируются факторами роста и митогенами , тогда как клеточные стрессы и воспалительные цитокины активируют JNK и p38. [4]
Митоген-активируемые протеинкиназы в своей базовой форме каталитически неактивны. Чтобы стать активными, им требуются (потенциально множественные) события фосфорилирования в их петлях активации. Это осуществляется специализированными ферментами группы протеинкиназ STE. Таким образом, динамика белка может вызвать конформационные изменения в структуре белка посредством аллостерии дальнего действия .
В случае классических MAP-киназ петля активации содержит характерный мотив TxY (треонин-x-тирозин) (TEY в ERK1 и ERK2 млекопитающих , TDY в ERK5 , TPY в JNK , TGY в киназах p38 ), который необходимо фосфорилировать на как остатки треонина , так и тирозина , чтобы зафиксировать киназный домен в каталитически компетентной конформации. In vivo и in vitro фосфорилирование тирозина часто предшествует фосфорилированию треонина, хотя фосфорилирование любого остатка может происходить в отсутствие другого. [ нужна цитата ]
Это тандемное фосфорилирование петли активации (которое, как предполагалось, было либо дистрибутивным, либо процессивным, в зависимости от клеточной среды) осуществляется членами семейства протеинкиназ Ste7, также известных как киназы MAP2 . Киназы MAP2, в свою очередь, также активируются путем фосфорилирования рядом различных вышестоящих серин-треониновых киназ ( киназы MAP3 ). Поскольку киназы MAP2 проявляют очень небольшую активность на субстратах, отличных от родственной им MAPK, классические пути MAPK образуют многоуровневые, но относительно линейные пути. Эти пути могут эффективно передавать стимулы от клеточной мембраны (где активируются многие MAP3K) в ядро (куда могут проникать только MAPK) или ко многим другим субклеточным мишеням. [ нужна цитата ]
По сравнению с трехуровневыми классическими путями MAPK, некоторые атипичные MAP-киназы, по-видимому, имеют более древнюю двухуровневую систему. Недавно было показано, что ERK3 (MAPK6) и ERK4 (MAPK4) непосредственно фосфорилируются и, таким образом, активируются киназами PAK (родственными другим киназам MAP3). [6] В отличие от классических MAP-киназ, эти атипичные MAPK требуют фосфорилирования только одного остатка в их активационных петлях. Детали активации NLK и ERK7 (MAPK15) остаются неизвестными.
Инактивация МАРК осуществляется рядом фосфатаз . Очень консервативное семейство специализированных фосфатаз представляет собой так называемые MAP-киназные фосфатазы (MKP), подгруппу фосфатаз с двойной специфичностью (DUSP). [7] Как следует из названия, эти ферменты способны гидролизовать фосфат как из остатков фосфотирозина, так и из остатков фосфотреонина. Поскольку удаление любой фосфатной группы значительно снижает активность MAPK, по существу устраняя передачу сигналов, некоторые тирозинфосфатазы также участвуют в инактивации MAP-киназ (например, фосфатазы HePTP , STEP и PTPRR у млекопитающих).
Как упоминалось выше, MAPK обычно образуют многоуровневые пути, получая входные данные на несколько уровней выше фактической киназы MAP. В отличие от относительно простого, зависимого от фосфорилирования механизма активации MAPK и MAP2K , регуляция MAP3K чрезвычайно сложна. Многие из наиболее известных MAP3K , такие как c-Raf , MEKK4 или MLK3, требуют нескольких шагов для активации. Обычно это ферменты, контролируемые аллостерически, которые жестко удерживаются в неактивном состоянии с помощью множества механизмов. Первый шаг на пути к их активации состоит в снятии их аутоингибирования меньшим лигандом (таким как Ras для c-Raf , GADD45 для MEKK4 [10] или Cdc42 для MLK3 [11] ). Обычно (но не всегда) это происходит на клеточной мембране, где связано большинство их активаторов (обратите внимание, что небольшие G-белки конститутивно связаны с мембраной из-за пренилирования ). За этим шагом следует гомо- и гетеродимеризация их теперь доступных киназных доменов. Недавно установленные сложные структуры показали, что димеры образуются в такой ориентации, которая оставляет свободными обе их области, связывающиеся с субстратом. [12] Важно отметить, что это событие димеризации также заставляет киназные домены MAP3 принимать частично активную конформацию. Полная активность достигается только после того, как эти димеры трансфосфорилируют друг друга в своих петлях активации. Последний этап также может быть достигнут или ему могут способствовать вспомогательные протеинкиназы (киназы MAP4, члены семейства Ste20). Как только киназа MAP3 становится полностью активной, она может фосфорилировать свои субстратные киназы MAP2, которые, в свою очередь, фосфорилируют свои субстраты киназы MAP. [ нужна цитата ]
Путь ERK1/2 млекопитающих, вероятно, является наиболее изученной системой MAPK. Наиболее важными вышестоящими активаторами этого пути являются белки Raf ( A-Raf , B-Raf или c-Raf ), ключевые медиаторы ответа на факторы роста ( EGF , FGF , PDGF и т. д.); но другие MAP3K, такие как c-Mos и Tpl2/Cot, также могут играть ту же роль. Все эти ферменты фосфорилируют и, таким образом, активируют киназы MKK1 и/или MKK2 , которые являются высокоспецифичными активаторами ERK1 и ERK2 . Последние фосфорилируют ряд субстратов, важных для пролиферации клеток , развития клеточного цикла , деления и дифференцировки клеток ( киназы RSK , фактор транскрипции Elk-1 и др.).
В отличие от относительно хорошо изолированного пути ERK1/2 , киназы p38 и JNK млекопитающих имеют большинство своих активаторов, общих на уровне MAP3K ( MEKK1 , MEKK4 , ASK1 , TAK1 , MLK3 , TAOK1 и т. д.). Кроме того, некоторые ферменты MAP2K могут активировать как p38, так и JNK ( MKK4 ), тогда как другие более специфичны либо для JNK ( MKK7 ), либо для p38 ( MKK3 и MKK6 ). Из-за этих взаимоблокировок существует очень мало стимулов, которые могут вызвать активацию JNK без одновременной активации p38 или обратного действия. [13] Оба сигнальных пути JNK и p38 реагируют на стрессовые стимулы, такие как цитокины , ультрафиолетовое облучение , тепловой шок и осмотический шок , и участвуют в адаптации к стрессу , апоптозу или дифференцировке клеток . JNK имеют ряд специализированных субстратов, которые только они могут фосфорилировать ( c-Jun , NFAT4 и т. д.), в то время как p38 также имеют некоторые уникальные мишени (например, киназы MAPKAP MK2 и MK3 ), что обеспечивает необходимость обоих для ответа на стрессовые раздражители.
ERK5 является частью довольно хорошо разделенного пути у млекопитающих. Его единственный специфический вышестоящий активатор MKK5 включается в ответ на киназы MAP3 MEKK2 и MEKK3 . Специфичность этих взаимодействий обеспечивается уникальной архитектурой MKK5 и MEKK2/3, оба из которых содержат N-концевые домены PB1, что обеспечивает прямую гетеродимеризацию друг с другом. [14] Домен PB1 MKK5 также способствует взаимодействию ERK5-MKK5: он обеспечивает специальный интерфейс (в дополнение к D-мотиву, обнаруженному в MKK5), через который MKK5 может специфически распознавать свой субстрат ERK5. [15] Хотя детали на молекулярном уровне плохо известны, MEKK2 и MEKK3 реагируют на определенные сигналы развития, направленные на прямое образование эндотелия и сердечный морфогенез . Хотя инактивация ERK5 также участвует в развитии мозга, эмбриональная летальность инактивации ERK5 из-за сердечных аномалий подчеркивает ее центральную роль в васкулогенезе млекопитающих . [16] Примечательно, что условный нокаут ERK5 у взрослых животных также является летальным из-за широко распространенного нарушения эндотелиальных барьеров . [17] Считается, что мутации в вышестоящих компонентах пути ERK5 (комплекс CCM) лежат в основе кавернозных мальформаций головного мозга у людей.
МАПК-пути грибов также хорошо изучены. У дрожжей Fus3 MAPK отвечает за остановку клеточного цикла и спаривание в ответ на стимуляцию феромонами. Феромон альфа-фактор воспринимается семью трансмембранными рецепторами . Рекрутирование и активация компонентов пути Fus3 строго зависят от активации гетеротримерного G-белка . Путь спаривания MAPK состоит из трех уровней (Ste11-Ste7-Fus3), но киназы MAP2 и MAP3 являются общими с другим путем, Kss1 или путем нитевидного роста. Хотя Fus3 и Kss1 являются близкородственными киназами типа ERK, дрожжевые клетки все же могут активировать их по отдельности с помощью каркасного белка Ste5, который избирательно рекрутируется G-белками пути спаривания. Хитрость в том, что Ste5 может связываться с Fus3 и «разблокировать» его для Ste7 в качестве субстрата в третичном комплексе, в то время как он не делает того же для Kss1, оставляя путь нитчатого роста активироваться только в отсутствие рекрутирования Ste5. [18]
Грибы также имеют путь, напоминающий передачу сигналов JNK/p38 млекопитающих. Это путь Hog1: активируется высокой осмолярностью (у Saccharomyces cerevisiae ) или рядом других абиотических стрессов (у Schizosaccharomyces pombe ). Киназа MAP2 этого пути называется Pbs2 (родственна MKK3/4/6/7 млекопитающих), выделенными киназами MAP3, участвующими в активации, являются Ssk2 и Ssk22. Система у S. cerevisiae активируется сложным осмосенсорным модулем, состоящим из белков Sho1 и Sln1, но пока неясно, как другие стимулы могут вызвать активацию Hog1. Дрожжи также демонстрируют ряд других путей MAPK, не имеющих близких гомологов у животных, таких как путь целостности клеточной стенки (Mpk1/Slt2) или путь споруляции (Smk1). [19]
Несмотря на большое количество генов МАРК, пути МАРК у высших растений изучены меньше, чем у животных или грибов. Хотя их передача сигналов кажется очень сложной, киназы MPK3, MPK4 и MPK6 Arabidopsis thaliana являются ключевыми медиаторами ответов на осмотический шок , окислительный стресс , реакцию на холод и участвуют в антипатогенных реакциях. [20] [21] [22] Асаи и др. Модель иммунитета, опосредованного MAPK 2002 года, передает эффекторный сигнал распознавания от FLS2 ⇨ MEKK1 ⇨ MKK4 или MKK5 ⇨ MPK3 и MPK6 ⇨ WRKY22 или WRKY29. [22] Однако работа Месароша и др. 2006 г. и Суарес-Родригес и др. 2007 год дает другие указания по этому пути, и вполне возможно, что это параллельные пути, действующие одновременно. [22] Они также участвуют в морфогенезе , поскольку мутанты MPK4 демонстрируют тяжелую карликовость . [23]
Членов семейства МАРК можно найти в каждом изученном на данный момент эукариотическом организме. В частности, как классические, так и атипичные MAP-киназы можно проследить до истоков радиации основных групп эукариот. Наземные растения содержат четыре группы классических МАРК (МАРК-А, МАРК-В, МАРК-С и МАРК-D), которые участвуют в реакции на множество абиотических стрессов. [25] Однако ни одну из этих групп нельзя напрямую приравнять к кластерам классических МАРК, обнаруженным у опистоконтов (грибов и животных). В последнем случае основные подгруппы классических МАРК образуют ERK/Fus3-подобную ветвь (которая у многоклеточных животных подразделяется на подгруппы ERK1/2 и ERK5) и p38/Hog1-подобные киназы (которые также разделяются на подгруппы ERK1/2 и ERK5). подгруппы p38 и JNK у многоклеточных животных). [26] Кроме того, как у грибов, так и у животных существует несколько MAPK, происхождение которых менее ясно, либо из-за высокой дивергенции (например, NLK), либо из-за того, что они, возможно, являются ранним ответвлением всего семейства MAPK (ERK3, ERK4, ЭРК7). У позвоночных из-за дупликации целого генома близнеца после разделения головохордовых и позвоночных [27] в каждой группе имеется несколько паралогов. Таким образом, ERK1 и ERK2 соответствуют свернутой киназе дрозофилы , а JNK1, JNK2 и JNK3 ортологичны корзине генов дрозофилы . Хотя среди группы р38 р38 альфа и бета явно являются паралогичными парами, как и р38 гамма и дельта у позвоночных, время разделения оснований менее ясно, учитывая, что многие многоклеточные животные уже обладают множественными гомологами р38 (есть три р38- киназы типа у дрозофилы , Mpk2 ( p38a ), p38b и p38c ). Один белок ERK5, по-видимому, выполняет очень специализированную роль (необходимую для развития сосудов у позвоночных), где бы он ни присутствовал. Эта линия была удалена у протостом вместе с компонентами ее верхнего пути (MEKK2/3, MKK5), хотя они явно присутствуют у книдарий , губок и даже у некоторых одноклеточных организмов (например, хоанофлагелляты Monosiga brevicollis ), тесно связанных с происхождением многоклеточные животные. [28]
Раскол между классическими и некоторыми атипичными MAP-киназами произошел довольно рано. Об этом свидетельствуют не только высокие различия между существующими генами, но и недавние открытия атипичных МАРК у примитивных базальных эукариот. Секвенирование генома лямблий лямблий выявило наличие двух генов МАРК, один из которых похож на уже известные МАРК млекопитающих (ERK, p38s и т. д.), а другой имеет сходство с белком ERK7 млекопитающих. [29] Ситуация аналогична у многоклеточной амебы Dictyostelium discoideum , где белок ddERK1, по-видимому, является классической МАРК, тогда как ddERK2 более близко напоминает наши белки ERK7 и ERK3/4. [30] Атипичные МАРК также можно обнаружить у высших растений, хотя они малоизучены. Как и в случае с млекопитающими, большинство аспектов атипичных МАРК не охарактеризованы из-за отсутствия исследований в этой области.
Что типично для группы киназ CMGC, каталитический сайт MAP-киназ имеет очень рыхлую консенсусную последовательность для субстратов . Как и всем их родственникам, им требуется только, чтобы за целевыми аминокислотами серин / треонин следовала небольшая аминокислота, предпочтительно пролин («пролин-направленные киназы»). Но поскольку сайты SP/TP чрезвычайно распространены во всех белках, появились дополнительные механизмы распознавания субстратов, обеспечивающие точность передачи сигналов. [31] В отличие от своих ближайших родственников, циклин-зависимых киназ (CDK), где субстраты распознаются субъединицей циклина , MAPK связываются со своими субстратами через вспомогательные области связывания на своих киназных доменах. Наиболее важная такая область состоит из гидрофобной стыковочной канавки и отрицательно заряженной CD-области. Вместе они распознают так называемые стыковочные мотивы MAPK или D-мотивы (также называемые мотивом взаимодействия киназы / KIM). D-мотивы по существу состоят из одной или двух положительно заряженных аминокислот, за которыми следуют чередующиеся гидрофобные остатки (в основном лейцины), обычно на 10–50 аминокислот выше сайта фосфорилирования. [32] Многие из известных субстратов МАРК содержат такие D-мотивы, которые могут не только связываться, но и обеспечивать специфическое узнавание определенными МАРК. D-мотивы не ограничиваются субстратами: киназы MAP2 также содержат на своих N-концах такие мотивы , которые абсолютно необходимы для взаимодействия MAP2K-MAPK и активации MAPK. [33] Аналогичным образом, как MAP-киназные фосфатазы с двойной специфичностью, так и MAP-специфичные тирозинфосфатазы связываются с MAP-киназами через один и тот же сайт стыковки. [34] [35] D-мотивы можно даже обнаружить в некоторых регуляторах и каркасах пути MAPK (например, в белках JIP млекопитающих).
Существуют также другие, менее хорошо изученные сайты связывания субстрата. Один из таких сайтов (сайт DEF) образован петлей активации (в активной конформации) и специфичной для MAP-киназы вставкой под ней. Этот сайт может содержать пептиды с консенсусной последовательностью FxFP, обычно расположенные ниже сайта фосфорилирования. [36] Обратите внимание, что последний сайт можно найти только в белках, которым необходимо избирательно распознавать активные MAP-киназы, поэтому они почти исключительно обнаруживаются в субстратах. Различные мотивы могут взаимодействовать друг с другом, как в семействе транскрипционных факторов Elk, которые обладают как D-мотивом, так и мотивом FxFP. Присутствие мотива FxFP в каркасном белке KSR1 также делает его субстратом ERK1/2, обеспечивая механизм отрицательной обратной связи для установки правильной силы активации ERK1/2.
С момента открытия Ste5 в дрожжах ученые пытались обнаружить аналогичные элементы неферментативного каркасного пути у млекопитающих. Действительно, существует ряд белков, участвующих в передаче сигналов ERK, которые могут связываться с несколькими элементами пути: MP1 связывает как MKK1/2, так и ERK1/2, KSR1 и KSR2 могут связывать B-Raf или c-Raf, MKK1/2 и ЭРК1/2. Аналогичные белки были также обнаружены для пути JNK: было показано, что семейства белков JIP1 / JIP2 и JIP3 /JIP4 связывают MLK, MKK7 и любую киназу JNK. К сожалению, в отличие от дрожжевого Ste5, механизмы, с помощью которых они регулируют активацию МАРК, изучены значительно меньше. Хотя Ste5 на самом деле образует тройной комплекс с Ste7 и Fus3, чтобы способствовать фосфорилированию последнего, известные каркасные белки млекопитающих, по-видимому, действуют по совершенно другим механизмам. Например, KSR1 и KSR2 на самом деле являются киназами MAP3 и связаны с белками Raf. [37] Хотя сами по себе KSR демонстрируют незначительную киназную активность MAP3, белки KSR все же могут участвовать в активации Raf-киназ, образуя с ними боковые гетеродимеры, обеспечивая аллостерическую пару для включения каждого фермента. [38] JIPs, с другой стороны, по-видимому, являются транспортными белками, ответственными за обогащение сигнальных компонентов MAPK в определенных компартментах поляризованных клеток. [39] В этом контексте JNK-зависимое фосфорилирование JIP1 (и, возможно, JIP2) дает сигнал JIP высвободить связанные с JIP и неактивные компоненты восходящего пути, тем самым создавая сильную локальную петлю положительной обратной связи. [40] Этот сложный механизм связывает кинезин-зависимый транспорт с локальной активацией JNK не только у млекопитающих, но и у плодовой мушки Drosophila melanogaster . [41]
Поскольку сигнальный путь ERK участвует как в физиологической, так и в патологической пролиферации клеток, вполне естественно, что ингибиторы ERK1/2 представляют собой желательный класс противоопухолевых средств. Действительно, многие из протоонкогенных «драйверных» мутаций связаны с передачей сигналов ERK1/2, например, с конститутивно активными (мутантными) рецепторными тирозинкиназами , белками Ras или Raf . Хотя ингибиторы MKK1/2 или ERK1/2 для клинического применения не разработаны, ингибиторы киназ, которые также ингибируют киназы Raf (например, сорафениб ), являются успешными противоопухолевыми средствами против различных типов рака. [42] [43] Ингибитор MEK кобиметиниб исследовался на доклинических моделях рака легких в сочетании с ингибированием пути PI3K , где два препарата приводят к синергетическому ответу. [44] [45]
JNK-киназы участвуют в развитии резистентности к инсулину у людей с ожирением [46] , а также в эксайтотоксичности нейротрансмиттеров после ишемических состояний. Ингибирование JNK1 снижает резистентность к инсулину на некоторых моделях животных. Мыши, которые были генетически модифицированы без функционального гена JNK3 — основной изоформы мозга — демонстрируют повышенную толерантность к ишемии и восстановление после инсульта. [47] Хотя низкомолекулярные ингибиторы JNK находятся в стадии разработки, ни один из них пока не доказал свою эффективность в испытаниях на людях. Ингибитор JNK на основе пептида (AM-111, ретро-обратный пептид D-мотива из JIP1, ранее известный как XG-102) также находится в стадии клинической разработки для лечения нейросенсорной тугоухости . [48]
Когда-то считалось, что p38 является идеальной мишенью для противовоспалительных препаратов. Тем не менее, неудача более дюжины химически различных соединений на клинической фазе позволяет предположить, что киназы р38 могут быть плохими терапевтическими мишенями при аутоиммунных заболеваниях . Было обнаружено, что многие из этих соединений в различной степени гепатотоксичны , а толерантность к противовоспалительному эффекту развивается в течение нескольких недель. [49] Альтернативный подход заключается в оценке потенциала нацеливания на вышестоящие MAPK, такие как ASK1 . [50] Исследования на животных моделях воспалительного артрита дали многообещающие результаты, и недавно было обнаружено, что ASK1 уникален среди MAPK, поскольку он индуцируется воспалительными цитокинами, такими как TNF-α . [50]